Isolatie van adeno-geassocieerde virale vectoren door middel van een eenstaps en semi-geautomatiseerd heparine-affiniteitschromatografieprotocol

OPMERKING: Zie figuur 1 voor een illustratie van de samenvatting van het protocol. Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, instrumenten en reagentia die in dit protocol worden gebruikt. Alle werkzaamheden waarbij cellen en virussen betrokken zijn, moeten worden uitgevoerd in speciale bioveiligheidskasten en incubatoren, gescheiden van die welke regelmatig worden gebruikt voor het onderhoud van cellijnen. De apparatuur en reagentia die in contact komen met gekweekte cellen en virussen moeten steriel zijn. Het is van essentieel belang dat de verwijdering van gevaarlijke reagentia en met virussen besmette materialen wordt uitgevoerd in overeenstemming met de veiligheidsinformatiebladen en in overeenstemming met de nationale wetten en richtlijnen die worden verstrekt door het milieu-, gezondheids- en veiligheidsbureau van elke instelling. Vanaf april 2019 categoriseren de NIH-richtlijnen voor onderzoek met recombinante of synthetische nucleïnezuurmoleculen alle AAV-serotypen als risicogroep 1-middelen (niet geassocieerd met ziekte bij gezonde volwassen mensen), evenals recombinante of synthetische AAV-constructen. Deze classificatie is van toepassing wanneer het transgen niet codeert voor een potentieel tumorigene genproduct of een toxine, en de constructen worden geproduceerd zonder een helpervirus. Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de communautaire richtlijn van de Europese Unie (2010/63/EU) voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, die in 2013 in de Portugese wet is omgezet (wetsdecreet 113/2013). Bovendien werden dierprocedures goedgekeurd door de Verantwoordelijke Organisatie voor het Dierenwelzijn van de Faculteit Geneeskunde en het Centrum voor Neurowetenschappen en Celbiologie van de gelicentieerde dierenfaciliteit van de Universiteit van Coimbra. De onderzoekers kregen een adequate opleiding (FELASA-gecertificeerde cursus) en certificering van de Portugese autoriteiten (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lissabon, Portugal) om de experimenten uit te voeren. 1. Plasmide constructies Volg de instructies van de fabrikant van een maxiprep-endotoxinevrije kit om substantiële hoeveelheden DNA van de volgende plasmiden te isoleren en te zuiveren: i) pITR: de overdrachtsvector van belang; ii) pAAV-RC-plasmide: pRV1, dat de AAV2 Rep- en Cap-sequenties 36 bevat; iii) pAAV-RC-plasmide: pH21, dat de AAV1 Rep- en Cap-sequenties 36 bevat; iv) pAAV-RC-plasmide: pAAV2/9n, dat de AAV2 Rep- en AAV9 Cap-sequenties bevat; v) pHelper: pFdelta6, Adenovirus-helper plasmide36. Screen de integriteit van de gegenereerde plasmiden door de aanbevolen enzymatische beperkingen uit te voeren36. Bewaak de integriteit van pITR-plasmiden door vertering met SmaI, een restrictie-endonuclease, dat twee keer snijdt binnen een onstabiel deel van de ITR’s53,54.OPMERKING: Aangezien de ITR’s zeer onstabiel zijn en vatbaar voor deleties, wordt het gebruik van SURE 2 supercompetente cellen aanbevolen om recombinatie op deze plaatsen tot een minimum te beperken. 2. Celcultuur Kweek menselijke embryonale nier 293, waarbij de SV40 grote T-antigeen (HEK293T) cellijn stabiel tot expressie wordt gebracht in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) hoge glucose, aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine, bij 37 °C, onder een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2, als uitgangspunt voor de volgende stappen. Subcultuur van de cellen met behulp van steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, om de cellen te wassen voordat 0,05% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) wordt toegevoegd.OPMERKING: Vermijd het gebruik van cellen die een buitensporig aantal passages hebben ondergaan (maximaal 20). Test regelmatig celculturen op mycoplasma-contaminatie. 