Aislamiento de vectores virales adenoasociados mediante un protocolo de cromatografía de afinidad con heparina semiautomatizado y de un solo paso

NOTA: Consulte la Figura 1 para obtener una ilustración que resume el protocolo. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo. Todos los trabajos relacionados con células y virus deben realizarse en cabinas e incubadoras de bioseguridad específicos, separados de los que se utilizan habitualmente para el mantenimiento de las líneas celulares. El equipo y los reactivos que entren en contacto con las células cultivadas y los virus deben ser estériles. Es esencial que la eliminación de los reactivos peligrosos y los materiales contaminados con virus se realice de acuerdo con las fichas de datos de seguridad de los materiales y de conformidad con las leyes y directrices nacionales proporcionadas por la oficina de salud y seguridad ambiental de cada institución. A partir de abril de 2019, las directrices de los NIH para la investigación que involucra moléculas de ácido nucleico recombinantes o sintéticos categorizan como agentes del Grupo de Riesgo 1 (no asociados con enfermedad en humanos adultos sanos) todos los serotipos de AAV, así como las construcciones de AAV recombinantes o sintéticas. Esta clasificación se aplica cuando el transgén no codifica un producto génico potencialmente tumorigénico o una toxina, y las construcciones se producen sin un virus auxiliar. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva de la Comunidad de la Unión Europea (2010/63/UE) para el cuidado y uso de animales de laboratorio, transpuesta a la ley portuguesa en 2013 (Decreto Ley 113/2013). Además, los procedimientos con animales fueron aprobados por la Organización Responsable para el Bienestar Animal de la Facultad de Medicina y el Centro de Neurociencia y Biología Celular de la Universidad de Coimbra. Los investigadores recibieron una formación adecuada (curso certificado por FELASA) y una certificación de las autoridades portuguesas (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lisboa, Portugal) para realizar los experimentos. 1. Construcciones de plásmidos Siga las instrucciones del fabricante de un kit libre de endotoxinas maxiprep para aislar y purificar cantidades sustanciales de ADN de los siguientes plásmidos: i) pITR: el vector de transferencia de interés; ii) plásmido pAAV-RC: pRV1, que contiene las secuencias AAV2 Rep y Cap 36; iii) plásmido pAAV-RC: pH21, que contiene las secuencias Rep y Cap 36 de AAV1; iv) plásmido pAAV-RC: pAAV2/9n, que contiene las secuencias AAV2 Rep y AAV9 Cap ; v) pHelper: pFdelta6, plásmido helper de adenovirus36. Cribar la integridad de los plásmidos generados realizando las restricciones enzimáticas recomendadas36. Monitorizar la integridad de los plásmidos pITR por digestión con SmaI, una endonucleasa de restricción, que corta dos veces dentro de una porción inestable de los ITRs53,54.NOTA: Dado que los ITRs son altamente inestables y susceptibles a las deleciones, se recomienda el uso de células supercompetentes SURE 2 para minimizar la recombinación en estos sitios. 2. Cultivo celular Cultivo de riñón embrionario humano 293, que expresa de forma estable la línea celular SV40 de antígeno T grande (HEK293T) en el nivel de glucosa alta Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina-estreptomicina, a 37 °C, bajo una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2, como punto de partida para los pasos posteriores. Subcultive las células utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril 1x, pH 7,4, para lavar las células antes de añadir ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,05%.NOTA: Evite utilizar celdas que hayan pasado por un número excesivo de pasajes (máximo de 20). Analice regularmente los cultivos celulares para detectar contaminación por micoplasma. 