Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

Miguel M. Lopes; Sara M. Lopes; Rafael Baganha; Carina Henriques; Ana C. Silva; Diana D. Lobo; Lu&#237;sa Cortes; Lu&#237;s Pereira de Almeida; Rui Jorge Nobre

doi:10.3791/66550

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Bioengineering

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

Published: April 05, 2024

doi:

10.3791/66550

Miguel M. Lopes*^1,2,3, Sara M. Lopes*^1,2,3, Rafael Baganha^1,2,4, Carina Henriques^1,2,5, Ana C. Silva^1,2,3, Diana D. Lobo^1,2,3, Luísa Cortes^1,2,3,6, Luís Pereira de Almeida*^1,2,4,5, Rui Jorge Nobre*^1,2,3,4

¹CNC-UC – Center for Neuroscience and Cell Biology,University of Coimbra, ²CIBB – Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology,University of Coimbra, ³IIIUC – Institute for Interdisciplinary Research,University of Coimbra, ⁴ViraVector – Viral Vectors for Gene Transfer Core Facility,University of Coimbra, ⁵FFUC – Faculty of Pharmacy,University of Coimbra, ⁶MICC-CNC – Microscopy Imaging Center of Coimbra – CNC,University of Coimbra

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Abstract

O vírus adeno-associado (AAV) tornou-se um vetor cada vez mais valioso para a entrega de genes in vivo e atualmente está passando por ensaios clínicos em humanos. No entanto, os métodos comumente usados para purificar AAVs fazem uso de cloreto de césio ou ultracentrifugação com gradiente de densidade de iodixanol. Apesar de suas vantagens, esses métodos são demorados, têm escalabilidade limitada e geralmente resultam em vetores com baixa pureza. Para superar essas restrições, os pesquisadores estão voltando sua atenção para as técnicas de cromatografia. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina que serve como uma etapa de captura universal para a purificação de AAVs.

Este método baseia-se na afinidade intrínseca do sorotipo 2 do AAV (AAV2) para proteoglicanos de sulfato de heparano. Especificamente, o protocolo envolve a co-transfecção de plasmídeos que codificam as proteínas desejadas do capsídeo AAV com as do AAV2, produzindo vetores AAV em mosaico que combinam as propriedades de ambos os sorotipos parentais. Resumidamente, após a lise das células produtoras, uma mistura contendo partículas de AAV é purificada diretamente seguindo um protocolo otimizado de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única usando um sistema padrão de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC). As partículas purificadas de AAV são posteriormente concentradas e submetidas a uma caracterização abrangente em termos de pureza e atividade biológica. Este protocolo oferece uma abordagem simplificada e escalável que pode ser realizada sem a necessidade de ultracentrifugação e gradientes, produzindo títulos virais limpos e altos.

Introduction

O vetor do vírus adeno-associado (AAV) está conquistando seu caminho como um dos sistemas de entrega mais promissores nos estudos atuais de terapia gênica. Inicialmente identificado em 1965¹, o AAV é um vírus pequeno, não envelopado, com um capsídeo de proteína icosaédrica de cerca de 25 nm de diâmetro, abrigando um genoma de DNA de fita simples. Os AAVs pertencem à família Parvoviridae e ao gênero Dependoparvovirus devido à sua dependência única da coinfecção com um vírus auxiliar, como o vírus herpes simplex ou, mais frequentemente, o adenovírus, para completar seu ciclo lítico ^2,3.

O genoma de 4,7 quilobases de AAVs consiste em dois quadros de leitura abertos (ORFs) flanqueados por duas repetições terminais invertidas (ITRs) que formam extremidades grampadas em forma de T características⁴. Os ITRs são os únicos elementos de ação cis críticos para empacotamento, replicação e integração de AAV, sendo, portanto, as únicas sequências de AAV retidas em vetores AAV recombinantes (rAAV). Nesse sistema, os genes necessários para a produção do vetor são fornecidos separadamente, em trans, permitindo que o gene de interesse seja empacotado dentro do capsídeo viral ^5,6.

Cada gene viral codifica proteínas diferentes por meio de splicing alternativo e códons de início. Dentro do Rep ORF, quatro proteínas não estruturais (Rep40, Rep52, Rep68 e Rep78) são codificadas, desempenhando papéis cruciais na replicação, integração específica do local e encapsídeo do DNA viral ^7,8. O Cap ORF serve como um modelo para a expressão de três proteínas estruturais que diferem umas das outras em seu terminal N (VP1, VP2 e VP3), que se reúnem para formar um capsídeo viral de 60 mer na proporção de 1:1:10 ^4,9. Além disso, uma ORF alternativa aninhada no gene Cap com um códon de início CUG não convencional codifica uma proteína ativadora de montagem (AAP). Foi demonstrado que esta proteína nuclear interage com as proteínas do capsídeo recém-sintetizadas VP1-3 e promove a montagem do capsídeo^10,11.

As diferenças na sequência de aminoácidos do capsídeo são responsáveis pelos 11 sorotipos de AAV de ocorrência natural e mais de 100 variantes isoladas de tecidos humanos e primatas não humanos ^7,12,13. Variações na conformação de regiões estruturalmente variáveis governam as propriedades antigênicas distintas e as especificidades de ligação ao receptor de capsídeos de diferentes cepas. Isso resulta em tropismos teciduais distintos e eficiências de transdução em diferentes órgãos de mamíferos¹⁴.

Os primeiros métodos de produção de rAAVs dependiam da infecção por adenovírus para fins auxiliares 15,16,17,18,19. Apesar de ser eficiente e geralmente fácil de produzir em larga escala, vários problemas surgem dessa infecção. Mesmo após a purificação e uma etapa de desnaturação por calor para inativação, as partículas adenovirais ainda podem estar presentes nas preparações de AAV, constituindo um problema de segurança indesejado²⁰. Além disso, a presença de proteínas adenovirais desnaturadas é inaceitável para uso clínico. Outras estratégias de produção aproveitam as cepas recombinantes do vírus herpes simplex projetadas para trazer o Rep / Cap e o transgene para as células-alvo²¹ ou do sistema celular baculovírus-inseto²². Embora esses sistemas ofereçam vantagens em termos de escalabilidade e compatibilidade com GMP, eles ainda enfrentam problemas semelhantes.

O método de transfecção tripla para a produção de rAAV tem sido comumente adotado para superar facilmente esses problemas. Resumidamente, a montagem do rAAV depende da transfecção transitória de células com três plasmídeos codificando para: 1) o de expressão transgênica empacotado entre os ITRs do genoma AAV2 do tipo selvagem (pITR); 2) as sequências Rep/Cap necessárias para replicação e montagem de vírion (pAAV-RC); e 3) as proteínas adenovirais mínimas (E1A, E1B, E4 e E2A) juntamente com os RNAs associados ao vírus adenovírus necessários para o efeito auxiliar (pHelper) ⁶ ^, ²⁰ ^, ²³ . Embora os métodos de transfecção de plasmídeo forneçam simplicidade e flexibilidade para a produção de rAAV em estudos pré-clínicos, esses procedimentos têm limitações em termos de escalabilidade e reprodutibilidade quando aplicados à produção em larga escala. Como uma abordagem alternativa, a produção de rAAV pode ser alcançada através do uso de linhagens celulares produtoras de AAV (de crescimento aderente e em suspensão), expressando de forma estável os genes AAV Rep / Cap ou Rep / Cap em combinação com construções vetoriais. Nesses sistemas, os genes auxiliares adenovirais são introduzidos por meio da transfecção de plasmídeos. Embora essa estratégia melhore a escalabilidade do processo de cultura celular, ela é tecnicamente complexa e demorada 21,24,25.

Em ambos os casos, as células produtoras são então lisadas e submetidas a uma ou várias etapas de purificação. Atualmente, os principais métodos de purificação de rAAVs incluem o uso de cloreto de césio (CsCl) ou centrifugação com gradiente de densidade de ultra-alta velocidade de iodixanol seguida, ou não, de técnicas de cromatografia²⁶. O esquema original de purificação para precipitação viral usava sulfato de amônio, seguido por duas ou três rodadas de ultracentrifugação através de um gradiente de CsCl. As principais vantagens desse processo incluem a possibilidade de purificar todos os sorotipos e a capacidade de separar fisicamente as partículas cheias dos capsídeos vazios com base em suas diferentes densidades. Esse método, no entanto, é elaborado, demorado e tem escalabilidade limitada, muitas vezes resultando em baixo rendimento e baixa qualidade da amostra 27,28,29,30. Além disso, a diálise contra um tampão fisiológico é muitas vezes necessária antes de estudos in vivo devido aos efeitos tóxicos que o CsCl pode exercer em mamíferos.

O iodixanol também tem sido usado como um meio de gradiente isosmótico alternativo para purificar vetores rAAV, com vantagens sobre o CsCl do ponto de vista da segurança e da potência do vetor. No entanto, como o CsCl, o método do iodixanol apresenta algumas desvantagens relacionadas à capacidade de carga do lisado de cultura celular (e, portanto, à escalabilidade da purificação do rAAV) e continua sendo um método demorado e caro^30,31.