3. rAAV-productie door voorbijgaande transfectie Dag 1: Cel platerenPlaat HEK293T voor elke virale productie de cellen in 10 behandelde kweekschaaltjes (15 cm diameter) de dag vóór transfectie, met een dichtheid van 10,5 × 106 cellen per schaaltje in 22 ml gesupplementeerd kweekmedium en incubeer gedurende 24 uur totdat de cellen voor 70%-80% samenvloeien en klaar zijn voor transfectie. Dag 2: Celtransfectie met behulp van polyethylenimine (PEI)Voor elke virale productie (overeenkomend met 10,5 schaaltjes) wordt het volgende transfectiemengsel in een microcentrifugebuisje aangebracht: 54,6 μg pITR; 45.675 μg pRV1; 45,675 μg pH21 of pAAV2/9n; 109,2 μg pFdelta6. Meng door te tikken. Voeg het mengsel toe aan 4,557 ml niet-aangevuld DMEM in een centrifugebuisje van 50 ml. Meng door te tikken. Voeg druppel voor druppel 1,365 ml steriele PEI-oplossing toe van 1 mg/ml (pH 7,4). Meng door te tikken. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van DNA-PEI-complexen mogelijk te maken. Voeg dit mengsel toe aan 231 ml voorverwarmde gesupplementeerde DMEM. Vervang het hele kweekmedium van elk gerecht door 22 ml van dit transfectiemengsel. Incubeer de cellen gedurende 48 uur.OPMERKING: Deze stap moet met zorg worden uitgevoerd om celloslating te voorkomen. Dag 4: Cel oogstWanneer de pITR codeert voor een fluorescerende reporter, visualiseer je de getransfecteerde cellen onder een fluorescentiemicroscoop. Verzamel het medium van elke schaal in centrifugebuisjes van 50 ml en centrifugeer ze gedurende 10 minuten op 800 × g . Gooi het supernatant weg.OPMERKING: Deze stap is optioneel en is bedoeld om getransfecteerde cellen te herstellen die mogelijk zijn losgekomen als gevolg van een zeer hoge confluentie. Voeg 10 ml voorverwarmde PBS toe aan elk bord. Verwijder de cellen voorzichtig met een celschraper en vang de suspensie op in de centrifugebuisjes van 50 ml uit stap 3.3.2. Was 5 vaat per keer met een extra 10 ml PBS en breng de suspensie over in de centrifugebuisjes van 50 ml uit stap 3.3.3. Pelleteer de cellen bij 800 × g gedurende 10 minuten en gooi het supernatant weg. Vries de celpellets in bij -80 °C.OPMERKING: Celpellets kunnen enkele maanden worden bewaard (pauzepunt). 4. rAAV-extractie en FPLC-zuivering Dag 5: Bereiding van cellysaatOntdooi de celpellets bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen die zijn verzameld uit de 10 schaaltjes in 100 ml van een steriele buffer met 150 mM natriumchloride (NaCl) en 20 mM Tris, pH 8,0, in ultrapuur (type I) water. Meng de suspensie door op en neer te pipetteren om een homogene suspensie te garanderen. Voeg 12,5 ml van een vers bereide steriele oplossing van 10% natriumdeoxycholaat toe in ultrapuur water om cellyse te induceren. Meng door op en neer te pipetteren.OPMERKING: Gooi natriumdeoxycholaat weg, evenals de materialen die ermee in contact komen, in overeenstemming met het veiligheidsinformatieblad en de richtlijnen van het milieugezondheids- en veiligheidsbureau van de instelling. Het wordt ook aanbevolen om een gezichtsmasker te dragen tijdens het hanteren van dit poeder. Na het mengen wordt de oplossing zeer stroperig. Voeg 27 μL benzonasenuclease toe aan het vorige mengsel. Meng grondig door op en neer te pipetteren totdat het monster niet meer stroperig is. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur en voer elke 10 minuten een vortex uit.OPMERKING: Deze endonuclease is in staat om alle vormen van DNA en RNA efficiënt af te breken zonder enige proteolytische activiteit te vertonen. Verwijder celresten door het mengsel 60 minuten bij 25 °C te centrifugeren bij 3.000 × g . Filtreer het supernatans met een 0,45 μm steriel polyvinylideendifluoride (PVDF) spuitfilter en breng het over in een nieuwe steriele container.OPMERKING: Deze belangrijke stap zorgt ervoor dat het meeste cellulaire afval wordt verwijderd, waardoor verstopping van chromatografiekolommen wordt voorkomen. Bewaar een kleine hoeveelheid van dit mengsel voor