Remodelação dependente da experiência da conectividade sináptica do neurônio sensorial olfativo do cérebro juvenil em um período crítico no início da vida

A remodelação dos circuitos cerebrais juvenis durante o início da vida representa a última chance de mudanças de conectividade sináptica em larga escala para corresponder ao ambiente altamente variável e imprevisível em que um animal nasce. Como o grupo mais abundante de animais, os insetos compartilham esse mecanismo de remodelação do período crítico fundamental e evolutivamente conservado¹. Os períodos críticos abrem com o início da entrada sensorial, exibem mudanças reversíveis no circuito para otimizar a conectividade e, em seguida, fecham quando as forças de estabilização resistem a uma remodelação adicional². Os insetos são particularmente dependentes de informações sensoriais olfativas e mostram um período crítico olfativo bem definido. Drosophila fornece um excelente modelo genético para investigar esse período crítico dependente da experiência no cérebro juvenil. A experiência com odor durante os primeiros dias após a eclosão impulsiona mudanças marcantes na conectividade do circuito em glomérulos sinápticos identificados individualmente ^3,4. A direção da remodelação depende da experiência específica do odorante de entrada. Alguns odores causam um aumento no volume do glomérulo sináptico por alguns dias após a eclosão (dpe) ^{3 , 5 , 6 , 7} , enquanto outros odores causam uma rápida eliminação das sinapses durante o período crítico de 0-2 dpe, resultando em diminuição do volume de inervação^{8 , 9 , 10}. Especificamente, a experiência com odor de butirato de etila (EB) impulsiona a poda sináptica dependente da dose dos neurônios do receptor olfativo Or42a apenas durante esse período crítico de início de vida⁸. A eliminação da sinapse é completamente reversível pela modulação da entrada de odor EB dentro do período crítico, mas torna-se permanente após o encerramento do período crítico. Essa poda sináptica dependente da experiência olfativa fornece um sistema experimental valioso para elucidar os mecanismos temporalmente restritos subjacentes à remodelação do circuito cerebral juvenil.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado usado para induzir e analisar a poda sináptica dependente da experiência EB de neurônios sensoriais olfativos do receptor Or42a durante o período crítico do início da vida. Mostramos que os terminais sinápticos Or42a no glomérulo VM7 do lobo antenal podem ser especificamente marcados por transgenicamente conduzindo um marcador mCD8::GFP amarrado à membrana, diretamente fundido ao promotor Or42a (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ ou usando o sistema de expressão binária Gal4/UAS (Or42a-Gal4 conduzindo UAS-mCD8::GFP)¹². As sinapses individuais do neurônio Or42a podem ser marcadas de forma semelhante usando a expressão transgênica direcionada de marcadores de zona ativa pré-sináptica fundidos a uma série de tags fluorescentes (por exemplo, Bruchpilot :: RFP) ⁸ ou um sinal denso em elétrons para análises de sinapses ultraestruturais (por exemplo, miniSOG-mCherry) ⁸. Os terminais sinápticos Or42a podem ser visualizados com uma combinação de microscopia confocal de varredura a laser e microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos que a poda dos glomérulos sinápticos de Or42a é dependente da dose de EB, escalando para a concentração da experiência de odor cronometrada. A porcentagem de odor EB dissolvido no óleo mineral usado como veículo pode ser variada, assim como a duração cronometrada da exposição ao odor em animais em estágio de desenvolvimento. Finalmente, mostramos os métodos usados para analisar a extensão da poda dos glomérulos sinápticos medindo a intensidade e o volume da fluorescência da inervação VM7. O número de sinapses também pode ser quantificado contando os pontos sinápticos marcados e medindo os parâmetros da ultraestrutura sináptica usando microscopia eletrônica de transmissão⁸. No geral, o protocolo mostrado aqui é uma abordagem poderosa que permite a dissecação sistemática dos mecanismos celulares e moleculares que medeiam a poda da conectividade sináptica do circuito olfativo da Drosophila durante um período crítico juvenil. A configuração geral de exposição ao odor descrita neste estudo foi utilizada em estudos anteriores usando outros odores e testando outros glomérulos ^3,7.