3. Producción de rAAV por transfección transitoria Día 1: Recubrimiento de celdasPara cada producción viral, se colocan las células HEK293T en 10 placas de cultivo tratadas (15 cm de diámetro) el día antes de la transfección, a una densidad de 10,5 × 106 células por placa en 22 mL de medio de cultivo suplementado e incubar durante 24 h hasta que las células estén 70%-80% confluentes y listas para la transfección. Día 2: Transfección celular con polietilenimina (PEI)Para cada producción viral (equivalente a 10,5 placas), configure la siguiente mezcla de transfección en un tubo de microcentrífuga: 54,6 μg de pITR; 45,675 μg de pRV1; 45,675 μg de pH21 o pAAV2/9n; 109,2 μg de pFdelta6. Mezclar dando golpecitos. Agregue la mezcla a 4.557 mL de DMEM no suplementado en un tubo de centrífuga de 50 mL. Mezclar dando golpecitos. Añadir 1,365 mL de solución estéril de PEI a 1 mg/mL (pH 7,4), gota a gota. Mezclar dando golpecitos. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos ADN-PEI. Agregue esta mezcla a 231 mL de DMEM suplementado precalentado. Reemplace todo el medio de cultivo de cada plato con 22 mL de esta mezcla de transfección. Incubar las células durante 48 h.NOTA: Este paso debe realizarse con cuidado para evitar el desprendimiento de la célula. Día 4: Recolección de célulasCuando el pITR codifica un indicador fluorescente, visualice las células transfectadas bajo un microscopio de fluorescencia. Recoja el medio de cada plato en tubos de centrífuga de 50 ml y centrifugue a 800 × g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante.NOTA: Este paso es opcional y tiene como objetivo recuperar las células transfectadas que pueden haberse desprendido debido a una confluencia muy alta. Agregue 10 ml de PBS precalentado a cada plato. Retire suavemente las células con un raspador de células y recoja la suspensión en los tubos de centrífuga de 50 ml del paso 3.3.2. Lave 5 platos a la vez con 10 ml adicionales de PBS y transfiera la suspensión a los tubos de centrífuga de 50 ml del paso 3.3.3. Granular las células a 800 × g durante 10 min y desechar el sobrenadante. Congele los gránulos de celda a -80 °C.NOTA: Los gránulos de celda pueden almacenarse durante varios meses (punto de pausa). 4. Extracción de rAAV y purificación de FPLC Día 5: Preparación del lisado celularDescongele los gránulos de celda a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células recogidas de las 10 placas en 100 mL de un tampón estéril que contenga 150 mM de cloruro de sodio (NaCl) y 20 mM de Tris, pH 8,0, en agua ultrapura (tipo I). Mezcle la suspensión pipeteando hacia arriba y hacia abajo, para asegurar una suspensión homogénea. Añadir 12,5 mL de una solución estéril recién preparada de desoxicolato de sodio al 10% en agua ultrapura para inducir la lisis celular. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo.NOTA: Deseche el desoxicolato de sodio, así como los materiales que estén en contacto con él, de acuerdo con la ficha de datos de seguridad del material y las directrices proporcionadas por la oficina de seguridad y salud ambiental de la institución. También se recomienda usar una mascarilla facial mientras se manipula este polvo. Después de mezclar, la solución se vuelve altamente viscosa. Añadir 27 μL de benzonasa nucleasa a la mezcla anterior. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que la muestra ya no sea viscosa. Incubar a 37 °C durante 1 h, realizando un vórtice cada 10 min.NOTA: Esta endonucleasa es capaz de degradar eficientemente todas las formas de ADN y ARN sin exhibir ninguna actividad proteolítica. Eliminar los restos celulares centrifugando la mezcla a 3.000 × g durante 60 min a 25 °C. Filtre el sobrenadante con un filtro de jeringa estéril de difluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,45 μm y transfiéralo a un nuevo recipiente estéril.NOTA: Este importante paso asegura que se elimine la mayor parte de los desechos celulares, evitando así la obstrucción de las columnas de cromatografía. Guarde una pequeña alícuota de esta mezcla para su análisis (paso opcional). Día 5 (continuación): Purificación de rAAVs en columna de heparinaNOTA: La aplicación de muestras se puede realizar utilizando