analyse (optionele stap). Dag 5 (vervolg): Heparinekolomzuivering van rAAV’sNOTITIE: Monstertoepassing kan worden uitgevoerd met behulp van een monsterpomp of een superloop van 50 ml of 150 ml als onderdeel van het systeem. Aangezien er bij lagere temperaturen meer lucht wordt opgelost, is het belangrijk om de buffers en oplossingen (meestal opgeslagen bij 4 °C) voldoende tijd te geven om aan kamertemperatuur te acclimatiseren voordat ze in het FPLC-systeem worden gebruikt.Optioneel: Als het systeem gedurende lange perioden is opgeslagen, vul dan het systeem en alle inlaten met vers bereide opslagoplossing (20% ethanol) met behulp van handmatige instructies of een vooraf gedefinieerde systeemreinigingsmethode (systeem-CIP). Was het vloeistofstroompad volledig met steriel ultrapuur water met behulp van handmatige instructies of een vooraf gedefinieerde CIP-methode van het systeem. Sluit een voorverpakte heparinekolom van 1 ml aan, stel het drukalarm in en was met vijf kolomvolumes (CV’s) ultrapuur water met een debiet van 1 ml/min. Schakel de oplossingen in de bufferbak over van ultrapuur water naar buffer A (steriele oplossing van 100 mM NaCl en 20 mM Tris, pH 8, in ultrapuur water) voor inlaat A (systeempomp A) en naar buffer B (steriele oplossing van 500 mM NaCl en 20 mM Tris, pH 8, in ultrapuur water) voor inlaat B (systeempomp B). Als het systeem een bemonsteringspomp heeft, plaatst u de bufferinlaat van de bemonsteringsinlaatklep in buffer A. Was de systeempomp B met buffer B en vul de rest van het vloeistofstroompad met buffer A.NOTITIE: Koppel indien nodig de kolom los van het stroompad en sluit deze daarna weer aan. Plaats een monsterinlaatslang van de monsterinlaatklep, bijvoorbeeld S1, in de container met het virale preparaat dat in stap 4.1.4 is verkregen. (van het preparaat van cellysaat). Vul het stroompad van monsterinlaat S1 naar de injectieklep voor met de monsteroplossing. U kunt ook een superloop van 50 ml of 150 ml vullen met het monster dat rAAV’s bevat met behulp van een spuit van 50 ml. Breng de kolom in evenwicht met een totaal volume van vijf CV’s met behulp van 12,5% buffer B met een snelheid van 1 ml/min. Breng het totale volume van het monster aan in de kolom met behulp van de monsterpomp (selecteer injecteer alle monsters met behulp van de luchtsensor) of de superloop met 0.5 ml/min en verzamel de doorstroom met behulp van de uitlaatpoort in een nieuwe steriele container.NOTITIE: Wanneer de stroomregeling om overdruk te voorkomen is ingeschakeld, zal het debiet automatisch afnemen in geval van verstopping van de kolom. Als het debiet aanzienlijk onder 0,5 ml/min daalt, stop dan de monstertoepassing, voer een wasbeurt uit met 2-5 CV’s buffer A en hervat vervolgens de monstertoepassing. Was de kolom met 1 ml/min met 20 CV’s buffer A en vang de doorstroom op met behulp van de uitlaatpoort. Eluer het monster bij 1 ml/min met het volgende schema: i) lineaire gradiënt met een doel van 50% van buffer B voor vijf CV’s; ii) stap met een streefcijfer van 90% van buffer B gedurende vijf CV’s; iii) stap met een doel van 100% buffer B gedurende vijf CV’s. Verzamel het geëlueerde monster in fracties van 1 ml met behulp van een fractiecollector en microcentrifugebuisjes met lage retentie (2 ml) en bewaar ze bij -20 °C.OPMERKING: De rAAV-fracties kunnen enkele weken worden bewaard (pauzepunt). Breng de kolom opnieuw in evenwicht bij 1 ml/min met 12,5% buffer B voor vijf CV’s. Schakel de inlaten van de bufferoplossingen over op ultrapuur water en was de kolom met 1 ml/min voor vijf CV’s. Schakel de inlaten over van ultrapuur water naar 20% ethanol en was de kolom met 1 ml/min voor vijf CV’s. Koppel de kolom los en bewaar deze bij 4 °C.OPMERKING: Kolommen kunnen meerdere keren worden hergebruikt zonder andere grote reinigings- en ontsmettingsprocedures als hetzelfde rAAV-serotype en transgen worden gebruikt. Was het vloeistofstroompad volledig met 20% ethanol met behulp van handmatige instructies of een vooraf gedefinieerde systeem-CIP-methode. 