Зависимое от опыта ремоделирование синаптической связи обонятельных сенсорных нейронов ювенильного мозга в раннем критическом периоде жизни
Summary
Мы описываем методы индуцирования и анализа зависимого от обоняния ремоделирования синаптических клубочков антенной доли в ювенильном мозге дрозофилы .
Abstract
Обонятельный сенсорный опыт в раннем возрасте вызывает драматическое ремоделирование синаптических клубочков в ювенильном мозге дрозофилы , которое эмпирически дозозависимо, ограничено во времени и временно обратимо только в короткий, четко определенный критический период. Направленность ремоделирования синаптических связей мозговой цепи определяется специфическим запахом, действующим на класс рецепторов-респондентов обонятельных сенсорных нейронов. В целом, каждый класс нейронов экспрессирует только один рецептор запаха и иннервирует один обонятельный синаптический клубок. В генетической модели дрозофилы полный массив обонятельных клубочков был точно отображен по реакции на запах и поведенческому выходу. Одорант этилбутирата (EB) активирует нейроны рецептора Or42a, иннервирующие клубочек VM7. В ранний критический период жизни опыт БЭ приводит к дозозависимой элиминации синапсов в обонятельных сенсорных нейронах Or42a. Временные периоды воздействия дозированного одоранта БЭ позволяют исследовать зависимое от опыта отсечение цепных связей в ювенильном мозге. Конфокальная микроскопия синаптических клубочков антенной доли проводится с помощью трансгенных маркеров, управляемых рецепторами Or42a, которые обеспечивают количественную оценку количества синапсов и объема иннервации. Сложный генетический инструментарий дрозофилы позволяет проводить систематическое препарирование клеточных и молекулярных механизмов, опосредующих ремоделирование мозговых цепей.
Introduction
Ремоделирование ювенильных мозговых цепей в раннем возрасте представляет собой последний шанс для крупномасштабных изменений синаптических связей, чтобы соответствовать очень изменчивой, непредсказуемой среде, в которой рождается животное. Будучи наиболее многочисленной группой животных, насекомые разделяют этот эволюционно консервативный, основополагающий механизм ремоделирования критического периода1. Критические периоды открываются с началом сенсорного ввода, демонстрируют обратимые изменения контуров для оптимизации связности, а затем закрываются, когда силы стабилизации сопротивляются дальнейшемуремоделированию. Насекомые особенно зависимы от обонятельной сенсорной информации и демонстрируют четко определенный обонятельный критический период. Дрозофила представляет собой прекрасную генетическую модель для исследования этого зависимого от опыта критического периода в ювенильном мозге. Воздействие запаха в течение первых нескольких дней после эклозии приводит к изменению цепных связей в индивидуально идентифицированных синаптических клубочках 3,4. Направление ремоделирования зависит от конкретного входного одоранта. Некоторые одоранты вызывают увеличение объема синаптического клубочка в течение нескольких дней после эклозии (dpe)3,5,6,7, в то время как другие одоранты вызывают быструю элиминацию синапсов в течение критического периода 0-2 dpe, что приводит к снижению объема иннервации 8,9,10. В частности, опыт запаха этилбутирата (БЭ) приводит к дозозависимому синаптическому обрезанию нейронов обонятельных рецепторов Or42a только в этот критическийпериод раннего возраста8. Элиминация синапсов полностью обратима за счет модуляции поступления одоранта EB в течение критического периода, но становится постоянной после закрытия критического периода. Эта зависимая от обонятельного опыта синаптическая обрезка обеспечивает ценную экспериментальную систему для выяснения ограниченных во времени механизмов, лежащих в основе ремоделирования ювенильных цепей мозга.
Здесь мы представляем подробный протокол, используемый для индуцирования и анализа зависимого от опыта БЭ синаптического обрезания обонятельных сенсорных нейронов рецептора Or42a в течение критического периода раннего возраста. Мы показываем, что синаптические окончания Or42a в клубочке VM7 антенной доли могут быть специфически помечены путем трансгенного управления мембранно-привязанным маркером mCD8::GFP, либо непосредственно слитым с промотором Or42a (Or42a-mCD8::GFP)11, либо с использованием бинарной системы экспрессии Gal4/UAS (Or42a-Gal4 driving UAS-mCD8::GFP)12. Отдельные синапсы нейронов Or42a могут быть аналогичным образом помечены с использованием целевой трансгенной экспрессии маркеров пресинаптической активной зоны, объединенных в массив флуоресцентных меток (например, Bruchpilot::RFP)8, или электронно-плотного сигнала для ультраструктурного анализа синапсов (например, miniSOG-mCherry)8. Синаптические терминали Or42a могут быть визуализированы с помощью комбинации лазерно-сканирующей конфокальной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии. Мы показываем, что обрезка синаптических клубочков Or42a зависит от дозы БЭ, масштабируясь до концентрации временного воздействия одоранта. Процентное содержание одоранта EB, растворенного в минеральном масле, используемом в качестве транспортного средства, может варьироваться, как и продолжительность воздействия одоранта на животных на стадии развития. Наконец, мы показываем методы, используемые для анализа степени обрезки синаптических клубочков путем измерения интенсивности и объема иннервации VM7. Число синапсов также может быть количественно определено путем подсчета меченых синаптических точек и измерения параметров ультраструктуры синапсов с помощью просвечивающей электронной микроскопии8. В целом, показанный здесь протокол представляет собой мощный подход, который позволяет систематически препарировать как клеточные, так и молекулярные механизмы, опосредующие обрезку синаптической связи обонятельной цепи дрозофилы в ювенильный критический период. Описанная в этом исследовании общая установка воздействия запаха была использована в предыдущих исследованиях с использованием других запахов и анализом других клубочков 3,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный здесь протокол воздействия одорантов и визуализации мозга может быть использован для надежного индуцирования и количественной оценки зависимой от опыта обрезки синаптических клубочков обонятельных сенсорных нейронов в ранний критический период жи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим других членов Broadie Lab за их ценный вклад. Фигуры создавались с использованием BioRender.com. Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения MH084989 и NS131557 К.Б.