Para superar essas restrições, os pesquisadores voltaram sua atenção para as técnicas de cromatografia. Nesse sentido, foram desenvolvidas várias abordagens de purificação que incorporam métodos de cromatografia de afinidade, hidrofóbica ou de troca iônica. Esses métodos dependem das propriedades bioquímicas de um determinado sorotipo, incluindo seus receptores naturais, ou as características de carga da partícula viral³². Por exemplo, a descoberta de que AAV2, AAV3, AAV6 e AAV13 se ligam preferencialmente a proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPG), abriu a possibilidade de usar a heparina intimamente relacionada na purificação por cromatografia de afinidade. No entanto, os sítios de ligação ao HSPG podem diferir entre os sorotipos, mediando a ligação do AAV e a infecção das células-alvo de diferentes maneiras 2,33,34,35,36. Por outro lado, AAV1, AAV5 e AAV6 se ligam ao ácido siálico ligado a N (SA), enquanto AAV4 usa SA ligado a O ^2,14,34. Seguindo o mesmo raciocínio, um protocolo de cromatografia de afinidade de etapa única para a purificação de rAAV5 também foi desenvolvido com base no uso de mucina, uma proteína de mamífero altamente enriquecida em SA³⁷. Como as técnicas à base de heparina, essa purificação também depende do sorotipo específico que está sendo gerado. Além da heparina e da mucina, outros ligantes têm sido explorados para cromatografia de afinidade, como o anticorpo monoclonal A20 e os anticorpos de domínio único de camelídeos (AVB Sepharose e POROS CaptureSelect)22,23,38,39,40,41. Outras estratégias inovadoras para melhorar os métodos de purificação previamente existentes envolvem a introdução de pequenas modificações no capsídeo do rAAV para apresentar epítopos de ligação específicos. Por exemplo, rAAVs marcados com hexa-histidina ou biotinilados podem ser purificados usando ligantes que têm como alvo esses epítopos (ácido nitrilotriacético de níquel e resinas de avidina, respectivamente) ⁴² ^, ⁴³ ^, ⁴⁴ .

Em um esforço para ampliar as características desejadas dos rAAVs, os investigadores travestiram os vírions misturando seus capsídeos. Isso é feito fornecendo o gene do capsídeo de dois sorotipos distintos de AAV em proporções equimolares ou diferentes durante a produção, dando origem a uma estrutura do capsídeo composta por uma mistura de subunidades do capsídeo de diferentes sorotipos 34,45,46,47,48,49,50. Estudos anteriores fornecem evidências físicas de que a co-expressão de proteínas do capsídeo de AAV2 com AAV1 (proporção 1:1) e AAV2 com AAV9 (proporção 1:1) resulta na geração de vetores rAAV1/2 e rAAV2/9 em mosaico, respectivamente 45,46,48. Um grande benefício da geração de rAAVs em mosaico é a capacidade de integrar características vantajosas de diferentes sorotipos de AAV, resultando em melhorias sinérgicas na expressão de transgenes e tropismo, mantendo outras propriedades úteis durante a produção de rAAV. Curiosamente, certas variantes do mosaico exibem novas propriedades diferentes de qualquer vírus parental 46,47,49. Aproveitando a capacidade de ligação à heparina do AAV2, os vetores rAAV em mosaico podem ser gerados e purificados misturando AAV2 com outros capsídeos AAV naturais ou novos gerados por evolução direcionada e / ou design racional. No entanto, estudos anteriores destacaram a importância da compatibilidade da subunidade do capsídeo ao tentar montar vetores de mosaico. Por exemplo, Rabinowitz e colegas demonstraram que, embora a transcapsídea de AAV1, AAV2 e AAV3 tenha levado a uma co-montagem eficiente de capsídeos em mosaico, o cross-dressing desses sorotipos com AAV4 impediu a geração de vírions estáveis³⁴ ^, ⁴⁵ ^, ⁴⁷ . Além disso, AAV1, AAV2 e AAV3 mostraram baixa compatibilidade com AAV5, dados os títulos virais reduzidos obtidos ao misturar esses capsídeos em diferentes proporções. Curiosamente, o mosaico rAAV2 / 5 mostrou propriedades de ligação à heparina diminuídas, mantendo a capacidade de ligação à mucina como o AAV5 parental. No entanto, o rAAV3/5 na proporção de 3:1 preservou a ligação dupla à heparina e à mucina. No geral, a geração de novos rAAVs em mosaico com transdução aprimorada, tropismo específico ou baixa imunogenicidade pode se beneficiar muito de nossa compreensão da montagem do capsídeo e das interações do receptor, com combinações específicas ainda exigindo investigação e otimização completas.

No presente trabalho, descrevemos um protocolo passo a passo para a produção e purificação de rAAVs usando um método otimizado de cromatografia de afinidade com heparina. Os rAAVs são produzidos por transfecção transitória e são purificados usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC). Após a concentração das frações purificadas selecionadas, os estoques virais resultantes são caracterizados em termos de título, pureza, propriedades físicas intrínsecas e atividade biológica in vitro e in vivo. Como prova de conceito, demonstramos as melhorias e aplicabilidade deste protocolo para a geração de vetores mosaico rAAV1/2 e rAAV2/9. A escolha de cada sorotipo foi baseada em seus tropismos notavelmente diferentes, potencialmente conferindo suas características únicas também às versões em mosaico. O sorotipo 1 do AAV, com tropismo moderado geral para o sistema nervoso central (SNC), tem a capacidade de transduzir neurônios e glia (em menor grau) e sofre transporte axonal nas direções anterógrada e retrógrada in vivo ^2,7,8. Além disso, o sorotipo 9 do AAV foi escolhido por sua capacidade natural de atravessar a barreira hematoencefálica e atingir o SNC em camundongos neonatais e adultos^51,52. Por fim, o sorotipo 2 do AAV foi selecionado devido à sua capacidade de se ligar à heparina, permitindo a cromatografia de afinidade³³. As partículas purificadas de rAAV1/2 e rAAV2/9 combinam as propriedades de ambos os sorotipos parentais de AAV e, portanto, constituem vetores adequados para a transdução do SNC 45,46,48,49.

