Ervaringsafhankelijke hermodellering van juveniele reukbare sensorische neuronen Synaptische connectiviteit van de hersenen in een kritieke periode in het vroege leven
Summary
We beschrijven hier methoden voor het induceren en analyseren van olfactorische ervaring-afhankelijke remodellering van synaptische glomeruli van de antennekwab in de juveniele hersenen van Drosophila .
Abstract
Olfactorische sensorische ervaring in het vroege leven induceert dramatische synaptische glomeruli-remodellering in de juveniele hersenen van Drosophila , die ervaringsdosisafhankelijk, tijdelijk beperkt en alleen tijdelijk omkeerbaar is in een korte, goed gedefinieerde kritieke periode. De directionaliteit van de remodellering van de synaptische connectiviteit van het hersencircuit wordt bepaald door de specifieke geurstof die inwerkt op de respondentreceptorklasse van olfactorische sensorische neuronen. Over het algemeen brengt elke neuronklasse slechts één geurreceptor tot expressie en innerveert een enkele olfactorische synaptische glomerulus. In het genetische model van Drosophila is het volledige scala aan olfactorische glomeruli nauwkeurig in kaart gebracht op basis van de respons op geurstoffen en gedragsoutput. Ethylbutyraat (EB) geurstof activeert Or42a-receptorneuronen die de VM7-glomerulus innerveren. Tijdens de kritieke periode in het vroege leven stimuleert EB-ervaring dosisafhankelijke synapseliminatie in de Or42a olfactorische sensorische neuronen. Getimede perioden van gedoseerde blootstelling aan EB-geurant maken onderzoek mogelijk naar ervaringsafhankelijk snoeien van circuitconnectiviteit in juveniele hersenen. Confocale microscopiebeeldvorming van synaptische glomeruli van de antennekwab wordt gedaan met Or42a-receptorgestuurde transgene markers die kwantificering van het synapsaantal en het innervatievolume bieden. De geavanceerde genetische toolkit van Drosophila maakt de systematische ontleding mogelijk van de cellulaire en moleculaire mechanismen die de hermodellering van het hersencircuit mediëren.
Introduction
De hermodellering van juveniele hersencircuits tijdens het vroege leven vertegenwoordigt de laatste kans voor grootschalige synaptische connectiviteitsveranderingen om overeen te komen met de zeer variabele, onvoorspelbare omgeving waarin een dier wordt geboren. Als de meest voorkomende groep dieren delen insecten dit evolutionair geconserveerde, fundamentele mechanisme voor het hermodelleren van kritieke perioden1. Kritieke perioden beginnen met het begin van sensorische input, vertonen omkeerbare circuitveranderingen om de connectiviteit te optimaliseren en sluiten vervolgens wanneer stabilisatiekrachten zich verzetten tegen verdere hermodellering2. Insecten zijn vooral afhankelijk van olfactorische sensorische informatie en vertonen een goed gedefinieerde olfactorische kritieke periode. Drosophila biedt een uitstekend genetisch model om deze ervaringsafhankelijke kritieke periode in het juveniele brein te onderzoeken. Geurervaring gedurende de eerste paar dagen na de eclosie zorgt voor opvallende veranderingen in de circuitconnectiviteit in individueel geïdentificeerde synaptische glomeruli 3,4. De richting van de verbouwing is afhankelijk van de specifieke input geurbeleving. Sommige geurstoffen veroorzaken een toename van het synaptische glomerulusvolume gedurende een paar dagen na eclosie (dpe)3,5,6,7, terwijl andere geurstoffen een snelle eliminatie van synapsen veroorzaken tijdens de kritieke periode van 0-2 dpe, wat resulteert in een verminderd innervatievolume 8,9,10. In het bijzonder stimuleert de ervaring met ethylbutyraat (EB) geurstof dosisafhankelijke synaptische snoei van de Or42a-olfactorische receptorneuronen alleen tijdens deze kritieke periode in het vroege leven8. De eliminatie van de synaps is volledig omkeerbaar door de input van EB-geurstoffen binnen de kritieke periode te moduleren, maar wordt permanent na het sluiten van de kritieke periode. Deze olfactorische ervaringsafhankelijke synaptische snoei biedt een waardevol experimenteel systeem om de tijdelijk beperkte mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan de hermodellering van het juveniele hersencircuit.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat wordt gebruikt om EB-ervaringsafhankelijk synaptisch snoeien van Or42a-receptor olfactorische sensorische neuronen tijdens de kritieke periode in het vroege leven te induceren en te analyseren. We laten zien dat Or42a synaptische terminals in de antennekwab VM7 glomerulus specifiek kunnen worden gelabeld door transgeen een membraan-tethered mCD8::GFP-marker aan te sturen, ofwel direct gefuseerd met de Or42a-promotor (Or42a-mCD8::GFP)11 of met behulp van het Gal4/UAS binaire expressiesysteem (Or42a-Gal4 die UAS-mCD8::GFP aanstuurt)12. Individuele Or42a-neuronsynapsen kunnen op dezelfde manier worden gelabeld met behulp van gerichte transgene expressie van presynaptische actieve zonemarkers die zijn gefuseerd met een reeks fluorescerende tags (bijv. Bruchpilot::RFP)8 of een elektronendicht signaal voor ultrastructurele synapsanalyses (bijv. miniSOG-mCherry)8. Or42a synaptische terminals kunnen worden afgebeeld met een combinatie van laserscanning confocale microscopie en transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat Or42a synaptisch glomeruli snoeien EB-dosisafhankelijk is, schaalbaar naar de concentratie van de getimede geurervaring. Het percentage EB-odorant opgelost in minerale olie dat als vehikel wordt gebruikt, kan worden gevarieerd, evenals de getimede duur van de blootstelling aan geurstof bij dieren in een ontwikkelingsfase. Ten slotte tonen we de methoden die worden gebruikt om de mate van synaptische glomeruli-snoei te analyseren door de intensiteit en het volume van de VM7-innervatiefluorescentie te meten. Het aantal synapsen kan ook worden gekwantificeerd door gelabelde synaptische puncta te tellen en door synaptische ultrastructuurparameters te meten met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie8. Over het algemeen is het hier getoonde protocol een krachtige benadering die de systematische dissectie mogelijk maakt van zowel cellulaire als moleculaire mechanismen die het trimmen van de synaptische connectiviteit van het olfactorische circuit van Drosophila mediëren tijdens een juveniele kritieke periode. De algemene opstelling voor blootstelling aan geur die in deze studie wordt beschreven, is in eerdere onderzoeken gebruikt met behulp van andere geuren en het testen van andere glomeruli 3,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol voor blootstelling aan geurstof en beeldvorming van de hersenen kan worden gebruikt om ervaringsafhankelijke olfactorische sensorische neuron synaptische glomeruli-snoei tijdens een kritieke periode in het vroege leven op betrouwbare wijze te induceren en te kwantificeren. Eerdere studies die dit behandelingsparadigma gebruikten om de remodellering van het olfactorische circuit te onderzoeken, begonnen met blootstelling aan geurstof op de2e dag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken de andere leden van het Broadie Lab voor hun waardevolle inbreng. Figuren werden gemaakt met behulp van BioRender.com. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute of Health MH084989 en NS131557 aan K.B.