una bomba de muestra o un superloop de 50 mL o 150 mL como parte del sistema. Dado que se disuelve más aire a temperaturas más bajas, es importante dejar tiempo suficiente para que los tampones y las soluciones (generalmente almacenados a 4 °C) se aclimaten a la temperatura ambiente antes de su uso en el sistema FPLC.Opcional: Si el sistema se ha almacenado durante largos períodos, llene el sistema y todas las entradas con una solución de almacenamiento recién preparada (etanol al 20%) siguiendo instrucciones manuales o un método predefinido de limpieza del sistema en el lugar (CIP del sistema). Lave completamente la ruta de flujo de líquido con agua ultrapura estéril siguiendo instrucciones manuales o un método CIP del sistema predefinido. Conecte una columna de heparina preempaquetada de 1 mL, configure la alarma de presión y lave con cinco volúmenes de columna (CV) de agua ultrapura a un caudal de 1 mL/min. Cambie las soluciones de la bandeja tampón de agua ultrapura a tampón A (solución estéril de 100 mM de NaCl y 20 mM de Tris, pH 8, en agua ultrapura) para la entrada A (bomba del sistema A) y al tampón B (solución estéril de 500 mM de NaCl y 20 mM de Tris, pH 8, en agua ultrapura) para la entrada B (bomba del sistema B). Si el sistema tiene una bomba de muestreo, coloque la entrada de tampón de la válvula de entrada de muestra en el tampón A. Lave la bomba del sistema B con el tampón B y llene el resto de la trayectoria del flujo de líquido con el tampón A.NOTA: Si es necesario, desconecte la columna de la ruta de flujo y vuelva a conectarla después. Inserte un tubo de entrada de muestra de la válvula de entrada de muestra, por ejemplo, S1, en el recipiente con la preparación viral obtenida en el paso 4.1.4. (de la preparación de lisado celular). Prepare la ruta de flujo desde la entrada de muestra S1 hasta la válvula de inyección con la solución de muestra. Alternativamente, llene un superloop de 50 mL o 150 mL con la muestra que contiene rAAV usando una jeringa de 50 mL. Equilibre la columna con un volumen total de cinco CV utilizando el 12,5% del tampón B a una velocidad de 1 mL/min. Aplique el volumen total de la muestra en la columna utilizando la bomba de muestreo (seleccione inyectar toda la muestra con sensor de aire) o el superloop a 0,5 mL/min y recoja el flujo utilizando el puerto de salida en un nuevo recipiente estéril.NOTA: Cuando la función de control de flujo para evitar la sobrepresión está habilitada, el flujo disminuirá automáticamente en caso de obstrucción de la columna. Si el caudal cae significativamente por debajo de 0,5 mL/min, detenga la aplicación de la muestra, realice un lavado con 2-5 CV de tampón A y, a continuación, reanude la aplicación de la muestra. Lavar la columna a 1 mL/min con 20 CVs de tampón A, recogiendo el caudal mediante el puerto de salida. Eluir la muestra a 1 mL/min con el siguiente esquema: i) gradiente lineal con un objetivo del 50% del tampón B para cinco CV; ii) paso con un objetivo del 90% de tampón B durante cinco CV; iii) paso con un objetivo del 100% del colchón B durante cinco CV. Recoja la muestra eluida en fracciones de 1 mL utilizando un colector de fracciones y tubos de microcentrífuga de baja retención (2 mL) y guárdelos a -20 °C.NOTA: Las fracciones rAAV pueden almacenarse durante varias semanas (punto de pausa). Reequilibrar la columna a 1 mL/min con 12,5% de tampón B para cinco CV. Cambie las entradas de las soluciones tampón a agua ultrapura y lave la columna a 1 mL/min durante cinco CV. Cambie las entradas de agua ultrapura a etanol al 20% y lave la columna a 1 mL/min durante cinco CV. Desconecte la columna y guárdela a 4 °C.NOTA: Las columnas se pueden reutilizar varias veces sin ningún otro procedimiento importante de limpieza y desinfección si se utilizan el mismo serotipo y transgén de rAAV. Lave completamente la ruta del flujo de líquido con etanol al 20% siguiendo instrucciones manuales o un método CIP del sistema predefinido. 