Materials
| For Odor Exposure | |||
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-110 | |
| Ethyl butyrate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M3516 | |
| Odor chambers | Glasslock | ||
| Paint brushes | Winsor & Newton | Series 233 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Wire mesh | Scienceware | 378460000 | |
| Brain Dissection | |||
| Ethanol, 190 proof | Decon Labs | 2801 | Diluted to 70% |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumont #5 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscope Sciences | 157-8 | Diluted to 4% |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100B | |
| Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | Diluted to 1x |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Sylgard | Electron Microscope Sciences | 24236-10 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Brain Immunocytochemistry | |||
| 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| 546 goat anti-rat | Invitrogen | A11081 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9647 | |
| Chicken anti-GFP | Abcam | 13970 | |
| Coverslips | Avantor | 48366-067 | 25 x 25 mm |
| Double-sided tape | Scotch | 34-8724-5228-8 | |
| Fluoromount-G | Electron Microscope Sciences | 17984-25 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 75 x 25 mm |
| Nail polish | Sally Hansen | 109 | Xtreme Wear, Invisible |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Rat anti-CadN | Developmental Studies Hybridoma Bank | AB_528121 | |
| Confocal/Analysis | |||
| Any computer/laptop | |||
| Confocal microscope | Carl Zeiss | Zeiss 510 META | |
| Fiji software | Fiji | Version 2.14.0/1.54f |
References
- English, S., Barreaux, A. M. The evolution of sensitive periods in development: insights from insects. Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).
- Fabian, B., Sachse, S. Experience-dependent plasticity in the olfactory system of Drosophila melanogaster and other insects. Fron Cell Neurosci. 17, 1130091 (2023).
- Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
- Devaud, J. M., Acebes, A., Ramaswami, M., Ferrús, A. Structural and functional changes in the olfactory pathway of adult Drosophila take place at a critical age. J Neurobiol. 56 (1), 13-23 (2003).
- Sachse, S., et al. Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit. Neuron. 56 (5), 838-850 (2007).
- Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Pro Natl Acad Sci U S A. 108 (36), E646-E654 (2011).
- Kidd, S., Struhl, G., Lieber, T. Notch is required in adult Drosophila sensory neurons for morphological and functional plasticity of the olfactory circuit. PLoS Genet. 11 (5), e1005244 (2015).
- Golovin, R. M., Vest, J., Vita, D. J., Broadie, K. Activity-dependent remodeling of Drosophila olfactory sensory neuron brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 39 (16), 2995-3012 (2019).
- Golovin, R. M., Vest, J., Broadie, K. Neuron-specific FMRP roles in experience-dependent remodeling of olfactory brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 41 (6), 1218-1241 (2021).
- Chodankar, A., Sadanandappa, M. K., Raghavan, K. V., Ramaswami, M. Glomerulus-selective regulation of a critical period for interneuron plasticity in the drosophila antennal lobe. J Neurosci. 40 (29), 5549-5560 (2020).
- Stephan, D., et al. Drosophila Psidin regulates olfactory neuron number and axon targeting through two distinct molecular mechanisms. J Neurosci. 32 (46), 16080 (2012).
- Doll, C. A., Broadie, K. Activity-dependent FMRP requirements in development of the neural circuitry of learning and memory. Development. 142 (7), 1346-1356 (2015).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. J Vis Exp. (118), e55128 (2016).
- Okumura, M., Kato, T., Miura, M., Chihara, T. Hierarchical axon targeting of Drosophila olfactory receptor neurons specified by the proneural transcription factors Atonal and Amos. Genes to Cells. 21 (1), 53-64 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Vita, D. J., Meier, C. J., Broadie, K. Neuronal fragile X mental retardation protein activates glial insulin receptor mediated PDF-Tri neuron developmental clearance. Nat Comm. 12 (1), 1160 (2021).
- Gugel, Z. V., Maurais, E. G., Hong, E. J. Chronic exposure to odors at naturally occurring concentrations triggers limited plasticity in early stages of Drosophila olfactory processing. eLife. 12, 85443 (2023).