Protocol

NOTA: Consulte a Figura 1 para obter uma ilustração resumindo o protocolo. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo. Todo o trabalho envolvendo células e vírus deve ser realizado em gabinetes e incubadoras de biossegurança dedicados, separados daqueles usados regularmente para a manutenção de linhagens celulares. O equipamento e os reagentes que entram em contacto com as células cultivadas e os vírus devem ser estéreis. É essencial que o descarte de reagentes perigosos e materiais contaminados com vírus seja realizado de acordo com as fichas de dados de segurança do material e em conformidade com as leis e diretrizes nacionais fornecidas pelo escritório de saúde e segurança ambiental de cada instituição. Em abril de 2019, as diretrizes do NIH para pesquisas envolvendo moléculas de ácido nucleico recombinantes ou sintéticos categorizam como agentes do Grupo de Risco 1 (não associados à doença em humanos adultos saudáveis) todos os sorotipos de AAV, bem como construções de AAV recombinantes ou sintéticas. Essa classificação se aplica quando o transgene não codifica um produto gênico potencialmente tumorigênico ou uma toxina, e as construções são produzidas sem um vírus auxiliar. Todas as experiências envolvendo animais foram realizadas em conformidade com a diretiva da Comunidade Europeia (2010/63/UE) para o cuidado e utilização de animais de laboratório, transposta para a lei portuguesa em 2013 (Decreto-Lei 113/2013). Adicionalmente, os procedimentos em animais foram aprovados pela Organização Responsável pelo Bem-Estar Animal da Faculdade de Medicina e pelo biotério licenciado do Centro de Neurociências e Biologia Celular da Universidade de Coimbra. Os investigadores receberam formação adequada (curso certificado pela FELASA) e certificação das autoridades portuguesas (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lisboa, Portugal) para a realização das experiências. 1. Construções de plasmídeo Siga as instruções do fabricante de um kit livre de endotoxinas maxiprep para isolar e purificar quantidades substanciais de DNA dos seguintes plasmídeos: i) pITR: o vetor de transferência de interesse; ii) plasmídeo pAAV-RC: pRV1, contendo as sequências AAV2 Rep e Cap 36; iii) plasmídeo pAAV-RC: pH21, contendo as sequências AAV1 Rep e Cap 36; iv) plasmídeo pAAV-RC: pAAV2/9n, contendo as sequências AAV2 Rep e AAV9 Cap ; v) pHelper: pFdelta6, plasmídeo auxiliar de adenovírus36. Examine a integridade dos plasmídeos gerados executando as restrições enzimáticas recomendadas36. Monitore a integridade dos plasmídeos pITR por digestão com SmaI, uma endonuclease de restrição, que corta duas vezes dentro de uma porção instável dos ITRs53,54.NOTA: Como os ITRs são altamente instáveis e suscetíveis a deleções, recomenda-se o uso de células supercompetentes SURE 2 para minimizar a recombinação nesses locais. 2. Cultura celular Cultura de rim embrionário humano 293, expressando de forma estável a linhagem celular do antígeno T grande SV40 (HEK293T) em alta glicose Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, suplementada com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina, a 37 °C, sob atmosfera umidificada contendo 5% de CO2, como ponto de partida para as etapas subsequentes. Subcultive as células usando solução salina 1x tamponada com fosfato (PBS) estéril, pH 7,4, para lavar as células antes de adicionar 0,05% de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA).NOTA: Evite utilizar células que tenham sofrido um número excessivo de passagens (máximo de 20). Teste regularmente as culturas de células para contaminação por micoplasma. 3. Produção de rAAV por transfecção transitória Dia 1: Revestimento celularPara cada produção viral, colocar HEK293T células em 10 placas de cultura tratadas (15 cm de diâmetro) no dia anterior à transfecção, a uma densidade de 10,5 × 106 células por placa em 22 mL de meio de cultura suplementado e incubar por 24 h até que as células estejam 70%-80% confluentes e prontas para a transfecção. Dia 2: Transfecção celular usando polietilenimina (PEI)Para cada produção viral (equivalente a 10,5 pratos), configure a seguinte mistura de transfecção em um tubo de microcentrífuga: 54,6 μg de pITR; 45,675 μg de pRV1; 45,675 μg de pH21 ou pAAV2/9n; 109,2 μg de pFdelta6. Misture batendo. Adicione a mistura a 4.557 mL de DMEM não suplementado em um tubo de centrífuga de 50 mL. Misture batendo. Adicione 1,365 mL de solução estéril de PEI a 1 mg / mL (pH 7,4), gota a gota. Misture batendo. Incubar por 10 min em temperatura ambiente para permitir a formação de complexos DNA-PEI. Adicione esta mistura a 231 mL de DMEM suplementado pré-aquecido. Substitua todo o meio de cultura de cada placa por 22 mL desta mistura de transfecção. Incubar as células durante 48 h.NOTA: Esta etapa deve ser realizada com cuidado para evitar o descolamento celular. Dia 4: Colheita de célulasQuando o pITR codifica um repórter fluorescente, visualize as células transfectadas sob um microscópio de fluorescência. Recolha o meio de cada placa em tubos de centrifugação de 50 ml e centrifugue-os a 800 × g durante 10 min. Descarte o sobrenadante.NOTA: Esta etapa é opcional e visa recuperar células transfectadas que podem ter se desprendido devido a uma confluência muito alta. Adicione 10 mL de PBS pré-aquecido a cada placa. Remova cuidadosamente as células com um raspador de células e recolha a suspensão nos tubos de centrifugação de 50 mL da etapa 3.3.2. Lave 5 pratos de cada vez com mais 10 mL de PBS e transfira a suspensão para os tubos de centrífuga de 50 mL da etapa 3.3.3. Pulverizar as células a 800 × g durante 10 min e rejeitar o sobrenadante. Congelar os grânulos celulares a -80 °C.NOTA: Os pellets celulares podem ser armazenados por vários meses (ponto de pausa). 4. extração de rAAV e purificação de FPLC Dia 5: Preparação do lisado celularDescongele os pellets celulares à temperatura ambiente. Ressuspenda as células coletadas dos 10 pratos em 100 mL de um tampão estéril contendo 150 mM de cloreto de sódio (NaCl) e 20 mM de Tris, pH 8,0, em água ultrapura (tipo I). Misture a suspensão pipetando para cima e para baixo, para garantir uma suspensão homogênea. Adicione 12,5 mL de uma solução estéril recém-preparada de desoxicolato de sódio a 10% em água ultrapura para induzir a lise celular. Misture pipetando para cima e para baixo.NOTA: Descarte o desoxicolato de sódio, bem como os materiais em contato com ele, de acordo com a ficha de dados de segurança do material e as orientações fornecidas pelo escritório de saúde e segurança ambiental da instituição. Também é recomendável usar uma máscara facial ao manusear este pó. Após a mistura, a solução torna-se altamente viscosa. Adicione 27 μL de nuclease de benzonase à mistura anterior. Misture bem pipetando para cima e para baixo até que a amostra não seja mais viscosa. Incubar a 37 °C por 1 h, realizando um vórtice a cada 10 min.NOTA: Esta endonuclease é capaz de degradar eficientemente todas as formas de DNA e RNA sem exibir qualquer atividade proteolítica. Remover os detritos celulares centrifugando a mistura a 3.000 × g durante 60 min a 25 °C. Filtrar o sobrenadante com um filtro de seringa estéril de difluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,45 μm e transferi-lo para um novo recipiente estéril.NOTA: Esta etapa importante garante que a maior parte dos detritos celulares seja removida, evitando assim o entupimento das colunas de cromatografia. Guarde uma pequena alíquota desta mistura para análise (etapa opcional). Dia 5 (continuação): Purificação da coluna de heparina de rAAVsNOTA: A aplicação da amostra pode ser realizada usando uma bomba de amostra ou um superloop de 50 mL ou 150 mL como parte do sistema. Como mais ar é dissolvido em temperaturas mais baixas, é importante dar tempo suficiente para que os tampões e soluções (geralmente armazenados a 4 °C) se aclimatem à temperatura ambiente antes de serem usados no sistema FPLC.Opcional: Se o sistema tiver sido armazenado por longos períodos, encha o sistema e todas as entradas com solução de armazenamento recém-preparada (etanol a 20%) usando instruções manuais ou um método predefinido de limpeza do sistema (CIP do sistema). Lave completamente o caminho do fluxo do líquido com água ultrapura estéril usando instruções manuais ou um método CIP de sistema predefinido. Conecte uma coluna de heparina pré-embalada de 1 mL, defina o alarme de pressão e lave com cinco volumes de coluna (CVs) de água ultrapura a uma vazão de 1 mL / min. Troque as soluções na bandeja tampão de água ultrapura para tampão A (solução estéril de NaCl 100 mM e Tris 20 mM, pH 8, em água ultrapura) para entrada A (bomba do sistema A) e para tampão B (solução estéril de NaCl 500 mM e Tris 20 mM, pH 8, em água ultrapura) para entrada B (bomba do sistema B). Se o sistema