若年脳嗅覚神経細胞シナプス結合性の経験依存的リモデリング
Summary
ここでは、 ショウジョウバエ の幼若脳における触角葉シナプス糸球体の嗅覚経験依存的なリモデリングを誘導し、解析する方法について述べる。
Abstract
幼少期の嗅覚体験は、 ショウジョウバエ の幼若脳に劇的なシナプス糸球体リモデリングを誘発しますが、これは経験的に用量依存的で、時間的に制限され、短く明確に定義された臨界期にのみ一時的に可逆的です。脳回路シナプス接続リモデリングの方向性は、嗅覚ニューロンの応答性受容体クラスに作用する特定の匂い物質によって決定されます。一般に、各ニューロンクラスは単一の匂い受容体のみを発現し、単一の嗅覚シナプス糸球体を神経支配します。 ショウジョウバエ の遺伝子モデルでは、嗅覚糸球体の全配列が、匂い物質の応答性と行動出力によって正確にマッピングされています。酪酸エチル(EB)臭気剤は、VM7糸球体を神経支配するOr42a受容体ニューロンを活性化します。幼少期の重要な時期には、EBの経験はOr42a嗅覚ニューロンの用量依存的なシナプス除去を促進します。投与されたEB臭気物質曝露の期間を計ると、若年脳における経験依存的な回路接続性の剪定の調査が可能になります。触角葉シナプス糸球体の共焦点顕微鏡イメージングは、シナプス数と神経支配体積の定量化を提供するOr42a受容体駆動型トランスジェニックマーカーを使用して行われます。洗練された ショウジョウバエ の遺伝子ツールキットは、脳回路のリモデリングを媒介する細胞および分子メカニズムの体系的な解剖を可能にします。
Introduction
幼少期の幼若脳回路のリモデリングは、動物が生まれる高度に変化し、予測不可能な環境に合わせて大規模なシナプス結合性を変更する最後のチャンスです。昆虫は、最も豊富な動物群として、この進化的に保存された基本的な臨界期のリモデリングメカニズムを共有しています1。臨界期は、感覚入力の開始とともに開き、接続性を最適化するために可逆的な回路変化を示し、安定化力がさらなる改造に抵抗すると閉じます2。昆虫は特に嗅覚情報に依存しており、明確に定義された嗅覚臨界期を示します。ショウジョウバエは、若年期の脳におけるこの経験依存性の臨界期を調査するための優れた遺伝モデルを提供します。脱皮後の最初の数日間の匂い物質の経験は、個々に同定されたシナプス糸球体3,4の顕著な回路接続性の変化を引き起こします。リモデリングの方向は、特定の入力臭気体験によって異なります。一部の匂い物質は、閉塞後数日間(dpe)3,5,6,7のシナプス糸球体の体積の増加を引き起こしますが、他の匂い物質は、0-2 dpeの臨界期にシナプスの急速な排泄を引き起こし、神経支配の体積の減少をもたらします8,9,10.具体的には、酪酸エチル(EB)の匂い体験は、この初期の重要な時期にのみ、Or42a嗅覚受容体ニューロンの用量依存的なシナプス刈り込みを促進します8。シナプスの除去は、臨界期内にEB臭物質の入力を調節することにより完全に可逆的ですが、臨界期の終了後に永続的になります。この嗅覚経験依存的なシナプス刈り込みは、若年脳回路リモデリングの根底にある時間制限メカニズムを解明するための貴重な実験システムを提供します。
ここでは、初期の臨界期にOr42a受容体嗅覚ニューロンのEB経験依存性シナプス刈り込みを誘導および分析するために使用される詳細なプロトコルを紹介します。我々は、触角葉VM7糸球体におけるOr42aシナプス終末が、膜つながれたmCD8::GFPマーカーをトランスジェネニック的に駆動することによって特異的に標識できることを示し、これは、Or42aプロモーター(Or42a-mCD8::GFP)11に直接融合するか、またはGal4/UASバイナリ発現システム(Or42a-Gal4 driving UAS-mCD8::GFP)12を使用する。個々のOr42aニューロンシナプスは、蛍光タグの配列に融合したシナプス前活性ゾーンマーカーの標的トランスジェニック発現(例えば、Bruchpilot::RFP)8または超微細構造シナプス解析のための電子密度シグナル(例えば、miniSOG-mCherry)8を用いて、同様に標識することができる。Or42aシナプス終末は、レーザー走査型共焦点顕微鏡と透過型電子顕微鏡を組み合わせてイメージングできます。Or42aシナプス糸球体の剪定はEBの用量依存的であり、時限臭気体験の濃度にスケーリングすることを示しています。ビヒクルとして使用される鉱物油に溶解するEB臭気物質の割合は、発生段階の動物における臭気物質曝露の時間時間と同様に、さまざまです。最後に、VM7神経支配蛍光の強度と体積を測定することにより、シナプス糸球体の剪定の程度を分析するために使用される方法を示します。シナプス数は、標識されたシナプス点をカウントし、透過型電子顕微鏡8を用いてシナプス超微細構造パラメータを測定することによっても定量化することができる。全体として、ここに示すプロトコルは、若年臨界期にショウジョウバエの嗅覚回路シナプス接続の剪定を媒介する細胞および分子メカニズムの両方の体系的な解剖を可能にする強力なアプローチです。この研究で説明した一般的な臭気曝露の設定は、他の臭気を使用した以前の研究で利用され、他の糸球体3,7を分析しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する匂い物質曝露と脳イメージングプロトコルは、幼少期の重要な時期に経験に依存する嗅覚ニューロンのシナプス糸球体の剪定を確実に誘導し、定量化するために使用できます。この治療パラダイムを利用して嗅覚回路のリモデリングを探求する以前の研究では、排泄3,4,5の2日目…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
貴重なご意見をいただいた他のBroadie Labメンバーに感謝いたします。フィギュアは BioRender.com を使用して作成しました。この研究は、国立衛生研究所の助成金MH084989およびK.B.へのNS131557によって支援されました。
Materials
| For Odor Exposure | |||
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-110 | |
| Ethyl butyrate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M3516 | |
| Odor chambers | Glasslock | ||
| Paint brushes | Winsor & Newton | Series 233 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Wire mesh | Scienceware | 378460000 | |
| Brain Dissection | |||
| Ethanol, 190 proof | Decon Labs | 2801 | Diluted to 70% |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumont #5 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscope Sciences | 157-8 | Diluted to 4% |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100B | |
| Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | Diluted to 1x |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Sylgard | Electron Microscope Sciences | 24236-10 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Brain Immunocytochemistry | |||
| 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| 546 goat anti-rat | Invitrogen | A11081 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9647 | |
| Chicken anti-GFP | Abcam | 13970 | |
| Coverslips | Avantor | 48366-067 | 25 x 25 mm |
| Double-sided tape | Scotch | 34-8724-5228-8 | |
| Fluoromount-G | Electron Microscope Sciences | 17984-25 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 75 x 25 mm |
| Nail polish | Sally Hansen | 109 | Xtreme Wear, Invisible |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Rat anti-CadN | Developmental Studies Hybridoma Bank | AB_528121 | |
| Confocal/Analysis | |||
| Any computer/laptop | |||
| Confocal microscope | Carl Zeiss | Zeiss 510 META | |
| Fiji software | Fiji | Version 2.14.0/1.54f |
References
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