5. Concentración de rAAVs purificados Día 6: Paso 1 de concentraciónConcentre los rAAV utilizando una unidad de filtro centrífugo de 15 mL con un límite de peso molecular de 100 kDa. Cargue las fracciones deseadas que contengan rAAV (fracciones FPLC 7 a 16) en la unidad de filtro centrífugo de 15 ml y centrifugue a 2.000 × g durante 2 min a temperatura ambiente. Asegúrese de que el volumen concentrado en la unidad de filtro sea de aproximadamente 500 μL. Si el volumen concentrado supera ampliamente los 500 μL, repita los pasos de centrifugación en intervalos de 1 minuto hasta que alcance el volumen deseado. Día 6 (continuación): Intercambio de búferesAñada 1 mL de PBS estéril a la unidad de filtro centrífugo que contiene los rAAV. Pipetea con cuidado hacia arriba y hacia abajo para lavar el filtro. Centrifugar a 2.000 × g en intervalos de 1 min hasta alcanzar el volumen final de 500 μL. Día 6 (continuación): Paso de concentración 2Transfiera los 500 μL de rAAV concentrados obtenidos en el paso anterior a una unidad de filtro centrífugo de 0,5 mL con un corte de peso molecular de 100 kDa y centrifugar a 6.000 × g durante 1 min. Si es necesario, repita el paso de centrifugación hasta alcanzar un volumen final inferior a 100 μL. Día 6 (continuación): RecuperaciónPara recuperar el rAAV concentrado, coloque el dispositivo de filtro boca abajo en un nuevo tubo de recolección de microcentrífuga. Coloque el tubo en una microcentrífuga con la tapa hacia el centro y realice un centrifugado prolongado dentro de la cámara de flujo para transferir los rAAV concentrados del dispositivo al tubo de microcentrífuga. Alternativamente, centrifugar a 1.000 × g durante 2 min. Suplemento con Pluronic F-68 estéril 0,001% (opcional).NOTA: Pluronic F-68 es un tensioactivo no iónico aprobado para uso humano por la Administración de Alimentos y Medicamentos que es capaz de mitigar las pérdidas de rAAV al prevenir sus interacciones con las superficies de los materiales (plásticos) utilizados durante la preparación de la dilución, la carga de jeringas y el equipo de administración55,56. Aliquot los rAAV en tubos de microcentrífuga de baja retención y almacenarlos a -80 °C (punto de pausa). 6. Cuantificación de rAAVs purificados Día 6 (continuación): Determinar el título de las preparaciones de rAAV, expresado en genomas virales/μL (vg/μL), mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) utilizando un kit comercial y siguiendo las instrucciones del fabricante.Incubar la solución de partículas rAAV con DNasa I a 37 °C durante 20 min.NOTA: Este procedimiento promueve la digestión del ADN genómico libre y el ADN plásmido derivado de las células huésped, asegurando así que solo se conserve la secuencia de ácido nucleico dentro de las partículas intactas de rAAV. Inactivación térmica de la DNasa I a 95 °C durante 10 min. Añadir tampón de lisis e incubar durante 10 min a 70 °C para favorecer la desnaturalización por calor de las proteínas de las partículas de rAAV. Diluir la solución del genoma rAAV obtenida en tampón de dilución antes de proceder a la RT-qPCR. Prepare un conjunto de patrones diluidos en serie del control positivo (de 2 × 107 vg/μL a 2 × 102 vg/μL) suministrado con el kit. Realice una mezcla de reacción que contenga 12,5 μL de mezcla Taq II, 0,5 μL de mezcla de cebador diluida, 7 μL de agua y 5 μL de ADN rAAV diluido (muestra de AAV desconocida y estándares del paso 6.1.4.). Realice la RT-qPCR en un sistema de detección de PCR en tiempo real, utilizando el siguiente protocolo: 1 ciclo a 95 °C durante 2 min (desnaturalización inicial) y 40 ciclos a 95 °C durante 5 s (desnaturalización) y 60 °C durante 30 s (recocido, extensión y lectura de placas), seguido de un análisis de la curva de fusión. Calcular la concentración absoluta de la muestra a partir de la curva estándar (línea de regresión lineal), considerando el factor de dilución que resulta de la preparación de la muestra rAAV.NOTA: La cuantificación del número de genomas virales se logra a través de la amplificación de la secuencia ITR de AAV2 (secuencia diana de los cebadores proporcionados por el kit). 