5. Concentratie van gezuiverde rAAV’s Dag 6: Concentratie stap 1Concentreer rAAV’s met behulp van een centrifugaalfiltereenheid van 15 ml met een grenswaarde van 100 kDa molecuulgewicht. Laad de gewenste fracties met rAAV’s (FPLC-fracties 7 tot 16) in de centrifugaalfiltereenheid van 15 ml en centrifugeer deze bij 2.000 × g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat het geconcentreerde volume in de filtereenheid ongeveer 500 μL is. Als het geconcentreerde volume grotendeels groter is dan 500 μL, herhaal dan de centrifugatiestappen met tussenpozen van 1 minuut totdat het gewenste volume is bereikt. Dag 6 (vervolg): Buffer uitwisselingVoeg 1 ml steriele PBS toe aan de centrifugaalfiltereenheid met de rAAV’s. Pipeteer voorzichtig op en neer om het filter te wassen. Centrifugeer bij 2.000 × g met tussenpozen van 1 minuut tot het uiteindelijke volume van 500 μl is bereikt. Dag 6 (vervolg): Concentratiestap 2Breng de 500 μl geconcentreerde rAAV’s die in de vorige stap zijn verkregen, over in een centrifugaalfiltereenheid van 0,5 ml met een molecuulgewichtgrens van 100 kDa en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 6.000 × g . Herhaal indien nodig de centrifugeerstap totdat een eindvolume van minder dan 100 μl is bereikt. Dag 6 (vervolg): HerstelOm de geconcentreerde rAAV terug te winnen, plaatst u het filterapparaat ondersteboven in een nieuwe microcentrifuge-verzamelbuis. Plaats de buis in een microcentrifuge met de dop naar het midden en draai langdurig in de stroomkamer om geconcentreerde rAAV’s van het apparaat naar de microcentrifugebuis over te brengen. U kunt ook centrifugeren bij 1.000 × g gedurende 2 minuten. Supplement met steriele Pluronic F-68 0,001% (optioneel).OPMERKING: Pluronic F-68 is een niet-ionische oppervlakteactieve stof die is goedgekeurd voor menselijk gebruik door de Food and Drug Administration en die in staat is om verliezen van rAAV’s te verminderen door hun interacties met de oppervlakken van materialen (kunststoffen) te voorkomen die worden gebruikt tijdens de verdunningsvoorbereiding, het laden van spuiten en toedieningsapparatuur55,56. Aliquot rAAV’s in microcentrifugebuisjes met lage retentie en bewaren bij -80 °C (pauzepunt). 6. Kwantificering van gezuiverde rAAV’s Dag 6 (vervolg): Bepaal de titer van rAAV-preparaten, uitgedrukt in virale genomen/μL (vg/μL), door middel van real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) met behulp van een commerciële kit en volgens de instructies van de fabrikant.Incubeer de rAAV-deeltjesoplossing met DNase I bij 37 °C gedurende 20 min.OPMERKING: Deze procedure bevordert de vertering van vrij genomisch DNA en plasmide-DNA afkomstig van gastheercellen, en zorgt er zo voor dat alleen de nucleïnezuursequentie in intacte rAAV-deeltjes behouden blijft. Warmte-inactiveer DNase I bij 95 °C gedurende 10 min. Voeg Lysis Buffer toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 70 °C om warmtedenaturatie van de eiwitten van rAAV-deeltjes te bevorderen. Verdun de verkregen rAAV-genoomoplossing in verdunningsbuffer voordat u overgaat tot de RT-qPCR. Maak een set serieel verdunde standaarden van de positieve controle (van 2 × 107 vg/μl tot 2 × 102 vg/μl) die bij de kit wordt geleverd. Voer een reactiemengsel uit met 12,5 μl Taq II-mix, 0,5 μl verdund primermengsel, 7 μl water en 5 μl verdund rAAV-DNA (onbekend AAV-monster en standaarden uit stap 6.1.4.). Voer de RT-qPCR uit in een real-time PCR-detectiesysteem, met behulp van het volgende protocol: 1 cyclus bij 95 °C gedurende 2 minuten (initiële denaturatie) en 40 cycli bij 95 °C gedurende 5 s (denaturatie) en 60 °C gedurende 30 s (gloeien, extensie en plaatlezing), gevolgd door een smeltcurve-analyse. Bereken de absolute monsterconcentratie op basis van de standaardcurve (lineaire regressielijn), rekening houdend met de verdunningsfactor die het resultaat is van de rAAV-monstervoorbereiding.OPMERKING: De kwantificering van het aantal virale genomen wordt bereikt door de amplificatie van de ITR-sequentie van AAV2 (doelsequentie van de primers die door de kit worden geleverd). 