Remodelación dependiente de la experiencia de la conectividad sináptica de las neuronas sensoriales olfativas del cerebro juvenil en un período crítico de la vida temprana
Summary
Describimos aquí los métodos para inducir y analizar la remodelación dependiente de la experiencia olfativa de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal en el cerebro juvenil de Drosophila .
Abstract
La experiencia sensorial olfativa temprana induce una dramática remodelación de los glomérulos sinápticos en el cerebro juvenil de Drosophila , que depende de la dosis de la experiencia, está restringida temporalmente y es transitoriamente reversible solo en un período crítico corto y bien definido. La direccionalidad de la remodelación de la conectividad sináptica de los circuitos cerebrales está determinada por el odorante específico que actúa sobre la clase de receptores respondientes de las neuronas sensoriales olfativas. En general, cada clase de neurona expresa un solo receptor odorizante e inerva un solo glomérulo sináptico olfativo. En el modelo genético de Drosophila , la gama completa de glomérulos olfativos se ha mapeado con precisión mediante la capacidad de respuesta del odorante y la producción conductual. El odorante de butirato de etilo (EB) activa las neuronas receptoras Or42a que inervan el glomérulo VM7. Durante el período crítico de los primeros años de vida, la experiencia de EB impulsa la eliminación de sinapsis dependiente de la dosis en las neuronas sensoriales olfativas Or42a. Los períodos cronometrados de exposición al odorante EB dosificado permiten investigar la poda de la conectividad del circuito dependiente de la experiencia en el cerebro juvenil. La microscopía confocal de los glomérulos sinápticos del lóbulo antenal se realiza con marcadores transgénicos impulsados por el receptor Or42a que proporcionan cuantificación del número de sinapsis y el volumen de inervación. El sofisticado conjunto de herramientas genéticas de Drosophila permite la disección sistemática de los mecanismos celulares y moleculares que median la remodelación de los circuitos cerebrales.
Introduction
La remodelación de los circuitos cerebrales juveniles durante los primeros años de vida representa la última oportunidad para que los cambios en la conectividad sináptica a gran escala coincidan con el entorno altamente variable e impredecible en el que nace un animal. Como el grupo más abundante de animales, los insectos comparteneste mecanismo de remodelación del período crítico fundamental y conservado evolutivamente. Los períodos críticos se abren con el inicio de la entrada sensorial, exhiben cambios de circuito reversibles para optimizar la conectividad y luego se cierran cuando las fuerzas de estabilización se resisten a una mayor remodelación2. Los insectos dependen particularmente de la información sensorial olfativa y muestran un período crítico olfativo bien definido. Drosophila proporciona un excelente modelo genético para investigar este período crítico dependiente de la experiencia en el cerebro juvenil. La experiencia odorífera durante los primeros días después de la eclosión provoca cambios sorprendentes en la conectividad del circuito en los glomérulos sinápticos identificados individualmente 3,4. La dirección de la remodelación depende de la experiencia específica del odorante de entrada. Algunos odorantes causan un aumento en el volumen del glomérulo sináptico durante un par de días después de la eclosión (dpe)3,5,6,7, mientras que otros odorantes causan una rápida eliminación de sinapsis durante el período crítico de 0-2 dpe, lo que resulta en una disminución del volumen de inervación 8,9,10. Específicamente, la experiencia odorífera del butirato de etilo (EB) impulsa la poda sináptica dependiente de la dosis de las neuronas receptoras olfativas Or42a solo durante este período crítico de vida temprana8. La eliminación de sinapsis es completamente reversible mediante la modulación de la entrada de odorante EB dentro del período crítico, pero se vuelve permanente después del cierre del período crítico. Esta poda sináptica dependiente de la experiencia olfativa proporciona un valioso sistema experimental para dilucidar los mecanismos temporalmente restringidos que subyacen a la remodelación de los circuitos cerebrales juveniles.
Aquí, presentamos un protocolo detallado utilizado para inducir y analizar la poda sináptica dependiente de la experiencia EB de las neuronas sensoriales olfativas del receptor Or42a durante el período crítico de la vida temprana. Demostramos que los terminales sinápticos de Or42a en el glomérulo del lóbulo antenal VM7 pueden marcarse específicamente mediante la conducción transgénica de un marcador mCD8::GFP unido a la membrana, ya sea fusionado directamente con el promotor de Or42a (Or42a-mCD8::GFP)11 o utilizando el sistema de expresión binaria Gal4/UAS (Or42a-Gal4 impulsando UAS-mCD8::GFP)12. Las sinapsis individuales de las neuronas Or42a pueden marcarse de manera similar utilizando la expresión transgénica dirigida de marcadores de zona activa presinápticos fusionados con una matriz de etiquetas fluorescentes (p. ej., Bruchpilot::RFP)8 o una señal densa en electrones para análisis de sinapsis ultraestructural (p. ej., miniSOG-mCherry)8. Las imágenes de los terminales sinápticos Or42a se pueden obtener con una combinación de microscopía confocal de barrido láser y microscopía electrónica de transmisión. Demostramos que la poda de glomérulos sinápticos de Or42a depende de la dosis de EB, escalando a la concentración de la experiencia odorífera cronometrada. El porcentaje de odorante EB disuelto en el aceite mineral utilizado como vehículo puede variar, al igual que la duración programada de la exposición al odorante en animales en etapa de desarrollo. Por último, se muestran los métodos utilizados para analizar el alcance de la poda sináptica de los glomérulos mediante la medición de la intensidad y el volumen de la fluorescencia de inervación de VM7. El número de sinapsis también se puede cuantificar mediante el recuento de puntos sinápticos marcados y la medición de los parámetros de la ultraestructura sináptica mediante microscopía electrónica de transmisión8. En general, el protocolo que se muestra aquí es un enfoque poderoso que permite la disección sistemática de los mecanismos celulares y moleculares que median la poda de conectividad sináptica del circuito olfativo de Drosophila durante un período crítico juvenil. La configuración general de exposición a olores descrita en este estudio se ha utilizado en estudios previos utilizando otros olores y ensayando otros glomérulos 3,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
La exposición a olores y el protocolo de imágenes cerebrales presentados aquí se pueden utilizar para inducir y cuantificar de manera confiable la poda de glomérulos sinápticos de las neuronas sensoriales olfativas dependientes de la experiencia durante un período crítico en los primeros años de vida. Los estudios anteriores que utilizaron este paradigma de tratamiento para explorar la remodelación del circuito olfativo comenzaron la exposición al odorante elsegundo día d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los demás miembros de Broadie Lab por sus valiosos aportes. Las figuras se crearon utilizando BioRender.com. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud MH084989 y NS131557 a K.B.