7. SDS-PAGE, tinción azul de Coomassie y Western blot Desnaturalizar 40 μL de cada muestra (cada fracción de FPLC; el flujo; las muestras previas a la columna y un total de 2,3 ×10 10 vg del producto concentrado final) añadiendo 6 tampones de muestra (0,5 M de Tris-HCl/0,4% dodecil sulfato de sodio (SDS) pH 6,8, 30% glicerol, 10% SDS, 0,6 M de ditiotreitol (DTT), 0,012% azul de bromofenol) e incubando las muestras durante 5 min a 95 °C. Cargue las muestras desnaturalizadas (48 μL) en un gel de poliacrilamida SDS (4% de apilamiento y 10% de gel de resolución) y realice la separación electroforética a 100 V durante 70 min, adyacente a una escalera de proteínas. Análisis de proteínasNOTA: Se puede realizar una tinción con azul de Coomassie o un Western blot.Tinción azul de CoomassiePara visualizar las bandas de proteínas, tiña el gel durante 10 minutos con una solución de azul de Coomassie G250 al 0,25% disuelta en metanol al 50% y ácido acético glacial al 10%. Realice la eliminación de manchas en gel lavándola varias veces con una solución que contenga un 25% de metanol y un 5% de ácido acético glacial hasta que se vean bandas claras con fondo bajo. Capture imágenes utilizando un sistema de imágenes adecuado. Western blotTransfiera las proteínas a una membrana de PVDF de acuerdo con los protocolos estándar. Bloquear la membrana mediante incubación en leche descremada al 5% diluida en TBS-T (0,1% Tween 20 en solución salina tamponada con Tris) durante 1 h a temperatura ambiente. Utilice los siguientes anticuerpos primarios (diluidos en solución bloqueante) para la incubación nocturna a 4 °C: anticuerpo monoclonal anti-AAV de ratón, VP1, VP2, VP3 (B1, 1:1.000) o anticuerpo monoclonal anti-AAV monoclonal de ratón, VP1, VP2 (A69, 1:1.000). Lavar las membranas durante 3 x 15 min en TBS-T e incubar con un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra unido a fosfatasa alcalina (1:10.000), durante 2 h a temperatura ambiente. Lave las membranas durante 3 x 15 min en TBS-T. Agregue sustrato quimiofluorescente (ECF) mejorado y visualice las bandas de proteínas mediante imágenes de quimiofluorescencia. 8. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) Coloque una rejilla de malla 200 recubierta de carbono Formvar boca abajo sobre una gota de una muestra de rAAV y deje que se asiente durante 1 minuto. Lavar las rejillas con una gota de agua y secar el exceso de líquido con papel de filtro. Tiñe negativamente las rejillas con una solución de acetato de uranilo al 1% (pH 7) durante 1 minuto para fijar y contrastar las partículas virales. Lavar las rejillas con una gota de agua y secar el exceso de líquido con papel de filtro. Examine las muestras en un microscopio electrónico de transmisión.NOTA: Las concentraciones altas de sal pueden afectar directamente la unión de los rAAV a la red y conducir a la visualización de estructuras cristalinas. 9. Absorción consecutiva de luz ultravioleta-visible, dispersión de luz estática y análisis de dispersión de luz dinámica En una placa de cuantificación de 96 pocillos, cargue 2 μL de una muestra de rAAV y 2 μL de PBS para utilizarlos como tampón en blanco (realice esto por duplicado). Utilice la aplicación AAV Quant en el software de análisis del cliente, coloque los nombres de las muestras en la ubicación correcta de la placa, seleccione el serotipo AAV y haga clic en Siguiente. Cargue la placa de cuantificación de 96 pocillos en el equipo dedicado y proceda con la lectura de la placa para la adquisición de datos. 