Erfahrungsabhängiger Umbau der synaptischen Konnektivität von olfaktorischen sensorischen Neuronen im juvenilen Gehirn in einer kritischen Phase im frühen Leben

Der Umbau der Schaltkreise des juvenilen Gehirns während des frühen Lebens stellt die letzte Chance für großflächige Veränderungen der synaptischen Konnektivität dar, um der hochgradig variablen, unvorhersehbaren Umgebung, in die ein Tier geboren wird, gerecht zu werden. Als die am häufigsten vorkommende Gruppe von Tieren teilen Insekten diesen evolutionär konservierten, grundlegenden Mechanismus des Umbaus in der kritischen Periode¹. Kritische Perioden beginnen mit dem Einsetzen des sensorischen Inputs, weisen reversible Schaltkreisänderungen auf, um die Konnektivität zu optimieren, und schließen sich dann, wenn die Stabilisierungskräfte einer weiteren Umgestaltung widerstehen². Insekten sind besonders auf olfaktorische sensorische Informationen angewiesen und weisen eine gut definierte olfaktorische kritische Periode auf. Drosophila bietet ein hervorragendes genetisches Modell, um diese erfahrungsabhängige kritische Phase im juvenilen Gehirn zu untersuchen. Die Geruchserfahrung in den ersten Tagen nach der Eklosion führt zu auffälligen Veränderungen der Schaltkreiskonnektivität in individuell identifizierten synaptischen Glomeruli ^3,4. Die Richtung des Umbaus hängt von der spezifischen Geruchserfahrung des Eingangs ab. Einige Geruchsstoffe verursachen eine Zunahme des synaptischen Glomerulusvolumens für einige Tage nach der Eklosion (dpe)3,5,6,7, während andere Geruchsstoffe eine schnelle Eliminierung von Synapsen während der kritischen Periode von 0-2 dpe verursachen, was zu einer verminderten Innervationsvolumina führt ^8,9,10. Insbesondere führt die Erfahrung mit Ethylbutyrat (EB)-Odorierstoffen zu einer dosisabhängigen synaptischen Beschneidung der Or42a-Geruchsrezeptor-Neuronen nur während dieser kritischen Phase im frühen Leben⁸. Die Synapseneliminierung ist durch Modulation des EB-Geruchseintrags innerhalb der kritischen Periode vollständig reversibel, wird aber nach Abschluss der kritischen Periode dauerhaft. Diese von der olfaktorischen Erfahrung abhängige synaptische Beschneidung stellt ein wertvolles experimentelles System dar, um die zeitlich begrenzten Mechanismen aufzuklären, die dem Umbau der juvenilen Gehirnschaltkreise zugrunde liegen.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das zur Induktion und Analyse des EB-erfahrungsabhängigen synaptischen Pruning von olfaktorischen sensorischen Neuronen des Or42a-Rezeptors während der kritischen Phase im frühen Leben verwendet wird. Wir zeigen, dass synaptische Or42a-Terminals im Antennenlappen VM7-Glomerulus spezifisch markiert werden können, indem ein membrangebundener mCD8::GFP-Marker transgen gesteuert wird, der entweder direkt mit dem Or42a-Promotor fusioniert ist (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ oder das binäre Gal4/UAS-Expressionssystem verwendet (Or42a-Gal4 treibt UAS-mCD8::GFP an)¹². Einzelne Synapsen von Or42a-Neuronen können auf ähnliche Weise markiert werden, indem präsynaptische aktive Zonenmarker gezielt transgenisiert werden, die mit einem Array von Fluoreszenz-Tags (z. B. Bruchpilot::RFP)⁸ oder einem elektronendichten Signal für ultrastrukturelle Synapsenanalysen (z. B. miniSOG-mCherry)⁸ fusioniert sind. Die synaptischen Terminals von Or42a können mit einer Kombination aus konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet werden. Wir zeigen, dass die Beschneidung der synaptischen Glomeruli von Or42a EB-abhängig ist und mit der Konzentration des zeitlich festgelegten Geruchserlebnisses skaliert wird. Der prozentuale Anteil des in Mineralöl, das als Vehikel verwendet wird, gelösten EB-Odorstoffs kann variiert werden, ebenso wie die zeitlich festgelegte Dauer der Odorstoffexposition bei Tieren im Entwicklungsstadium. Schließlich zeigen wir die Methoden, mit denen das Ausmaß der synaptischen Glomeruli-Beschneidung durch Messung der Intensität und des Volumens der Innervationsfluoreszenz VM7 analysiert wird. Die Synapsenzahl kann auch durch Zählen markierter synaptischer Punkte und durch Messung synaptischer Ultrastrukturparameter mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie⁸ quantifiziert werden. Insgesamt ist das hier gezeigte Protokoll ein leistungsfähiger Ansatz, der die systematische Dissektion sowohl zellulärer als auch molekularer Mechanismen ermöglicht, die den olfaktorischen Konnektivitätszyklus von Drosophila während einer juvenilen kritischen Phase vermitteln. Das in dieser Studie beschriebene allgemeine Geruchsexpositions-Setup wurde in früheren Studien mit anderen Gerüchen und der Bestimmung anderer Glomeruli verwendet ^3,7.