Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

HINWEIS: In Abbildung 1 finden Sie eine Abbildung, die das Protokoll zusammenfasst. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden. Alle Arbeiten, die mit Zellen und Viren zu tun haben, sollten in speziellen Biosicherheitswerkbänken und Inkubatoren durchgeführt werden, die von denen getrennt sind, die regelmäßig für die Erhaltung von Zelllinien verwendet werden. Die Geräte und Reagenzien, die mit kultivierten Zellen und Viren in Kontakt kommen, sollten steril sein. Es ist von wesentlicher Bedeutung, dass die Entsorgung von gefährlichen Reagenzien und mit Viren kontaminierten Materialien in Übereinstimmung mit den Sicherheitsdatenblättern und in Übereinstimmung mit den nationalen Gesetzen und Richtlinien erfolgt, die von den Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsbüros der einzelnen Institutionen bereitgestellt werden. Seit April 2019 kategorisieren die NIH-Richtlinien für die Forschung mit rekombinanten oder synthetischen Nukleinsäuremolekülen alle AAV-Serotypen sowie rekombinante oder synthetische AAV-Konstrukte als Wirkstoffe der Risikogruppe 1 (die bei gesunden erwachsenen Menschen nicht mit einer Erkrankung in Verbindung gebracht werden). Diese Einteilung ist der Fall, wenn das Transgen nicht für ein potenziell tumorigenes Genprodukt oder ein Toxin kodiert und die Konstrukte ohne ein Helfervirus hergestellt werden. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie der Europäischen Union (2010/63/EU) über die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, die 2013 in portugiesisches Recht umgesetzt wurde (Gesetzesdekret 113/2013). Darüber hinaus wurden die Tierversuche von der Responsible Organization for the Animal Welfare der Medizinischen Fakultät und dem Zentrum für Neurowissenschaften und Zellbiologie der Universität Coimbra genehmigt. Die Forscher erhielten eine angemessene Ausbildung (FELASA-zertifizierter Kurs) und eine Zertifizierung durch die portugiesischen Behörden (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lissabon, Portugal), um die Experimente durchzuführen. 1. Plasmid-Konstrukte Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für ein endotoxinfreies Maxiprep-Kit, um erhebliche DNA-Mengen der folgenden Plasmide zu isolieren und zu reinigen: i) pITR: der interessierende Transfervektor; ii) pAAV-RC-Plasmid: pRV1, enthaltend die AAV2 Rep- und Cap-Sequenzen 36; iii) pAAV-RC-Plasmid: pH21, enthält die AAV1 Rep- und Cap-Sequenzen 36; iv) pAAV-RC-Plasmid: pAAV2/9n, bestehend aus den Sequenzen AAV2 Rep und AAV9 Cap; v) pHelper: pFdelta6, Adenovirus-Helfer-Plasmid36. Die Integrität der erzeugten Plasmide wird durch Durchführung der empfohlenen enzymatischen Restriktionen36 überprüft. Die Integrität von pITR-Plasmiden wird durch Aufschluss mit SmaI überwacht, einer Restriktionsendonukleasorte, die in einem instabilen Teil der ITRs zweimal schneidet53,54.HINWEIS: Da die ITRs sehr instabil und anfällig für Deletionen sind, wird die Verwendung von SURE 2 superkompetenten Zellen empfohlen, um die Rekombination an diesen Stellen zu minimieren. 2. Zellkultur Eine humane embryonale Niere 293, die die SV40-Zelllinie des großen T-Antigens (HEK293T) stabil exprimiert, wird in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) hoher Glukose, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin, bei 37 °C unter einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % CO2 enthält, als Ausgangspunkt für die nachfolgenden Schritte kultiviert. Subkultur der Zellen mit steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, um die Zellen zu waschen, bevor 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzugefügt werden.HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Zellen, die eine übermäßige Anzahl von Passagen (maximal 20) durchlaufen haben. Testen Sie regelmäßig Zellkulturen auf Mykoplasmenkontamination. 3. rAAV-Produktion durch transiente Transfektion Tag 1: ZellbeschichtungFür jede Virusproduktion HEK293T Zellen am Tag vor der Transfektion in 10 behandelte Kulturschalen (15 cm Durchmesser) mit einer Dichte von 10,5 × 10 10Zellen pro Schale in 22 ml supplementiertes Kulturmedium geben und 24 Stunden lang inkubieren, bis die Zellen zu 70 % bis 80 % konfluent und bereit für die Transfektion sind. Tag 2: Zelltransfektion mit Polyethylenimin (PEI)Für jede Virusproduktion (entspricht 10,5 Schalen) wird die folgende Transfektionsmischung in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben: 54,6 μg pITR; 45,675 μg pRV1; 45,675 μg pH21 oder pAAV2/9n; 109,2 μg pFdelta6. Mischen durch Klopfen. