إعادة تشكيل تعتمد على الخبرة للاتصال العصبي الحسي الشمي للدماغ اليافع في فترة حرجة مبكرة من الحياة
Summary
نصف هنا طرقا لتحفيز وتحليل إعادة تشكيل الخبرة الشمية المعتمدة على الكبيبات المشبكية لفص الهوائي في دماغ ذبابة الفاكهة اليافعة.
Abstract
تحفز التجربة الحسية الشمية المبكرة في الحياة إعادة تشكيل الكبيبات المشبكية الدراماتيكية في دماغ ذبابة الفاكهة اليافع ، والتي تعتمد تجريبيا على الجرعة ، ومقيدة زمنيا ، ويمكن عكسها بشكل عابر فقط في فترة حرجة قصيرة ومحددة جيدا. يتم تحديد اتجاه إعادة تشكيل الاتصال المشبكي لدائرة الدماغ من خلال الرائحة المحددة التي تعمل على فئة مستقبلات المستجيب للخلايا العصبية الحسية الشمية. بشكل عام ، تعبر كل فئة من الخلايا العصبية عن مستقبل رائحة واحد فقط وتعصب كبيبة متشابكة شمية واحدة. في النموذج الجيني لذبابة الفاكهة ، تم تعيين المجموعة الكاملة من الكبيبات الشمية بدقة من خلال استجابة الرائحة والإنتاج السلوكي. تنشط رائحة إيثيل بوتيرات (EB) الخلايا العصبية لمستقبلات Or42a التي تعصب كبيبة VM7. خلال الفترة الحرجة في وقت مبكر من الحياة ، تؤدي تجربة EB إلى التخلص من المشبك العصبي المعتمد على الجرعة في الخلايا العصبية الحسية الشمية Or42a. تسمح الفترات الزمنية للتعرض لرائحة EB ذات الجرعات بالتحقيق في تقليم اتصال الدائرة المعتمد على الخبرة في دماغ الأحداث. يتم إجراء التصوير المجهري البؤري للكبيبات المشبكية لفص الهوائي باستخدام علامات معدلة وراثيا مدفوعة بمستقبلات Or42a توفر تقديرا كميا لعدد المشبك وحجم التعصيب. تتيح مجموعة الأدوات الجينية المتطورة لذبابة الفاكهة التشريح المنهجي للآليات الخلوية والجزيئية التي تتوسط في إعادة تشكيل دائرة الدماغ.
Introduction
تمثل إعادة تشكيل دوائر الدماغ اليافعة خلال الحياة المبكرة الفرصة الأخيرة لتغييرات الاتصال المشبكي واسعة النطاق لتتناسب مع البيئة شديدة التغير وغير المتوقعة التي يولد فيها. باعتبارها المجموعة الأكثر وفرة من ، تشترك الحشرات في آلية إعادة تشكيل الفترة الحرجة المحفوظة تطوريا1. تفتح الفترات الحرجة مع بداية المدخلات الحسية ، وتظهر تغييرات عكسية في الدائرة لتحسين الاتصال ، ثم تغلق عندما تقاوم قوى التثبيت المزيد من إعادة البناء2. تعتمد الحشرات بشكل خاص على المعلومات الحسية الشمية وتظهر فترة حرجة شمية محددة جيدا. توفر ذبابة الفاكهة نموذجا وراثيا ممتازا للتحقيق في هذه الفترة الحرجة المعتمدة على التجربة في دماغ الأحداث. تؤدي تجربة الرائحة خلال الأيام القليلة الأولى بعد الانسداد إلى تغييرات اتصال الدائرة المذهلة في الكبيبات المشبكية 3,4 المحددة بشكل فردي. يعتمد اتجاه إعادة التصميم على تجربة رائحة الإدخال المحددة. تسبب بعض الروائح زيادة في حجم الكبيبة المشبكية لبضعة أيام بعد الانسداد (dpe)3,5,6,7 ، في حين أن الروائح الأخرى تسبب التخلص السريع من نقاط الاشتباك العصبي خلال الفترة الحرجة 0-2 dpe ، مما يؤدي إلى انخفاض حجم التعصيب 8,9,10. على وجه التحديد ، تؤدي تجربة رائحة إيثيل بوتيرات (EB) إلى التقليم المشبكي المعتمد على الجرعة للخلايا العصبية المستقبلة لمستقبلات حاسة الشم Or42a فقط خلال هذه الفترة الحرجة المبكرةمن العمر 8. يمكن عكس إزالة المشبك تماما عن طريق تعديل مدخلات رائحة EB خلال الفترة الحرجة ولكنها تصبح دائمة بعد إغلاق الفترة الحرجة. يوفر هذا التقليم المشبكي المعتمد على الخبرة الشمية نظاما تجريبيا قيما لتوضيح الآليات المقيدة زمنيا الكامنة وراء إعادة تشكيل دائرة دماغ الأحداث.
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا يستخدم لحث وتحليل التقليم المشبكي المعتمد على تجربة EB للخلايا العصبية الحسية الشمية لمستقبلات Or42a خلال الفترة الحرجة المبكرة من الحياة. نظهر أن المحطات المتشابكة Or42a في كبيبة الفص VM7 من فص الهوائي يمكن تمييزها على وجه التحديد عن طريق القيادة المعدلة وراثيا لعلامة mCD8 المربوطة بالغشاء :: GFP ، إما دمجها مباشرة مع مروج Or42a (Or42a-mCD8 :: GFP) 11 أو باستخدام نظام التعبير الثنائي Gal4 / UAS (Or42a-Gal4 يقود UAS-mCD8 :: GFP) 12. يمكن تسمية نقاط الاشتباك العصبي الفردية Or42a بالمثل باستخدام التعبير الوراثي المستهدف لعلامات المنطقة النشطة قبل المشبكية المدمجة في مجموعة من العلامات الفلورية (على سبيل المثال ، Bruchpilot :: RFP) 8 أو إشارة كثيفة الإلكترون لتحليلات المشبك الفائق البنية (على سبيل المثال ، miniSOG-mCherry)8. يمكن تصوير المحطات المتشابكة Or42a بمزيج من الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر والمجهر الإلكتروني النافذ. لقد أظهرنا أن تقليم الكبيبات المشبكية Or42a يعتمد على جرعة EB ، ويتدرج إلى تركيز تجربة الرائحة الموقوتة. يمكن أن تختلف النسبة المئوية لرائحة EB المذابة في الزيوت المعدنية المستخدمة كوسيلة ، وكذلك المدة الزمنية للتعرض للرائحة في التي تم تنظيمها في النمو. أخيرا ، نعرض الطرق المستخدمة لتحليل مدى تقليم الكبيبات المشبكية عن طريق قياس شدة وحجم مضان التعصيب VM7. يمكن أيضا قياس رقم المشبك عن طريق حساب النقاط المشبكية المسماة وقياس معلمات البنية الفوقية المشبكية باستخدام المجهر الإلكترونيالنافذ 8. بشكل عام ، البروتوكول الموضح هنا هو نهج قوي يتيح التشريح المنهجي لكل من الآليات الخلوية والجزيئية التي تتوسط تشذيب الاتصال المشبكي لدائرة حاسة الفاكهة الشمية خلال فترة حرجة للأحداث. تم استخدام الإعداد العام للتعرض للرائحة الموصوف في هذه الدراسة في الدراسات السابقة باستخدام روائح أخرى وفحص الكبيباتالأخرى 3,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن استخدام بروتوكول التعرض للرائحة وتصوير الدماغ المقدم هنا للحث بشكل موثوق وقياس تقليم الكبيبات المشبكية للخلايا العصبية الحسية الشمية المعتمدة على الخبرة خلال فترة حرجة في وقت مبكر من الحياة. بدأت الدراسات السابقة التي تستخدم نموذج العلاج هذا لاستكشاف إعادة تشكيل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء Broadie Lab الآخرين على مدخلاتهم القيمة. تم إنشاء الأرقام باستخدام BioRender.com. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعهد الوطني للصحة MH084989 و NS131557 إلى K.B.
Materials
| For Odor Exposure | |||
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-110 | |
| Ethyl butyrate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M3516 | |
| Odor chambers | Glasslock | ||
| Paint brushes | Winsor & Newton | Series 233 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Wire mesh | Scienceware | 378460000 | |
| Brain Dissection | |||
| Ethanol, 190 proof | Decon Labs | 2801 | Diluted to 70% |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumont #5 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscope Sciences | 157-8 | Diluted to 4% |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100B | |
| Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | Diluted to 1x |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Sylgard | Electron Microscope Sciences | 24236-10 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Brain Immunocytochemistry | |||
| 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| 546 goat anti-rat | Invitrogen | A11081 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9647 | |
| Chicken anti-GFP | Abcam | 13970 | |
| Coverslips | Avantor | 48366-067 | 25 x 25 mm |
| Double-sided tape | Scotch | 34-8724-5228-8 | |
| Fluoromount-G | Electron Microscope Sciences | 17984-25 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 75 x 25 mm |
| Nail polish | Sally Hansen | 109 | Xtreme Wear, Invisible |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Rat anti-CadN | Developmental Studies Hybridoma Bank | AB_528121 | |
| Confocal/Analysis | |||
| Any computer/laptop | |||
| Confocal microscope | Carl Zeiss | Zeiss 510 META | |
| Fiji software | Fiji | Version 2.14.0/1.54f |
References
- English, S., Barreaux, A. M. The evolution of sensitive periods in development: insights from insects. Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).
- Fabian, B., Sachse, S. Experience-dependent plasticity in the olfactory system of Drosophila melanogaster and other insects. Fron Cell Neurosci. 17, 1130091 (2023).
- Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
- Devaud, J. M., Acebes, A., Ramaswami, M., Ferrús, A. Structural and functional changes in the olfactory pathway of adult Drosophila take place at a critical age. J Neurobiol. 56 (1), 13-23 (2003).
- Sachse, S., et al. Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit. Neuron. 56 (5), 838-850 (2007).
- Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Pro Natl Acad Sci U S A. 108 (36), E646-E654 (2011).
- Kidd, S., Struhl, G., Lieber, T. Notch is required in adult Drosophila sensory neurons for morphological and functional plasticity of the olfactory circuit. PLoS Genet. 11 (5), e1005244 (2015).
- Golovin, R. M., Vest, J., Vita, D. J., Broadie, K. Activity-dependent remodeling of Drosophila olfactory sensory neuron brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 39 (16), 2995-3012 (2019).
- Golovin, R. M., Vest, J., Broadie, K. Neuron-specific FMRP roles in experience-dependent remodeling of olfactory brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 41 (6), 1218-1241 (2021).
- Chodankar, A., Sadanandappa, M. K., Raghavan, K. V., Ramaswami, M. Glomerulus-selective regulation of a critical period for interneuron plasticity in the drosophila antennal lobe. J Neurosci. 40 (29), 5549-5560 (2020).
- Stephan, D., et al. Drosophila Psidin regulates olfactory neuron number and axon targeting through two distinct molecular mechanisms. J Neurosci. 32 (46), 16080 (2012).
- Doll, C. A., Broadie, K. Activity-dependent FMRP requirements in development of the neural circuitry of learning and memory. Development. 142 (7), 1346-1356 (2015).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. J Vis Exp. (118), e55128 (2016).
- Okumura, M., Kato, T., Miura, M., Chihara, T. Hierarchical axon targeting of Drosophila olfactory receptor neurons specified by the proneural transcription factors Atonal and Amos. Genes to Cells. 21 (1), 53-64 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Vita, D. J., Meier, C. J., Broadie, K. Neuronal fragile X mental retardation protein activates glial insulin receptor mediated PDF-Tri neuron developmental clearance. Nat Comm. 12 (1), 1160 (2021).
- Gugel, Z. V., Maurais, E. G., Hong, E. J. Chronic exposure to odors at naturally occurring concentrations triggers limited plasticity in early stages of Drosophila olfactory processing. eLife. 12, 85443 (2023).