7. SDS-PAGE, Coomassie blauwe kleuring en western blot Denatureer 40 μl van elk monster (elke FPLC-fractie; de doorstroom; de voorkolommonsters, en in totaal 2,3 × 1010 vg van het geconcentreerde eindproduct) door 6x monsterbuffer toe te voegen (0,5 M Tris-HCl/0,4% natriumdodecylsulfaat (SDS) pH 6,8, 30% glycerol, 10% SDS, 0,6 M dithiothreitol (DTT), 0,012% broomfenol blauw) en de monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C te incuberen. Laad de gedenatureerde monsters (48 μL) in een SDS-polyacrylamidegel (4% stapel- en 10% oplossende gel) en voer de elektroforetische scheiding uit bij 100 V gedurende 70 minuten, naast een eiwitladder. Eiwit analyseOPMERKING: Coomassie blauwe kleuring of western blotting kan worden uitgevoerd.Coomassie blauwe kleuringOm eiwitbanden te visualiseren, kleurt u de gel gedurende 10 minuten met een 0,25% Coomassie blue G250-oplossing opgelost in 50% methanol en 10% azijnzuur ijszuur. Voer gelkleuring uit door het meerdere keren te wassen met een oplossing met 25% methanol en 5% azijnzuur glaciaal totdat duidelijke banden met een lage achtergrond zichtbaar worden. Leg beelden vast met behulp van een geschikt beeldvormingssysteem. Westelijke vlekBreng de eiwitten over op een PVDF-membraan volgens standaardprotocollen. Blokkeer het membraan door incubatie in 5% magere melk verdund in TBS-T (0,1% Tween 20 in Tris-gebufferde zoutoplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Gebruik de volgende primaire antilichamen (verdund in blokkeringsoplossing) voor de nachtelijke incubatie bij 4 °C: monoklonale anti-AAV bij muizen, VP1, VP2, VP3-antilichaam (B1, 1:1.000) of monoklonale anti-AAV, VP1, VP2-antilichaam bij muizen (A69, 1:1.000). Was de membranen gedurende 3 x 15 minuten in TBS-T en incubeer met een alkalisch fosfatase-gekoppeld geitenanti-muis secundair antilichaam (1:10.000), gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Was de membranen 3 x 15 min in TBS-T. Voeg verbeterd chemifluorescerend substraat (ECF) toe en visualiseer eiwitbanden door middel van chemifluorescentiebeeldvorming. 8. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) Plaats een met Formvar-koolstof gecoate 200 mesh grid ondersteboven op een druppel van een rAAV-monster en laat het 1 minuut bezinken. Was de roosters in een druppel water en droog de overtollige vloeistof af met filtreerpapier. Kleurig de roosters negatief met 1% uranylacetaatoplossing (pH 7) gedurende 1 minuut om de virale deeltjes te fixeren en te contrasteren. Was de roosters in een druppel water en droog de overtollige vloeistof af met filtreerpapier. Onderzoek de monsters in een transmissie-elektronenmicroscoop.OPMERKING: Hoge zoutconcentraties kunnen een directe invloed hebben op de binding van rAAV’s aan het rooster en leiden tot de visualisatie van kristalachtige structuren. 9. Opeenvolgende absorptie van ultraviolet-zichtbaar licht, statische lichtverstrooiing en dynamische lichtverstrooiingsanalyse Laad op een kwantificeringsplaat met 96 putjes 2 μL van een rAAV-monster en 2 μL PBS om als buffer te gebruiken (voer dit in duplicaten uit). Gebruik de AAV Quant-applicatie in de clientanalysesoftware, plaats de namen van de monsters op de juiste locatie van de plaat, selecteer het AAV-serotype en klik op Volgende. Plaats de kwantificeringsplaat met 96 putjes in de daarvoor bestemde apparatuur en ga verder met plaatlezen voor gegevensverzameling. 