10. Ensayos de transducción in vitro Se pueden utilizar diferentes líneas celulares para analizar rápidamente la eficiencia de transducción de los rAAV.Siembra uniformemente células de HEK293T en placas de 24 pocillos (a una densidad de 137.500 células/pocillo) y una línea celular de neuroblastoma-2A (Neuro2a) de ratón en placas de 24 pocillos (50.000 células/pocillo) o en un portaobjetos de cámara de 8 pocillos (27.000 células/pocillo), utilizando DMEM con glucosa alta, suplementada con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina-estreptomicina, como se ha descrito anteriormente. Deje que las células se adhieran durante la noche a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga 5% de CO2. Recoja el medio acondicionado de cada pocillo (250 μL de placas de 24 pocillos y 50 μL del portaobjetos de la cámara de 8 pocillos) y guárdelo a 4 °C para su uso posterior. Añadir las siguientes preparaciones de rAAV a cada pocillo e incubar las células durante 24 h a 37 °C en una atmósfera con 5% de CO2 .Agregue 50 μL de las fracciones F2-F16 recolectadas por FPLC y fluya a través de HEK293T celdas sembradas en placas de 24 pocillos. Añadir un total de 5,5 × 109 vg de los rAAVs concentrados diluidos en 50 μL de PBS a las células Neuro2a sembradas en placas de 24 pocillos (incluir un pocillo de control negativo, añadiendo 50 μL de PBS a las células). Añadir un total de 2,75 × 109 vg de los rAAVs concentrados diluidos en 25 μL de PBS a las células Neuro2a colocadas en un portaobjetos de 8 pocillos (incluir la condición de control negativo, añadiendo 50 μL de PBS a las células). Añadir el medio acondicionado previamente almacenado (paso 10.1.2) a cada pocillo e incubar durante 24 h. Deseche el medio y lave las celdas 2 veces con PBS. Añadir una solución de paraformaldehído (PFA) al 4%, suplementada con sacarosa al 4% en PBS, precalentada a 37 °C, a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 20 min. Lavar 2 veces con PBS y almacenar a 4 °C hasta que se realice la obtención de imágenes (punto de pausa). Adquiera imágenes en un microscopio de fluorescencia invertida equipado con un objetivo de 10x/0,30, o en un microscopio confocal invertido equipado con un objetivo DIC de aceite de 40x/1,4. Para tener un modelo más relevante y reflexivo del entorno in vivo , utilice cultivos neuronales primarios de la siguiente manera:Preparar cultivos primarios de neuronas corticales como lo describieron previamente Santos et al.57. En resumen, siembre 200.000 células/mL en placas de 12 pocillos y manténgalas en cultivo hasta el día in vitro 16. Recoja el medio acondicionado de cada pocillo (100 μL) y guárdelo a 4 °C para su uso posterior. Añadir a cada pocillo los rAAVs a ensayar: un total de 2,75 × 109 vg de los rAAVs concentrados diluidos en 25 μL de PBS (incluir el testigo negativo: 25 μL de PBS). Incubar durante 24 h a 37 °C en una atmósfera con 5% deCO2 . Añadir el medio acondicionado previamente almacenado e incubar durante 24 h. Deseche el medio en cada pocillo y lave 2 veces con PBS. Fije las células con 4% de PFA/4% de sacarosa en PBS, como se describe en el paso 10.1.6. Lavar 2 veces con PBS. Incubar cada pocillo con 5 μg/mL de aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugada con Alexa Fluor 633 durante 10 min a temperatura ambiente (paso opcional: realizar inmunocitoquímica en su lugar). Lavar 2 veces con PBS. Incubar en Triton X-100 al 0,25% en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Lavar con PBS. Incubar con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 min a temperatura ambiente. Lavar 2 veces con PBS. Adquiera imágenes en un microscopio de fluorescencia invertida equipado con un objetivo de 40x/0,95, o en un microscopio confocal invertido equipado con un objetivo DIC de aceite de 40x/1,4. 11. Experimentos in vivo NOTA: Los animales se alojaron en una sala con temperatura controlada, mantenida en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Se proporcionaba comida y agua ad libitum. Se hizo todo lo posible para minimizar el sufrimiento de los animales. Inyección estereotáxica en el cerebeloAnestesiar animales C57BL/6 de 9 semanas de edad por inhalación de isoflurano al 2% en presencia de oxígeno (0,8 L/min) en una cámara conectada a un vaporizador. Colocar el animal anestesiado en el aparato estereotáxico (sobre una almohadilla calentada a 35 °C) y colocar la mascarilla de isoflurano en la nariz del animal. Bajar el nivel de isoflurano a 1,3-1,7%.NOTA: Asegúrese