tiver uma bomba de amostra, coloque a entrada tampão da válvula de entrada de amostra no tampão A. Lave a bomba do sistema B com o tampão B e encha o restante do caminho do fluxo de líquido com o tampão A.NOTA: Se necessário, desconecte a coluna do caminho do fluxo e reconecte-a posteriormente. Insira um sample tubo de entrada da válvula de entrada de samp, por exemplo, S1, no recipiente com a preparação viral obtida na etapa 4.1.4. (da preparação do lisado celular). Prepare o caminho do fluxo da entrada de amostra S1 para a válvula de injeção com a solução de amostra. Em alternativa, encha um superloop de 50 ml ou 150 ml com a amostra contendo rAAVs utilizando uma seringa de 50 ml. Equilibre a coluna com um volume total de cinco CVs usando 12,5% do tampão B a uma taxa de 1 mL / min. Aplique o volume total da amostra na coluna usando a bomba de amostra (selecione injetar toda a amostra usando o sensor de ar) ou o superloop a 0,5 mL/min e colete o fluxo usando a porta de saída em um novo recipiente estéril.NOTA: Quando o controle de fluxo para evitar o recurso de sobrepressão estiver ativado, o fluxo diminuirá automaticamente em caso de entupimento da coluna. Se a taxa de fluxo cair significativamente abaixo de 0,5 mL / min, interrompa a aplicação da amostra, execute uma lavagem com 2-5 CVs de tampão A e, em seguida, retome a aplicação da amostra. Lave a coluna a 1 mL/min com 20 CVs de tampão A, coletando o fluxo usando a porta de saída. Eluir a amostra a 1 mL/min com o seguinte esquema: i) gradiente linear com meta de 50% do tampão B para cinco CVs; ii) escalar com uma meta de 90% do buffer B durante cinco CVs; iii) escalar com uma meta de 100% do buffer B durante cinco CVs. Coletar a amostra eluída em frações de 1 mL usando um coletor de frações e tubos de microcentrífuga de baixa retenção (2 mL) e armazená-los a -20 °C.NOTA: As frações rAAV podem ser armazenadas por várias semanas (ponto de pausa). Reequilibre a coluna a 1 mL / min com 12,5% do tampão B para cinco CVs. Mude as entradas das soluções tampão para água ultrapura e lave a coluna a 1 mL / min por cinco CVs. Mude as entradas de água ultrapura para etanol a 20% e lave a coluna a 1 mL/min por cinco CVs. Desconecte a coluna e armazene-a a 4 °C.NOTA: As colunas podem ser reutilizadas várias vezes sem nenhum outro procedimento importante de limpeza e higienização se o mesmo sorotipo e transgene rAAV forem usados. Lave completamente o caminho do fluxo do líquido com etanol a 20% usando instruções manuais ou um método CIP de sistema predefinido. 5. Concentração de rAAVs purificados Dia 6: Etapa de concentração 1Concentre os rAAVs usando uma unidade de filtro centrífugo de 15 mL com um corte de peso molecular de 100 kDa. Carregue as frações desejadas contendo rAAVs (frações FPLC 7 a 16) na unidade de filtro centrífugo de 15 mL e centrifugue-a a 2.000 × g por 2 min em temperatura ambiente. Certifique-se de que o volume concentrado na unidade de filtro seja de aproximadamente 500 μL. Se o volume concentrado exceder em grande parte 500 μL, repita as etapas de centrifugação em intervalos de 1 minuto até atingir o volume desejado. Dia 6 (continuação): Troca de bufferAdicione 1 mL de PBS estéril à unidade de filtro centrífugo que contém os rAAVs. Pipete cuidadosamente para cima e para baixo para lavar o filtro. Centrifugue a 2.000 × g em intervalos de 1 min até atingir o volume final de 500 μL. Dia 6 (continuação): Etapa de concentração 2Transfira os 500 μL de rAAVs concentrados obtidos na etapa anterior para uma unidade de filtro centrífugo de 0,5 mL com um corte de peso molecular de 100 kDa e centrifugue a 6.000 × g por 1 min. Se necessário, repita a etapa de centrifugação até atingir um volume final inferior a 100 μL. Dia 6 (continuação): RecuperaçãoPara recuperar o rAAV concentrado, coloque o dispositivo de filtro de cabeça para baixo em um novo tubo de coleta de microcentrífuga. Coloque o tubo em uma microcentrífuga com a tampa voltada para o centro e execute uma centrifugação prolongada dentro da câmara de fluxo para transferir rAAVs concentrados do dispositivo para o tubo da microcentrífuga. Alternativamente, centrifugue a 1.000 × g por 2 min. Suplemento com Pluronic F-68 estéril 0,001% (opcional).NOTA: O Pluronic F-68 é um surfactante não iônico aprovado para uso humano pela Food and Drug Administration que é capaz de mitigar as perdas de rAAVs, evitando suas interações com as superfícies dos materiais (plásticos) usados durante a preparação da diluição, carregamento da seringa e equipamento de entrega55,56. Alíquotas de rAAVs em tubos de microcentrífuga de baixa retenção e armazená-los a -80 °C (ponto de pausa). 6. Quantificação dos rAAVs purificados Dia 6 (continuação): Determine o título das preparações de rAAV, expresso em genomas virais / μL (vg / μL), por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) usando um kit comercial e seguindo as instruções do fabricante.Incubar a solução de partículas rAAV com DNase I a 37 °C durante 20 min.NOTA: Este procedimento promove a digestão do DNA genômico livre e do DNA plasmidial derivado das células hospedeiras, garantindo assim que apenas a sequência de ácidos nucleicos dentro das partículas intactas de rAAV seja preservada. Inativar o calor da DNase I a 95 °C durante 10 min. Adicione o tampão de lise e incube por 10 min a 70 ° C para promover a desnaturação por calor das proteínas das partículas de rAAV. Diluir a solução do genoma do rAAV obtida em tampão de diluição antes de proceder à RT-qPCR. Preparar um conjunto de padrões diluídos em série do controlo positivo (de 2 × 107 vg/μL a 2 × 102 vg/μL) fornecido com o kit. Realize uma mistura de reação contendo 12,5 μL de mistura de Taq II, 0,5 μL de mistura de primer diluído, 7 μL de água e 5 μL do DNA rAAV diluído (amostra de AAV desconhecida e padrões da etapa 6.1.4.). Realize o RT-qPCR em um sistema de detecção de PCR em tempo real, usando o seguinte protocolo: 1 ciclo a 95 °C por 2 min (desnaturação inicial) e 40 ciclos a 95 °C por 5 s (desnaturação) e 60 °C por 30 s (recozimento, extensão e leitura da placa), seguido de uma análise da curva de fusão. Calcular a concentração absoluta da amostra a partir da curva padrão (linha de regressão linear), considerando o factor de diluição resultante da preparação da amostra rAAV.NOTA: A quantificação do número de genomas virais é obtida através da amplificação da sequência ITR de AAV2 (sequência alvo dos primers fornecidos pelo kit). 7. SDS-PAGE, coloração azul de Coomassie e western blot Desnaturar 40 μL de cada amostra (cada fração FPLC; o fluxo; as amostras pré-coluna e um total de 2,3 × 1010 vg do produto concentrado final) adicionando 6x tampão de amostra (0,5 M Tris-HCl / 0,4% de dodecil sulfato de sódio (SDS) pH 6,8, 30% de glicerol, 10% de SDS, 0,6 M de ditiotreitol (DTT), 0,012% de azul de bromofenol) e incubando as amostras por 5 min a 95 ° C. Carregue as amostras desnaturadas (48 μL) em um gel de poliacrilamida SDS (4% de empilhamento e 10% de gel de resolução) e execute a separação eletroforética a 100 V por 70 min, adjacente a uma escada de proteínas. Análise de proteínasNOTA: A coloração azul de Coomassie ou western blotting pode ser realizada.Coloração azul de CoomassiePara visualizar as bandas de proteínas, core o gel por 10 min com uma solução de azul de Coomassie G250 a 0,25% dissolvida em 50% de metanol e 10% de ácido acético glacial. Realize a descoloração do gel lavando-o várias vezes com uma solução contendo 25% de metanol e 5% de ácido acético glacial até que faixas claras com fundo baixo se tornem visíveis. Capture imagens usando um sistema de imagem apropriado. Western blotTransfira as proteínas para uma membrana de PVDF de acordo com os protocolos padrão. Bloqueie a membrana por incubação em 5% de leite desnatado diluído em TBS-T (0,1% Tween 20 em solução salina tamponada com Tris) por 1 h em temperatura ambiente. Utilizar os seguintes anticorpos primários (diluídos em solução de bloqueio) para a incubação durante a noite a 4 °C: anticorpo monoclonal de ratinho anti-AAV, VP1, VP2, anticorpo VP3 (B1, 1:1.000) ou anticorpo monoclonal de ratinho anti-AAV, VP1, anticorpo VP2 (A69, 1:1.000). Lave as membranas por 3 x 15 min em TBS-T e incube com um anticorpo secundário anti-camundongo de cabra ligado à fosfatase alcalina (1:10.000), por 2 h em temperatura ambiente. Lave as membranas por 3 x 15 min em TBS-T. Adicione substrato quimiofluorescente aprimorado (ECF) e visualize bandas de proteínas por imagem de quimiofluorescência. 8. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) Coloque uma grade de malha 200 revestida com carbono Formvar de cabeça para baixo em cima de uma gota de uma amostra de rAAV e deixe repousar por 1 min. Lave as grades em uma gota d’água e seque o excesso de líquido com papel de filtro. Pinte negativamente as grades com solução de acetato de uranila a 1% (pH 7) por 1 min para fixar e contrastar as partículas virais. Lave as grades em uma gota d’água e seque o excesso de líquido com papel de filtro. Examinar as amostras num microscópio electrónico de transmissão.NOTA: Altas concentrações de sal podem afetar diretamente a ligação de rAAVs à grade e levar à visualização de estruturas semelhantes a cristais. 9. Absorção consecutiva de luz ultravioleta-visível, dispersão de luz estática e análise dinâmica de dispersão de luz Em uma placa de quantificação de 96 poços, carregue 2 μL de uma amostra de rAAV e 2 μL de PBS para ser usado como tampão em branco (faça isso em duplicatas). Use o aplicativo AAV Quant no software de análise Client, coloque os nomes das amostras no local correto da placa, selecione o sorotipo AAV e clique em Avançar. Carregue a placa de quantificação de 96 poços no equipamento dedicado e prossiga com a leitura da placa para aquisição de dados. 10. Ensaios de transdução in vitro Diferentes linhagens celulares podem ser usadas para analisar rapidamente a eficiência de transdução de rAAVs.Semeie uniformemente células HEK293T em placas de 24 poços (a uma densidade de 137.500 células/poço) e uma linha celular de neuroblastoma-2A de camundongo (Neuro2a) em placas de 24 poços (50.000 células/poço) ou em uma lâmina de câmara de 8 poços (27.000 células/poço), usando DMEM alto glicose, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina, conforme descrito acima. Deixe as células aderirem durante a noite a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Colete o meio condicionado de cada poço (250 μL de placas de 24 poços e 50 μL da lâmina da câmara de 8 poços) e armazene-o a 4 ° C para uso posterior. Adicionar as seguintes preparações de rAAV a cada alvéolo e incubar as células durante 24 h a 37 °C numa atmosfera de CO2 a 5%.Adicione 50 μL das frações F2-F16 coletadas por FPLC e flua para HEK293T células plaqueadas em placas de 24 poços. Adicione um total de 5,5 × 109 vg dos rAAVs concentrados diluídos em 50 μL de PBS às células Neuro2a semeadas em placas de 24 poços (inclua um poço de controle negativo, adicionando 50 μL de PBS às células). Adicione um total de 2,75 × 109 vg dos rAAVs concentrados diluídos em 25 μL de PBS às células Neuro2a semeadas em uma lâmina de câmara de 8 poços (inclua a condição de controle negativo, adicionando 50 μL de PBS às células). Adicionar o meio condicionado previamente armazenado (passo 10.1.2) a cada alvéolo e incubar durante 24 h. Descarte o meio e lave as células 2x com PBS. Adicione uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4%, suplementada com sacarose a 4% em PBS, pré-aquecida a 37 °C, a cada poço e incube em temperatura ambiente por 20 min. Lave 2x com PBS e armazene a 4 °C até que a imagem seja realizada (ponto de pausa). Adquira imagens em um microscópio de fluorescência invertida equipado com uma objetiva de 10x/0,30 ou um microscópio confocal invertido equipado com uma objetiva de 40x/1,4 Oil DIC. Para ter um modelo mais relevante e reflexivo do ambiente in vivo , use culturas neuronais primárias da seguinte forma:Preparar culturas primárias de neurônios corticais conforme descrito anteriormente por Santos et al.57. Resumidamente, semear 200.000 células/mL em placas de 12 poços e mantê-las em cultura até o dia in vitro 16. Coletar meio condicionado de cada alvéolo (100 μL) e armazená-lo a 4 °C para uso posterior. Adicione os rAAVs a serem testados a cada poço: um total de 2,75 × 109 vg dos rAAVs concentrados diluídos em 25 μL de PBS (inclua o controle negativo: 25 μL de PBS). Incubar durante 24 h a 37 °C numa atmosfera de CO2 a 5%. Adicionar o meio condicionado previamente armazenado e incubar durante 24 h. Descarte o meio em cada poço e lave 2x com PBS. Fixe as células com 4% de PFA/4% de sacarose em PBS, conforme descrito na etapa 10.1.6. Lave 2x com PBS. Incube cada poço com 5 μg/mL de aglutinina de gérmen de trigo (WGA) conjugada com Alexa Fluor 633 por 10 min em temperatura ambiente (etapa opcional: execute imunocitoquímica). Lave 2x com PBS. Incube em 0,25% Triton X-100 em PBS por 5 min em temperatura ambiente. Lave com PBS. Incubar com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 5 min em temperatura ambiente. Lave 2x com PBS. Adquira imagens em um microscópio de fluorescência invertida equipado com uma objetiva de 40x/0,95 ou um microscópio confocal invertido equipado com uma objetiva de 40x/1,4 Oil DIC. 11. Experimentos in vivo NOTA: Os animais foram alojados em sala com temperatura controlada, mantida em ciclo claro/escuro de 12 h. Comida e água foram fornecidas ad libitum. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal. Injeção estereotáxica no cerebeloAnestesiar animais C57BL/6 com 9 semanas de idade por inalação de isoflurano a 2% na presença de oxigênio (0,8 L/min) em uma câmara conectada a um vaporizador. Coloque o animal anestesiado no aparelho estereotáxico (em uma almofada aquecida a 35 °C) e coloque a máscara de isoflurano no nariz do animal. Diminua o nível de isoflurano para 1,3-1,7%.NOTA: Certifique-se de que o animal esteja corretamente anestesiado antes de prosseguir (perda do reflexo de flexão em ambos os membros posteriores). Aplique pomada lubrificante para os olhos para evitar o ressecamento das córneas e injete no animal um analgésico aprovado.NOTA: Todas as etapas subsequentes devem ser executadas em condições estéreis. Após raspar o pelo da cabeça do animal e desinfetar a área cirúrgica, expor o crânio e colocar a ponta de uma agulha injetável de ponta romba 30 G, conectada a uma seringa Hamilton de 10 μL, diretamente sobre o bregma (usar bregma como zero para o cálculo das coordenadas estereotáxicas). Mova a agulha para a coordenada pretendida e faça um furo no crânio por onde a agulha entrará.NOTA: No âmbito deste estudo, uma única injeção foi realizada centralmente no cerebelo. Injetar 4 μL de uma solução de rAAVs contendo um total de 8 × 109 vg, diluída em PBS, a uma taxa de infusão de 0,5 μL / min usando um injetor automático. Use as seguintes coordenadas, calculadas a partir de bregma, para realizar uma única injeção centralmente no cerebelo de um camundongo C57BL/6 adulto: ântero-posterior: -6,5 mm; lateral: 0 mm; ventral: -2,9 mm.NOTA: Essas coordenadas podem variar de acordo com a cepa do camundongo, sexo e idade dos animais em uso. Para minimizar o refluxo e permitir a difusão do vetor viral, uma vez concluída a infusão, deixe a agulha da seringa nessas coordenadas por 3 minutos, depois retraia-a lentamente em 0,3 mm e deixe-a permanecer no lugar por mais 2 minutos antes de sua remoção completa do cérebro do camundongo. Feche a incisão e limpe-a com um agente desinfetante (por exemplo, iodopovidona a 10%). Permita que os animais se recuperem da anestesia antes de devolvê-los às gaiolas de origem. Coleta e preparação de tecidosNOTA: Neste experimento, os níveis de transdução foram observados 12 semanas após a injeção, mas o mesmo procedimento pôde ser avaliado assim que 4 semanas após a injeção.Anestesiar terminalmente os animais por administração intraperitoneal de uma overdose de xilazina / cetamina (8/160 mg / kg de peso corporal). Perfundir transcardialmente os animais com PBS gelado por 6 min a uma taxa de 2,5 mL/min, seguido pela perfusão com uma solução gelada de PFA a 4% recém-preparada por 10 min na mesma taxa. Fixe os cérebros excisados em PFA a 4% durante a noite à temperatura ambiente e, em seguida, transfira-os para uma solução de sacarose / PBS a 25% para crioproteção. Quando os cérebros afundarem (aproximadamente 48 h depois), armazene-os a -80 °C. Cortar secções sagitais em série com uma espessura de 30 μm utilizando um criostato a -21 °C. Para cada animal, colete 96 cortes sagitais de um hemisfério cerebral em séries anatômicas como cortes flutuantes em PBS suplementado com 0,05% de azida de sódio. Conservar a 4 °C até tratamento posterior. Imuno-histoquímica de fluorescência padrãoSelecione oito cortes sagitais por animal, a uma distância de 240 μm um do outro. Incube as seções flutuantes em solução de bloqueio / permeabilização (0,1% Triton X-100 contendo 10% de soro de cabra normal (NGS) em PBS) por 1 h em temperatura ambiente. Incubar as secções durante a noite a 4 °C com anticorpo primário anti-GFP policlonal de galinha (1:1.000). Lave por 3 x 15 min em PBS e incube as seções por 2 h em temperatura ambiente com o anticorpo secundário anticorpo anti-frango policlonal de cabra conjugado ao fluoróforo Alexa Fluor 488 (1:200). Lave por 3 x 15 min em PBS. Incubar com DAPI por 5 min em temperatura ambiente. Lave por 3 x 15 min em PBS. Coloque as seções em lâminas revestidas de gelatina e lamínula com meio de montagem de fluorescência. Adquira imagens em um microscópio de fluorescência com scanner de lâminas equipado com uma objetiva de 20x/0,8.