10. In-vitrotransductietests Verschillende cellijnen kunnen worden gebruikt om snel de transductie-efficiëntie van rAAV’s te analyseren.Gelijkmatig HEK293T cellen zaaien in platen met 24 putjes (met een dichtheid van 137.500 cellen/put) en een neuroblastoom-2A-cellijn (Neuro2a) bij muizen in platen met 24 putjes (50.000 cellen/putje) of in een kamerglaasje met 8 putjes (27.000 cellen/putje), met behulp van DMEM hoge glucose, aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine, zoals hierboven beschreven. Laat de cellen een nacht hechten bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 . Verzamel geconditioneerd medium uit elk putje (250 μl van platen met 24 putjes en 50 μl van het kamerglaasje met 8 putjes) en bewaar het bij 4 °C voor later gebruik. Voeg de volgende rAAV-preparaten toe aan elk putje en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 .Voeg 50 μL van de FPLC-verzamelde fracties F2-F16 toe en stroomt door naar HEK293T cellen die zijn bekleed met platen met 24 putjes. Voeg in totaal 5,5 × 109 vg van de geconcentreerde rAAV’s verdund in 50 μL PBS toe aan Neuro2a-cellen geplateerd in platen met 24 putjes (inclusief een negatief controleputje, door 50 μL PBS aan de cellen toe te voegen). Voeg in totaal 2,75 × 109 vg van de geconcentreerde rAAV’s verdund in 25 μL PBS toe aan Neuro2a-cellen geplateerd in een kamerglaasje met 8 putjes (inclusief de negatieve controleconditie, door 50 μL PBS aan de cellen toe te voegen). Voeg het eerder opgeslagen geconditioneerde medium (stap 10.1.2) toe aan elk putje en incubeer gedurende 24 uur. Gooi het medium weg en was de cellen 2x met PBS. Voeg aan elk putje een oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) toe, aangevuld met 4% sucrose in PBS, voorverwarmd tot 37 °C, en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. 2x wassen met PBS en bewaren bij 4 °C totdat de beeldvorming is uitgevoerd (pauzepunt). Verkrijg beelden op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 10x/0.30 objectief, of een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een 40x/1.4 Oil DIC-objectief. Om een relevanter en reflectiever model van de in vivo omgeving te hebben, gebruikt u primaire neuronale culturen als volgt:Bereid primaire culturen van corticale neuronen voor zoals eerder beschreven door Santos et al.57. Kortom, zaai 200.000 cellen/ml in platen met 12 putjes en houd ze in cultuur tot de dag in vitro 16. Verzamel geconditioneerd medium uit elk putje (100 μL) en bewaar het bij 4 °C voor later gebruik. Voeg de te testen rAAV’s toe aan elk putje: in totaal 2,75 × 109 vg van de geconcentreerde rAAV’s verdund in 25 μL PBS (inclusief de negatieve controle: 25 μL PBS). Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2 . Voeg het eerder opgeslagen geconditioneerde medium toe en incubeer gedurende 24 uur. Gooi het medium in elk putje weg en was 2x met PBS. Fixeer de cellen met 4% PFA/4% sucrose in PBS, zoals beschreven in stap 10.1.6. 2x wassen met PBS. Incubeer elk putje met 5 μg/ml tarwekiemagglutinine (WGA) geconjugeerd met Alexa Fluor 633 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (optionele stap: voer in plaats daarvan immunocytochemie uit). 2x wassen met PBS. Incubeer in 0,25% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Wassen met PBS. Incubeer met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. 2x wassen met PBS. Verkrijg beelden op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een 40x/0,95 objectief, of een omgekeerde confocale microscoop die is uitgerust met een 40x/1.4 Oil DIC-objectief. 11. In-vivo-experimenten OPMERKING: De dieren werden gehuisvest in een ruimte met temperatuurregeling, die op een licht/donker-cyclus van 12 uur werd gehouden. Voedsel en water werden ad libitum verstrekt. Alles werd in het werk gesteld om dierenleed tot een minimum te beperken. Stereotaxische injectie in het cerebellumVerdoof 9 weken oude C57BL/6-dieren door inademing van 2% isofluraan in aanwezigheid van zuurstof (0,8 l/min) in een kamer die is aangesloten op een verdamper. Plaats het verdoofde dier in het stereotaxitische apparaat (op een verwarmd kussen van 35 °C) en plaats het isofluraanmasker in de neus van het dier. Verlaag het isofluraangehalte tot 1,3-1,7%.OPMERKING: Zorg ervoor dat het dier correct is verdoofd voordat u verder gaat (verlies