Materials
| For Odor Exposure | |||
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-110 | |
| Ethyl butyrate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M3516 | |
| Odor chambers | Glasslock | ||
| Paint brushes | Winsor & Newton | Series 233 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Wire mesh | Scienceware | 378460000 | |
| Brain Dissection | |||
| Ethanol, 190 proof | Decon Labs | 2801 | Diluted to 70% |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumont #5 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscope Sciences | 157-8 | Diluted to 4% |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100B | |
| Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | Diluted to 1x |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Sylgard | Electron Microscope Sciences | 24236-10 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Brain Immunocytochemistry | |||
| 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| 546 goat anti-rat | Invitrogen | A11081 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9647 | |
| Chicken anti-GFP | Abcam | 13970 | |
| Coverslips | Avantor | 48366-067 | 25 x 25 mm |
| Double-sided tape | Scotch | 34-8724-5228-8 | |
| Fluoromount-G | Electron Microscope Sciences | 17984-25 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 75 x 25 mm |
| Nail polish | Sally Hansen | 109 | Xtreme Wear, Invisible |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Rat anti-CadN | Developmental Studies Hybridoma Bank | AB_528121 | |
| Confocal/Analysis | |||
| Any computer/laptop | |||
| Confocal microscope | Carl Zeiss | Zeiss 510 META | |
| Fiji software | Fiji | Version 2.14.0/1.54f |
References
- English, S., Barreaux, A. M. The evolution of sensitive periods in development: insights from insects. Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).
- Fabian, B., Sachse, S. Experience-dependent plasticity in the olfactory system of Drosophila melanogaster and other insects. Fron Cell Neurosci. 17, 1130091 (2023).
- Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
- Devaud, J. M., Acebes, A., Ramaswami, M., Ferrús, A. Structural and functional changes in the olfactory pathway of adult Drosophila take place at a critical age. J Neurobiol. 56 (1), 13-23 (2003).
- Sachse, S., et al. Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit. Neuron. 56 (5), 838-850 (2007).
- Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Pro Natl Acad Sci U S A. 108 (36), E646-E654 (2011).
- Kidd, S., Struhl, G., Lieber, T. Notch is required in adult Drosophila sensory neurons for morphological and functional plasticity of the olfactory circuit. PLoS Genet. 11 (5), e1005244 (2015).
- Golovin, R. M., Vest, J., Vita, D. J., Broadie, K. Activity-dependent remodeling of Drosophila olfactory sensory neuron brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 39 (16), 2995-3012 (2019).
- Golovin, R. M., Vest, J., Broadie, K. Neuron-specific FMRP roles in experience-dependent remodeling of olfactory brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 41 (6), 1218-1241 (2021).
- Chodankar, A., Sadanandappa, M. K., Raghavan, K. V., Ramaswami, M. Glomerulus-selective regulation of a critical period for interneuron plasticity in the drosophila antennal lobe. J Neurosci. 40 (29), 5549-5560 (2020).
- Stephan, D., et al. Drosophila Psidin regulates olfactory neuron number and axon targeting through two distinct molecular mechanisms. J Neurosci. 32 (46), 16080 (2012).
- Doll, C. A., Broadie, K. Activity-dependent FMRP requirements in development of the neural circuitry of learning and memory. Development. 142 (7), 1346-1356 (2015).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. J Vis Exp. (118), e55128 (2016).
- Okumura, M., Kato, T., Miura, M., Chihara, T. Hierarchical axon targeting of Drosophila olfactory receptor neurons specified by the proneural transcription factors Atonal and Amos. Genes to Cells. 21 (1), 53-64 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Vita, D. J., Meier, C. J., Broadie, K. Neuronal fragile X mental retardation protein activates glial insulin receptor mediated PDF-Tri neuron developmental clearance. Nat Comm. 12 (1), 1160 (2021).
- Gugel, Z. V., Maurais, E. G., Hong, E. J. Chronic exposure to odors at naturally occurring concentrations triggers limited plasticity in early stages of Drosophila olfactory processing. eLife. 12, 85443 (2023).