Representative Results

Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para a produção, purificação e caracterização de rAAVs em mosaico (resumidos na Figura 1), que têm o potencial de atingir e transduzir o SNC (por exemplo , AAV1 e AAV9), sendo simultaneamente adequados para purificação por cromatografia de afinidade com heparina (AAV2). Para isso, capsídeos dos sorotipos 1, 2 e 9 naturais do AAV foram usados para desenvolver vetores em mosaico rAAV1/2 e rAAV2/9. Antes de começar, as preparações de plasmídeo foram examinadas quanto à integridade estrutural. Além das digestões necessárias para validar a inserção correta de fragmentos de clonagem, é essencial rastrear consistentemente os plasmídeos pITR para detectar possíveis deleções/inserções de ITR. Como exemplo, a integridade de ITRs em diferentes clones de um plasmídeo pITR foi monitorada após a digestão do plasmídeo com a enzima de restrição SmaI (Figura Suplementar S1). Ambos os tipos de vetores de mosaico foram gerados pela co-transfecção dos respectivos plasmídeos do capsídeo AAV na proporção de 1:1, de acordo com os métodos de transfecção padrão6. Resumidamente, HEK293T células foram transfectadas com i) um plasmídeo contendo o transgene de interesse empacotado entre as sequências ITR (pITR), ii) um plasmídeo contendo o genoma AAV do tipo selvagem Rep e Cap ORFs de AAV2 e AAV1 ou AAV9 (plasmídeos pAAV-RC) e iii) um plasmídeo que codifica as proteínas adenovirais (E1A, E1B, E4 e E2A), bem como os RNAs associados ao vírus adenovírus essenciais para funções auxiliares (pHelper). Quarenta e oito horas depois, as células foram colhidas 6,36 e os rAAVs foram purificados do homogeneizado celular por cromatografia de afinidade usando um sistema FPLC. Conforme ilustrado na Figura 2A, após o equilíbrio da coluna (etapa de equilíbrio), o lisado celular contendo os rAAVs foi aplicado à coluna (carregamento da amostra). Devido à afinidade natural do rAAV2 pela heparina33, os rAAVs se ligaram à resina da coluna, enquanto outros componentes foram realizados no tampão de corrida e detectados pelo monitor UV (flowthrough), resultando em um aumento na absorbância. A coluna foi posteriormente lavada (etapa de lavagem) e os rAAVs foram finalmente eluídos por um aumento da concentração de NaCl (etapa de eluição). Os vírus eluídos foram detectados pelo monitor UV e coletados em frações de 1 mL. Um perfil de pico de eluição representativo de rAAV1/2 e rAAV2/9 é mostrado na Figura 2B e na Figura Suplementar S2A, respectivamente, com diferentes lotes virais apresentando consistentemente um único pico começando na fração F7 até F16. A altura do pico é variável entre as produções de rAAV, com picos mais altos geralmente levando a maiores rendimentos de rAAV. Cada fração do rAAV1/2 e rAAV2/9 produzidos foi posteriormente caracterizada por RT-qPCR para avaliar os títulos virais (Figura 2C e Figura Suplementar S2B). Para caracterizar a pureza do material eluído, 40 μL de cada fração e do respectivo escoamento foram examinados por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS a 10% (Figura 2D para rAAV1/2 e Figura Suplementar S2C para rAAV2/9). A coloração com azul de Coomassie revelou três bandas principais nas frações F7-F16, com pesos moleculares correspondentes às proteínas do capsídeo VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) e VP3 (62 kDa) dos AAVs nas proporções apropriadas de 1:1:10, conforme descrito anteriormente por Van Vliet e colegas14. Em ambos os casos, e com base na absorbância de UV, RT-qPCR e intensidade da banda de gel, fica claro que a maioria dos rAAVs em mosaico está presente nas frações F7 e F8 e começa a diminuir gradualmente nas frações F9-F16. Além das três proteínas virais do capsídeo, outra proteína (ou proteínas) de aproximadamente 17 kDa de tamanho foi/foram detectadas nas frações F8-F16. Para eliminar a(s) proteína(s) copurificadora(s), as frações F7-16 foram posteriormente filtradas e concentradas usando unidades de filtro centrífugo de 100 KDa e o título final de rAAV foi determinado por RT-qPCR (conforme mostrado na Figura 3A, B para rAAV1/2). O rendimento final de uma produção de rAAV depende do comprimento e complexidade do pITR, da integridade das sequências de ITR, das condições de cultura de células (por exemplo, número de passagens celulares) e da eficiência de transfecção 24,58,59,60,61. No entanto, o título final pode ser ajustado realizando várias centrifugações da preparação de rAAV usando unidades de filtro centrífugo de 0,5 mL (etapa de concentração 2). Seguindo este protocolo, para um volume final na faixa de 50 a 100 μL, as concentrações são geralmente compreendidas entre 2 × 109 e 5 × 1010 vg/μL (quantificação realizada usando o kit de titulação referenciado). A pureza das preparações finais de rAAV foi então avaliada em um gel de poliacrilamida SDS a 10%. Conforme ilustrado na Figura 3C, apenas três bandas representando as proteínas do capsídeo rAAVs foram observadas para a preparação de rAAV1/2 e nenhuma proteína copurificadora detectável foi identificada. Esses resultados foram consistentes com os obtidos para rAAV2/9 (Figura Suplementar S2C). Para confirmar a identidade e caracterizar ainda mais a pureza dos vetores rAAV1/2 e rAAV2/9, as frações virais e os estoques concentrados foram analisados por western blot, com os anticorpos específicos B1 (Figura Suplementar S3A e Figura Suplementar S4A) e A69 (Figura Suplementar S3B e Figura Suplementar S4B). Enquanto o anticorpo B1 reconhece um epítopo C-terminal comum a todas as proteínas VP da maioria dos sorotipos62 de AAV, o clone A69 reconhece apenas epítopos de VP1 e VP263. No entanto, algumas bandas fracas com pesos moleculares inferiores a VP3 (<62 kDa) também podem ser detectadas na marcação B1 e A69. Para caracterizar a morfologia estrutural e avaliar ainda mais a pureza dos rAAVs, as partículas virais foram visualizadas diretamente por TEM. Essa técnica tem sido o procedimento padrão para avaliar a integridade e pureza da amostra em amostras virais, pois permite a quantificação de partículas vazias e cheias de rAAV, bem como a avaliação da contaminação em uma amostra 29,64,65,66,67. Como mostrado na Figura 3D, grandes quantidades de partículas de rAAV, ~ 25 nm de diâmetro, podem ser observadas em um fundo limpo. Partículas vazias (seta preta) com um centro denso em elétrons, bem como vetores completos (seta branca) também puderam ser observados em todo o campo amostral. Também realizamos o controle de qualidade dos rAAVs purificados usando Stunner, uma plataforma que combina espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis), espalhamento de luz estático (SLS) e espalhamento dinâmico de luz (DLS) 68 . Para cada amostra, a quantidade total de proteína, ssDNA, bem como impurezas absorventes e turbidez de fundo, foram medidas por espectroscopia UV-Vis (Figura 3E e Figura Suplementar S5A). SLS e DLS foram então aplicados para avaliar o comportamento de espalhamento de luz dos capsídeos rAAV. Dado que os AAVs têm um diâmetro médio de 25 nm, as partículas dentro de uma faixa de diâmetro de 15-45 nm são consideradas intactas. Partículas maiores normalmente representam agregados virais, e tudo o que é menor compreende provavelmente partículas pequenas, incluindo proteínas do capsídeo desmontadas68. Para rAAV1/2, um único pico correspondente a partículas intactas do capsídeo foi observado a 30 nm (Figura 3F), com 0% de intensidade agregada e 0% de intensidade de partículas pequenas. Para a preparação de rAAV2/9, também foi detectado um pico a 30 nm, representando uma intensidade de capsídeo de 78% (Figura Suplementar S5B). Embora a intensidade de partículas pequenas tenha sido de 0%, para esta amostra, foi medida uma intensidade agregada de 22% (representada em cinza), com a maior contribuição (19,9%) de agregados grandes com diâmetro médio de 620 nm (Figura Suplementar S5B). Por meio da combinação de espectroscopia UV-Vis com informações de SLS e DLS, Stunner revelou o título total geral do capsídeo, título completo do capsídeo, proteína livre e agregada, bem como ssDNA livre e agregado para as duas preparações virais, mostradas na Figura 3G e na Figura Suplementar S5C (valores específicos indicados em cada legenda da figura). Paralelamente, para avaliar a atividade biológica dos vetores AAV em mosaico desenvolvidos, HEK293T células foram infectadas com 50 μL de cada fração obtida por FPLC (F2-F16) da preparação rAAV1/2 ou rAAV2/9. Uma vez que o vetor rAAV1/2 codifica uma proteína fluorescente verde de fita simples (GFP), sob o controle de um promotor de CMV (pAAV-CMV-ssGFP), e o vetor rAAV2/9 codifica uma GFP auto-complementar, sob o controle do promotor de CMV (PAAV-CMV-SCGFP53), A FLUORESCÊNCIA DIRETA DE GFP FOI EXAMINADA NESSAS CÉLULAS 48 HORAS APÓS A INFECÇÃO (Figura Suplementar S6 e Figura Suplementar S7). Consistente com as observações anteriores para RT-qPCR, azul de Coomassie e western blot, o maior nível de infectividade foi alcançado para as frações virais F7 e F8, diminuindo gradualmente nas frações F9 a F16. Para confirmar se a atividade biológica dos rAAVs foi mantida após as etapas de ultrafiltração e concentração, as células Neuro2A, plaqueadas em placas de 24 poços e em uma lâmina de câmara de 8 poços, foram infectadas com o vetor rAAV1/2 concentrado, codificando scGFP sob o controle do promotor do CMV (PAAV-CMV-SCGFP53). As imagens de campo claro e fluorescência foram adquiridas 48 h após a infecção (Figura 4A,B para imagens de alta resolução). Com o objetivo de explorar a capacidade infecciosa dos rAAVs produzidos em um modelo celular mais relevante e reflexivo, culturas neuronais primárias semidensas do córtex foram semeadas em uma placa de 12 poços e infectadas com o rAAV1/2 – CMV-scGFP usado anteriormente. Quarenta e oito horas após a infecção, as células foram fixadas e marcadas com DAPI e WGA conjugadas com Alexa Fluor 633, uma lectina amplamente utilizada para rotular células fixas. As imagens mostradas na Figura 4C,D foram adquiridas com um Zeiss Axio Observer Z1 e em um LSM 710 confocal Zeiss. Conforme representado nessas figuras pela fluorescência direta de GFP, os vírus do mosaico concentrado preservam suas propriedades de transferência de genes para as células neuronais. Tendo caracterizado os rAAVs em mosaico em termos de pureza, propriedades físicas e funcionalidade in vitro, avaliamos a possibilidade de usar os vetores de mosaico rAAV1/2 purificados para transduzir o cerebelo de camundongos C57BL/6. Para isso, foi realizada uma injeção estereotáxica em camundongos com 9 semanas de idade e a expressão de GFP foi avaliada 12 semanas depois. Como previsto, os animais injetados com PBS não exibiram fluorescência na imunomarcação de GFP. Imagens de epifluorescência de camundongos injetados com vetores rAAV1/2 que codificam GFP sob o controle do promotor da sinapsina 1 (rAAV1/2 – Syn-ssGFP) revelaram que os vetores rAAV1/2 transduziram com sucesso várias regiões do cerebelo, nomeadamente a região dos núcleos cerebelares profundos (DCN), bem como os diferentes lóbulos do cerebelo (Figura 5). Esses resultados demonstram a expressão prolongada do transgene no cérebro de mamíferos (12 semanas). Figura 1: Representação esquemática do protocolo de produção e purificação de rAAV. Os rAAVs são produzidos por transfecção transitória de células HEK293T usando polietilenimina (PEI). Posteriormente, as células são colhidas e lisadas, e os rAAVs são purificados do homogeneizado celular por meio de cromatografia de afinidade. As frações coletadas contendo rAAVs são então concentradas e os estoques virais finais são caracterizados em termos de título, pureza, características morfológicas e atividade biológica. Abreviaturas: rAAV = vírus adeno-associado recombinante; PEI = polietilenimina; RT-qPCR = reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; SDS-PAGE = eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Protocolo de purificação FPLC e perfil de eluição representativo de rAAV1/2. (A) Representação esquemática de um perfil cromatográfico completo, mostrando os diferentes estágios do processo de purificação de rAAV. Após uma etapa de equilíbrio de