van de reflex voor flexie in beide achterpoten). Breng smeermiddel oogzalf aan om uitdroging van de hoornvliezen te voorkomen en injecteer het dier met een goedgekeurd pijnstiller.OPMERKING: Alle volgende stappen moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Na het scheren van de vacht van het hoofd van het dier en het desinfecteren van het operatiegebied, legt u de schedel bloot en plaatst u de punt van een injectienaald met stompe punt van 30 G, aangesloten op een Hamilton-spuit van 10 μL, direct boven bregma (gebruik bregma als nul voor de berekening van stereotaxische coördinaten). Verplaats de naald naar het beoogde coördinaat en boor een gat door de schedel waar de naald naar binnen gaat.OPMERKING: In het kader van deze studie werd een enkele injectie centraal in het cerebellum uitgevoerd. Injecteer 4 μl van een oplossing van rAAV’s met in totaal 8 × 109 vg, verdund in PBS, met een infusiesnelheid van 0,5 μl/min met behulp van een automatische injector. Gebruik de volgende coördinaten, berekend op basis van bregma, om een enkele injectie centraal in het cerebellum van een volwassen C57BL/6-muis uit te voeren: antero-posterieur: -6,5 mm; lateraal: 0 mm; Ventraal: -2,9 mm.OPMERKING: Deze coördinaten kunnen variëren afhankelijk van de muizenstam, het geslacht en de leeftijd van de dieren die worden gebruikt. Om terugstroming tot een minimum te beperken en de virale vectordiffusie mogelijk te maken, laat u, zodra de infusie is voltooid, de naald van de spuit 3 minuten op deze coördinaten staan, trekt u deze vervolgens langzaam 0,3 mm terug en laat u deze nog 2 minuten op zijn plaats blijven voordat deze volledig uit de muizenhersenen wordt verwijderd. Sluit de incisie en reinig deze met een ontsmettingsmiddel (bijv. 10% povidon-jodium). Laat de dieren herstellen van de narcose voordat u ze terugbrengt naar hun thuiskooien. Weefselafname en -voorbereidingOPMERKING: In dit experiment werden de transductieniveaus 12 weken na injectie waargenomen, maar dezelfde procedure kon al 4 weken na de injectie worden geëvalueerd.Eindverdoving van de dieren door intraperitoneale toediening van een overdosis xylazine/ketamine (8/160 mg/kg lichaamsgewicht). Perfiltreer de dieren transcardisch met ijskoude PBS gedurende 6 minuten met een snelheid van 2,5 ml/min, gevolgd door de perfusie met een vers bereide ijskoude 4% PFA-oplossing gedurende 10 minuten met dezelfde snelheid. Fixeer de weggesneden hersenen een nacht bij kamertemperatuur in 4% PFA en breng ze vervolgens over naar een 25% sucrose/PBS-oplossing voor cryoprotectie. Zodra de hersenen zijn gezonken (ongeveer 48 uur later), bewaar ze dan bij -80 °C. Snijd seriële sagittale secties met een dikte van 30 μm met behulp van een cryostaat bij -21 °C. Verzamel voor elk dier 96 sagittale secties van een hersenhelft in anatomische reeksen als vrij zwevende secties in PBS aangevuld met 0,05% natriumazide. Bewaren bij 4 °C tot verdere verwerking. Standaard fluorescentie-immunohistochemieSelecteer acht sagittale secties per dier, op een afstand van 240 μm van elkaar. Incubeer de vrij zwevende secties in een blok-/permeabilisatieoplossing (0,1% Triton X-100 met 10% normaal geitenserum (NGS) in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Incubeer de secties een nacht bij 4 °C met kip polyklonaal anti-GFP primair antilichaam (1:1.000). Was gedurende 3 x 15 minuten in PBS en incubeer de secties gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met het secundaire antilichaam geit polyklonaal anti-kip antilichaam geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 fluorofoor (1:200). Was gedurende 3 x 15 minuten in PBS. Incubeer met DAPI gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was gedurende 3 x 15 minuten in PBS. Plaats de secties in met gelatine beklede objectglaasjes en dekglaasje met fluorescentie-montagemedium. Maak beelden op een fluorescentiemicroscoop met een diascanner die is uitgerust met een 20x/0.8 objectief.