de que el animal esté correctamente anestesiado antes de proceder (pérdida del reflejo de flexión en ambas extremidades traseras). Aplique ungüento lubricante para los ojos para evitar la sequedad de las córneas e inyecte al animal un analgésico aprobado.NOTA: Todos los pasos posteriores deben realizarse en condiciones estériles. Después de afeitar el pelaje de la cabeza del animal y desinfectar el área quirúrgica, exponer el cráneo y colocar la punta de una aguja de inyección de punta roma de 30 G, conectada a una jeringa Hamilton de 10 μL, directamente sobre bregma (use bregma como cero para el cálculo de coordenadas estereotáxicas). Mueva la aguja a la coordenada deseada y perfore un agujero a través del cráneo donde entrará la aguja.NOTA: En el marco de este estudio, se realizó una sola inyección central en el cerebelo. Inyectar 4 μL de una solución de rAAVs que contenga un total de 8 × 109 vg, diluida en PBS, a una velocidad de perfusión de 0,5 μL/min utilizando un inyector automático. Utilice las siguientes coordenadas, calculadas a partir de bregma, para realizar una sola inyección central en el cerebelo de un ratón C57BL/6 adulto: antero-posterior: -6,5 mm; lateral: 0 mm; ventral: -2,9 mm.NOTA: Estas coordenadas pueden variar según la cepa del ratón, el sexo y la edad de los animales en uso. Para minimizar el reflujo y permitir la difusión del vector viral, una vez que se complete la infusión, deje la aguja de la jeringa en estas coordenadas durante 3 minutos, luego retírela lentamente 0,3 mm y deje que permanezca en su lugar durante 2 minutos adicionales antes de su extracción completa del cerebro del ratón. Cierre la incisión y límpiela con un agente desinfectante (por ejemplo, povidona yodada al 10%). Permita que los animales se recuperen de la anestesia antes de devolverlos a sus jaulas domésticas. Recolección y preparación de tejidosNOTA: En este experimento, los niveles de transducción se observaron 12 semanas después de la inyección, pero el mismo procedimiento pudo evaluarse tan pronto como 4 semanas después de la inyección.Anestesiar terminalmente a los animales mediante la administración intraperitoneal de una sobredosis de xilacina/ketamina (8/160 mg/kg de peso corporal). Perfundir transcardialmente a los animales con PBS helado durante 6 min a una velocidad de 2,5 mL/min, seguido de la perfusión con una solución de PFA al 4% helada recién preparada durante 10 min a la misma tasa. Fije los cerebros extirpados en PFA al 4% durante la noche a temperatura ambiente y luego transfiéralos a una solución de sacarosa/PBS al 25% para la crioprotección. Una vez que los cerebros se hundan (aproximadamente 48 h después), guárdelos a -80 °C. Corte secciones sagitales seriadas con un grosor de 30 μm utilizando un criostato a -21 °C. Para cada animal, recoja 96 secciones sagitales de un hemisferio cerebral en series anatómicas como secciones flotantes en PBS suplementadas con azida de sodio al 0,05%. Almacenar a 4 °C hasta su posterior procesamiento. Inmunohistoquímica de fluorescencia estándarSeleccione ocho secciones sagitales por animal, a una distancia de 240 μm entre sí. Incubar las secciones de flotación libre en una solución de bloqueo/permeabilización (Triton X-100 al 0,1% que contiene un 10% de suero de cabra normal (NGS) en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Incubar las secciones durante la noche a 4 °C con anticuerpo primario policlonal anti-GFP de pollo (1:1.000). Lavar durante 3 x 15 min en PBS e incubar las secciones durante 2 h a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario anticuerpo policlonal anti-pollo de cabra conjugado con fluoróforo Alexa Fluor 488 (1:200). Lavar durante 3 x 15 min en PBS. Incubar con DAPI durante 5 min a temperatura ambiente. Lavar durante 3 x 15 min en PBS. Coloque las secciones en portaobjetos recubiertos de gelatina y cubra con medio de montaje de fluorescencia. Adquiera imágenes en un microscopio de fluorescencia con escáner de portaobjetos equipado con un objetivo de 20x/0,8.