colunas, a amostra é aplicada. A coluna é então lavada e a eluição é realizada com concentrações crescentes de NaCl. O material não ligado (fluxo) e frações de 1 mL dos vírus eluídos são coletados para análise. A absorbância a 280 nm é expressa em mAU e o eixo x indica o volume em mL. (B) Cromatograma parcial ampliado mostrando um pico de eluição rAAV1/2 (em preto), com os números de fração correspondentes (F2-F16) e resíduos (indicados em vermelho). A concentração emitida de tampão B e condutividade (expressa em mS/cm) também são mostradas em verde e roxo, respectivamente. (C) RT-qPCR de cada fração coletada durante a purificação por afinidade (F2-F16) e fluxo. O título em vg/μL é representado em uma escala logarítmica. (D) Análise SDS-PAGE das frações virais coletadas. Volumes iguais (40 μL) de cada fração da etapa de eluição (F2-F16) e respectivo fluxo foram carregados e resolvidos em um gel de poliacrilamida SDS a 10%. As bandas proteicas foram visualizadas pela coloração com azul de Coomassie. Bandas correspondentes às proteínas do capsídeo AAV VP1, VP2 e VP3 são indicadas. A escada de tamanho de proteína padrão é designada como (L) e os pesos moleculares correspondentes também são indicados. Abreviaturas: rAAV = vírus adeno-associado recombinante; RT-qPCR = reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; SDS-PAGE = eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Caracterização dos vetores concentrados de rAAV1/2. (A) Curvas de amplificação de uma amostra concentrada de rAAV1/2 (em azul), padrões diluídos em série de 2 × 107 vg/μL a 2 ×10 2 vg/μL (em preto) e um controle sem modelo (em verde), obtidos durante RT-qPCR. (B) Curva padrão (regressão linear) para a determinação do título de uma amostra de rAAV em vg/μL. (C) Análise SDS-PAGE das partículas virais concentradas. Um total de 2,3 × 1010 vg do estoque concentrado foram agrupados no gel. (D) Imagem de microscopia eletrônica de transmissão de partículas rAAV1/2 com ~25-30 nm de diâmetro. Partículas vazias com um centro denso em elétrons (evidenciado por setas pretas) podem ser distinguidas de capsídeos completos (evidenciado por setas brancas). Barra de escala = 100 nm. (E) Espectro de absorbância de uma preparação rAAV1/2 medido por Stunner (em preto). A contribuição de proteínas (em azul), ssDNA (em verde), outros compostos ou impurezas absorventes de UV (em roxo) e turbidez de fundo (em cinza) também são mostrados. (F) Distribuição de intensidade DLS de rAAV1/2 com um único pico a 30 nm, medido por Stunner. Uma intensidade de espalhamento do capsídeo de 100% foi determinada medindo a área sob a curva de 15 a 45 nm (sombreado em verde). (G) Análise de atordoamento de uma preparação de vetor rAAV1/2 exibindo um título total de capsídeo de 1,19 × 1014 cp/mL (azul escuro) e um título completo de capsídeo de 1,73 × 1013 vg/mL (verde escuro). Uma proteína livre e agregada de 7,16 × 1012 equivalentes de cp/mL (azul claro), bem como um ssDNA livre e agregado de 1,04 × equivalentes de10 12 vg/mL (verde claro), também foram medidos. Abreviaturas: rAAV = vírus adeno-associado recombinante; RT-qPCR = reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; SDS-PAGE = eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida; ssDNA = DNA de fita simples; DLS = dispersão dinâmica de luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Avaliação da infecciosidade in vitro de uma amostra concentrada de rAAV1/2. (A) As células Neuro2A foram infectadas com rAAV1/2 – CMV-scGFP ou incubadas com um volume equivalente de PBS, como controle negativo. Imagens de campo claro e fluorescência de células fotografadas 48 h após a infecção. As imagens foram adquiridas em uma Zeiss Axio Observer Z1 (objetiva de 10x). Barras de escala = 100 μm. (B) Imagens detalhadas de células Neuro2A 48 h após a infecção com rAAV1/2 – CMV-scGFP. As imagens foram adquiridas em um Zeiss LSM 710 (objetiva de 40x). Barras de escala = 20 μm. (C) Culturas neuronais primárias semidensas infectadas com rAAV1/2 – CMV-scGFP ou incubadas com um volume equivalente de PBS, servindo como controle negativo. As células foram marcadas com uma coloração nuclear (DAPI em azul) e uma coloração de membrana (WGA em branco). As imagens foram adquiridas em uma Zeiss Axio Observer Z1 (objetiva de 40x). Barras de escala = 20 μm. (D) Imagens detalhadas de culturas neuronais primárias semidensas 48 h após a infecção com rAAV1/2 – CMV-scGFP. As imagens foram adquiridas em um Zeiss LSM 710 (objetiva de 40x). Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: rAAV = vírus adeno-associado recombinante; CMV = citomegalovírus; scGFP = proteína fluorescente verde auto-complementar; PBS = solução salina tamponada com fosfato; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; WGA = aglutinina em gérmen de trigo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Eficiência de transdução in vivo de rAAV1/2 após uma injeção intraparenquimatosa. Imagens de imunofluorescência representativas mostrando a expressão generalizada de GFP (em verde) em todo o cerebelo após uma injeção central de rAAV1/2 – Syn-ssGFP no cerebelo. Os núcleos foram corados com DAPI (em azul). Barras de escala = 500 μm. Abreviaturas: rAAV = vírus adeno-associado recombinante; syn = sinapsina 1; ssGFP = proteína fluorescente verde de fita simples; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; PBS = solução salina tamponada com fosfato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura suplementar S1: Análise em gel de agarose de um plasmídeo vetorial rAAV digerido com SmaI. Seis clones (C1-C6) de um pITR foram digeridos com a enzima de restrição SmaI (pistas 2, 4, 6, 8, 10 e 12), que corta duas vezes em cada repetição terminal invertida. Nesse caso, espera-se que uma digestão completa desse pITR gere duas bandas (3.796 pb e 3.013 pb). Em preparações bem-sucedidas (C1, C3, C4 e C5), uma banda de 6809 pb, resultante da digestão parcial, ainda é visível (~ 5% do total). Nas preparações com recombinação ITR, as proporções são invertidas (C2) ou a digestão não ocorreu (C6). Os respectivos clones não digeridos também são apresentados (pistas 3, 5, 7, 9, 11, 13). Abreviaturas: rAAV = vírus adeno-associado recombinante; ITR = repetição terminal invertida. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar S2: purificação de rAAV2/9 por cromatografia de afinidade à base de heparina. (A) Perfil de eluição de rAAV2/9 exibindo um único pico (em preto), após um aumento na concentração de NaCl. As frações coletadas são indicadas por números (2-16) em vermelho na parte inferior do gráfico, a absorbância a 280 nm é expressa em mAU, a condutividade é expressa em mS/cm e o eixo x indica o volume em mL. (B) títulos de rAAV quantificados por RT-qPCR para cada fração agrupada (F2-F16) e fluxo. Os valores são representados em uma escala logarítmica. (C) Ensaio de pureza por SDS-PAGE e coloração azul de Coomassie. Volumes iguais (40 μL) de cada fração (F2-F16) e o respectivo fluxo foram carregados e resolvidos em um SDS-PAGE de 10%. O estoque concentrado foi quantificado por RT-qPCR e 2,3 × 1010 vg foram diluídos em 40 μL de PBS e agrupados no gel. As bandas proteicas foram visualizadas pela coloração com azul de Coomassie. As proteínas do capsídeo AAV (VP1, VP2 e VP3) são indicadas. A escada de tamanho de proteína padrão é designada com (L) e os pesos moleculares correspondentes também são indicados. Abreviaturas: rAAV = vírus adeno-associado recombinante; RT-qPCR = reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; SDS-PAGE = eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar S3: Análise de Western blot de vetores rAAV1/2 purificados por FPLC. (A) As frações coletadas e os vetores rAAV1/2 concentrados foram resolvidos em um gel SDS-PAGE e sondados com anticorpo monoclonal anti-AAV de camundongo (B1) que reconhece as proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3. (B) As frações coletadas e os vetores concentrados de rAAV1/2 foram resolvidos em um gel SDS-PAGE e sondados com anticorpo monoclonal anti-AAV de camundongo (A69) que reconhece as proteínas do capsídeo VP1 e VP2. Abreviaturas: rAAV = vírus adeno-associado recombinante; FPLC = cromatografia líquida de proteínas rápidas; SDS-PAGE = eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida; L = escada de tamanho de proteína padrão. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar S4: Análise de Western blot de vetores rAAV2/9 purificados por FPLC. (A) As frações coletadas e os vetores rAAV2/9 concentrados foram resolvidos em um gel SDS-PAGE e sondados com anticorpo monoclonal anti-AAV de camundongo (B1) que reconhece as proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3. (B) As frações coletadas e os vetores rAAV2/9 concentrados foram resolvidos em um gel SDS-PAGE e sondados com anticorpo monoclonal anti-AAV de camundongo (A69) que reconhece as proteínas do capsídeo VP1 e VP2. Abreviaturas: rAAV = vírus adeno-associado recombinante; FPLC = cromatografia líquida de proteínas rápidas; SDS-PAGE = eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida; L = escada de tamanho de proteína padrão. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar S5: quantificação e caracterização do vetor rAAV2/9 via Stunner. (A) Espectro de absorbância (preto) de um vetor rAAV2/9 medido por Stunner. A contribuição de proteínas (azul), ssDNA (verde), outros compostos ou impurezas absorventes de UV (roxo) e turbidez de fundo (cinza) também são representados. (B) Distribuição de intensidade DLS de rAAV2/9 com um pico principal a 30 nm correspondendo a uma intensidade de espalhamento do capsídeo de 78%, conforme determinado pela medição da área sob a curva de 15 a 45 nm (sombreado em verde). Uma intensidade total de agregados de 22% (sombreada em cinza) também foi medida com uma contribuição principal de agregados grandes (19,9%) com um diâmetro médio de 620 nm. (C) Análise de atordoamento de uma preparação de vetor rAAV2 / 9 exibindo um título total de capsídeo de 2,18 × 1014 cp / mL (azul escuro) e um título completo de capsídeo de 2,35 × 1013 vg / mL (verde escuro). Uma proteína livre e agregada de 2,92 × 1013 equivalentes de cp/mL (azul claro), bem como um ssDNA livre e agregado de 3,14 × equivalentes de 1012 vg/mL (verde claro), também foram medidos nesta preparação. Abreviaturas: rAAV = vírus adeno-associado recombinante; ssDNA = DNA de fita simples; DLS = dispersão dinâmica de luz. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura S6 suplementar: Eficiência de transdução in vitro e viabilidade das fracções purificadas de rAAV1/2. HEK293T células expressando GFP (fluorescência direta) 48 h após a transdução com 50 μL de frações FPLC de um vetor rAAV1/2 que codifica ssGFP (rAAV1/2 – CMV-ssGFP). Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: rAAV = vírus adeno-associado recombinante; FPLC = cromatografia líquida de proteínas rápidas; ssGFP = proteína fluorescente verde de fita simples. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar S7: Eficiência de transdução in vitro e viabilidade das fracções purificadas de rAAV2/9. HEK293T células foram infectadas com 50 μL de cada fração FPLC (F2-F16) ou fluxo de um vetor rAAV2/9 que codifica scGFP sob o controle do promotor do CMV. As células que expressam GFP foram visualizadas 48 h após a infecção. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: rAAV = vírus adeno-associado recombinante; FPLC = cromatografia líquida de proteínas rápidas; scGFP = proteína fluorescente verde auto-complementar; CMV = citomegalovírus. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O kit de ferramentas de vetores AAV em rápida expansão tornou-se um dos sistemas de entrega de genes mais promissores para uma ampla gama de tipos de células por meio de diferentes vias de administração. Neste trabalho, pretendemos desenvolver um protocolo aprimorado para a produção, purificação e caracterização de vetores rAAV em mosaico que possam provar seu valor em estudos pré-clínicos. Para esse fim, a geração de vetores de mosaico rAAV1/2 e rAAV2/9 é descrita aqui, mas o procedimento também pode ser aplicado para purificar vetores rAAV2 padrão (dados não mostrados).