Materials
| For Odor Exposure | |||
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-110 | |
| Ethyl butyrate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M3516 | |
| Odor chambers | Glasslock | ||
| Paint brushes | Winsor & Newton | Series 233 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Wire mesh | Scienceware | 378460000 | |
| Brain Dissection | |||
| Ethanol, 190 proof | Decon Labs | 2801 | Diluted to 70% |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumont #5 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscope Sciences | 157-8 | Diluted to 4% |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100B | |
| Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | Diluted to 1x |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Sylgard | Electron Microscope Sciences | 24236-10 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Brain Immunocytochemistry | |||
| 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| 546 goat anti-rat | Invitrogen | A11081 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9647 | |
| Chicken anti-GFP | Abcam | 13970 | |
| Coverslips | Avantor | 48366-067 | 25 x 25 mm |
| Double-sided tape | Scotch | 34-8724-5228-8 | |
| Fluoromount-G | Electron Microscope Sciences | 17984-25 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 75 x 25 mm |
| Nail polish | Sally Hansen | 109 | Xtreme Wear, Invisible |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Rat anti-CadN | Developmental Studies Hybridoma Bank | AB_528121 | |
| Confocal/Analysis | |||
| Any computer/laptop | |||
| Confocal microscope | Carl Zeiss | Zeiss 510 META | |
| Fiji software | Fiji | Version 2.14.0/1.54f |
References
- English, S., Barreaux, A. M. The evolution of sensitive periods in development: insights from insects. Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).
- Fabian, B., Sachse, S. Experience-dependent plasticity in the olfactory system of Drosophila melanogaster and other insects. Fron Cell Neurosci. 17, 1130091 (2023).
- Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
- Devaud, J. M., Acebes, A., Ramaswami, M., Ferrús, A. Structural and functional changes in the olfactory pathway of adult Drosophila take place at a critical age. J Neurobiol. 56 (1), 13-23 (2003).
- Sachse, S., et al. Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit. Neuron. 56 (5), 838-850 (2007).
- Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Pro Natl Acad Sci U S A. 108 (36), E646-E654 (2011).
- Kidd, S., Struhl, G., Lieber, T. Notch is required in adult Drosophila sensory neurons for morphological and functional plasticity of the olfactory circuit. PLoS Genet. 11 (5), e1005244 (2015).
- Golovin, R. M., Vest, J., Vita, D. J., Broadie, K. Activity-dependent remodeling of Drosophila olfactory sensory neuron brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 39 (16), 2995-3012 (2019).
- Golovin, R. M., Vest, J., Broadie, K. Neuron-specific FMRP roles in experience-dependent remodeling of olfactory brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 41 (6), 1218-1241 (2021).
- Chodankar, A., Sadanandappa, M. K., Raghavan, K. V., Ramaswami, M. Glomerulus-selective regulation of a critical period for interneuron plasticity in the drosophila antennal lobe. J Neurosci. 40 (29), 5549-5560 (2020).
- Stephan, D., et al. Drosophila Psidin regulates olfactory neuron number and axon targeting through two distinct molecular mechanisms. J Neurosci. 32 (46), 16080 (2012).
- Doll, C. A., Broadie, K. Activity-dependent FMRP requirements in development of the neural circuitry of learning and memory. Development. 142 (7), 1346-1356 (2015).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. J Vis Exp. (118), e55128 (2016).
- Okumura, M., Kato, T., Miura, M., Chihara, T. Hierarchical axon targeting of Drosophila olfactory receptor neurons specified by the proneural transcription factors Atonal and Amos. Genes to Cells. 21 (1), 53-64 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Vita, D. J., Meier, C. J., Broadie, K. Neuronal fragile X mental retardation protein activates glial insulin receptor mediated PDF-Tri neuron developmental clearance. Nat Comm. 12 (1), 1160 (2021).
- Gugel, Z. V., Maurais, E. G., Hong, E. J. Chronic exposure to odors at naturally occurring concentrations triggers limited plasticity in early stages of Drosophila olfactory processing. eLife. 12, 85443 (2023).