Os rAAVs em mosaico foram produzidos seguindo um método de transfecção otimizado usando PEI como reagente de transfecção. Um método de transfecção transitória foi selecionado devido à sua maior flexibilidade e velocidade, vantagens consideráveis em estudos pré-clínicos em estágio inicial. Uma vez que um determinado transgene e sorotipo tenham sido validados, o sistema de produção pode ser ajustado para obter melhor escalabilidade e custo-benefício, estabelecendo uma linha celular transfectada estável que expressa um subconjunto dos genes Rep / Cap específicos, com genes adicionais fornecidos por um processo de infecção²⁴. Em comparação com a transfecção de cálcio-fosfato, a PEI apresenta várias vantagens. É um reagente de transfecção estável e econômico que opera efetivamente dentro de uma faixa de pH mais ampla. Além disso, elimina a necessidade de trocar o meio celular após a transfecção, resultando em uma redução significativa no custo e na carga de trabalho⁶⁹.

Na tentativa de contornar algumas das limitações impostas pelos gradientes de CsCl ou iodixanol, os rAAVs produzidos foram colhidos e purificados por cromatografia de afinidade. Essa estratégia oferece uma abordagem simplificada e escalável que pode ser realizada sem a necessidade de ultracentrifugação e gradientes, produzindo títulos virais limpos e altos. De fato, as técnicas de cromatografia usando um sistema FPLC podem ser automatizadas e ampliadas empacotando mais volume de resina em uma coluna com uma altura de leito mais alta. O protocolo aqui descrito pode ser facilmente adaptado para incorporar colunas HiTrap Heparin HP de 5 mL (dados não mostrados). Além disso, as colunas de heparina podem ser reutilizadas várias vezes, contribuindo assim para a relação custo-benefício desse método.

Os rAAVs purificados foram então caracterizados em termos de título, pureza, características morfológicas e atividade biológica. Curiosamente, na coloração com azul de Coomassie, uma banda com aproximadamente 17 kDa foi detectada nas frações F8-F16, além das três proteínas típicas do capsídeo viral. No entanto, essa banda não está mais presente após a etapa de concentração de rAAVs. Além disso, algumas bandas fracas com pesos moleculares inferiores a VP3 (<62 kDa) também podem ser detectadas na marcação de B1 e A69, sugerindo que podem ser fragmentos das proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3⁷⁰. Outra possibilidade é que estas sejam de fato outras proteínas co-purificadoras, como ferritina ou outras proteínas celulares com polipeptídeos que compartilham impressões digitais de proteínas semelhantes com as proteínas do capsídeo AAV e podem estar envolvidas na biologia do AAV, como sugerido anteriormente 26,71,72.

A análise de TEM e atordoamento também revelou a presença de partículas vazias em níveis variáveis em diferentes produções. Da mesma forma, outros estudos relataram anteriormente a geração de níveis variáveis e altos (>65%) de capsídeos vazios para rAAVs preparados por métodos de transfecção ou infecção^24,73. O mecanismo por trás da geração de rAAV começa com a rápida formação de capsídeos vazios a partir de proteínas VP recém-sintetizadas, seguidas por uma etapa lenta de limitação da taxa de empacotamento do genoma nos capsídeos pré-formados mediada por proteínas Rep^74,75. Portanto, capsídeos vazios são gerados em produções de rAAV, embora a proporção de capsídeos vazios e cheios possa variar dependendo do tamanho e da sequência do transgene de interesse e das condições de cultura de células^58,73. Os capsídeos vazios levantam algumas preocupações, pois, por não terem o genoma de interesse, são incapazes de fornecer um efeito terapêutico e também podem potencialmente aumentar uma resposta imune inata ou adaptativa. No entanto, alguns relatórios também mostraram que, ajustando sua proporção, os capsídeos vazios do AAV podem servir como iscas altamente eficazes para anticorpos neutralizantes específicos do AAV e, portanto, aumentar a eficiência da transdução 60,76,77. Se a presença de capsídeos vazios for criticamente prejudicial e dado o caráter ligeiramente menos aniônico das partículas vazias em comparação com os vetores completos, uma solução potencial poderia envolver a realização de uma segunda etapa de purificação de polimento usando técnicas de cromatografia de troca aniônica⁶⁴.

Este estudo também fornece evidências convincentes de que os rAAVs em mosaico gerados são capazes de transduzir com eficiência não apenas culturas neuronais in vitro , mas também o SNC após injeção intracraniana de rAAV1/2. No geral, esses resultados sugerem que o protocolo de produção e purificação descrito torna os rAAVs altamente puros e biologicamente ativos prontos para uso em 6 dias, apresentando-se como um método versátil e econômico para a geração de rAAVs em estudos pré-clínicos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a colaboração, insights e assistência técnica prestada pela Dra. Mónica Zuzarte, do Instituto de Investigação Clínica e Biomédica de Coimbra (iCBR) e do Centro de Biomedicina e Biotecnologia Inovadoras (CIBB), no que diz respeito à análise TEM de rAAVs. Agradecemos à Dra. Dominique Fernandes, do Centro de Neurociências e Biologia Celular da Universidade de Coimbra (CNC-UC) e do Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra (IIIUC), pela sua inestimável assistência técnica e conhecimentos sobre as experiências de cultura neuronal primária. Os plasmídeos pRV1, pH21 e pFdelta6, essenciais para este estudo, foram generosamente fornecidos pela Dra. Christina McClure, da Escola de Ciências Médicas, Faculdade de Ciências da Vida e Medicina da Universidade de Aberdeen, pelo que somos gratos. Este trabalho foi financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), através do Programa Operacional Regional Centro 2020; através do COMPETE 2020 – Programa Operacional da Competitividade e Internacionalização, e de fundos nacionais portugueses via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, no âmbito dos projetos: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), Redefinição – IDT-COP (CENTRO-01-0247-FEDER-070162), Combate ao Sars-CoV-2 (CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); pelo American Portuguese Biomedical Research Fund (APBRF) e pelo Richard Chin and Lily Lock Machado-Joseph Disease Research Fund, ARDAT ao abrigo do acordo de subvenção da JU IMI2 n.º 945473 apoiado pela UE e EFPIA; O GeneT- Teaming Project 101059981 apoiado pelo programa Horizon Europe da União Europeia. M.M.L. foi apoiado por 2021.05776.BD; C.H. foi apoiado por 2021.06939.BD; A.C.S. foi apoiado por 2020.07721.BD; e D.D.L. foi suportado por 2020.09668.BD. A Figura 1 foi criada usando BioRender.com.

Materials

10% povidone-iodine	Medline	MDS093943
12-well plates	Thermo Scientific	11889684
24-well plates	VWR	734-2325
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D1306
96-well Stunner plate	Unchained Labs	701-2025	96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2	Takara	6233	For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water
Acetic acid glacial	Fisher Chemical	A/0360/PB17
ÄKTA pure 25	Cytiva	29018224	FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3
Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse	Invitrogen	31328
Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit	Merck Millipore	UFC5100
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit	Merck Millipore	UFC9100
Benzonase Nuclease	Merck Millipore	E1014
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
CFX96 Real-Time PCR detection system	Biorad	184-5096
ChemiDoc Touch Imaging System	Bio-Rad Laboratories	1708370
Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody	Abcam	ab13970
Coomassie Blue G250	Fisher Chemical	C/P541/46
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Bioreagents	BP17225
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
ECF Substrate for Western Blotting	Cytiva	RPN5785
FastDigest SmaI	Thermo Scientific	FD0663
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin	FEI	Biotwin	Transmission electron microscope
Fetal bovine serum	Biowest	S1810
Fluorescence mounting medium	Dako	S3023
Formvar-carbon coated 200 mesh grid	TAAB Laboratories Equipment	F077/025
Gas evacuation apparatus	RWD	R546W
Glycerol	Fisher BioReagents	10021083
Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11039
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3	Hamilton	7803-07
Hamilton syringe (10 µL)	Hamilton	7653-01
HEK293T	American Type Culture Collection	CRL-11268
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL	Cytiva	17040701	Pre-packed heparin column
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva	17040601	Pre-packed heparin column
Immobilon-P PVDF Membrane	Merck Millipore	IPVH00010
Isoflurane	Braun	469860
Ketamine	Dechra Pharmaceuticals	N/A	Nimatek
Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL)	Fisher Scientific	11906965
Lunatic & Stunner Client software	Unchained Labs	N/A	Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Methanol	Fisher Chemical	M/4000/FP21
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69)	American Research Products	03-61057
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1)	American Research Products	03-61058
Neuro2a	American Type Culture Collection	CCL-131
Normal goat serum	Gibco	16210064
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	12738422
NZYColour Protein Marker II	NZYtech	MB09002
pAAV-CMV-scGFP	Addgene	32396	Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396
pAAV-CMV-ssGFP	Addgene	105530	Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530
pAAV2/9n	Addgene	112865	Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865
Paraformaldehyde	Acros Organics	10342243
PBS	Fisher BioReagents	BP2438
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x)	Gibco	24040032
Polyethylenimine MAX, MW 40,000	Polysciences Europe	24765
R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine – Isoflurane	RWD	N/A
Sample Inlet Valve V9-IS	Cytiva	29027746
Sample pump P9-S	Cytiva	29027745
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	Fisher Scientific	10428420
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Bioreagents	BP166
Sterile PVDF syringe filter	Fisher Scientific	15191499
Stunner Platform	Unchained Labs	700-2002	Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Superloop 150 mL	Cytiva	18-1023-85
Superloop 50 mL	Cytiva	18-1113-82
SURE 2 supercompetent cells	Stratagene, Agilent Technologies	HPA200152
Treated culture dishes	Corning	734-1711
Tris base	Fisher BioReagents	BP152
Tris hydrochloride	Fisher BioReagents	BP153
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633	Invitrogen	W21404
Xylazine	Dechra Pharmaceuticals	N/A	Sedaxylan
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective
Zeiss Axio Scan.Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective
Zeiss LSM 710	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective
µ-Slide 8 well Ibidi	Ibidi	80826	8-well chamber slide

References

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Lopes, M. M., Lopes, S. M., Baganha, R., Henriques, C., Silva, A. C., Lobo, D. D., Cortes, L., de Almeida, L. P., Nobre, R. J. Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol. J. Vis. Exp. (206), e66550, doi:10.3791/66550 (2024).

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Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

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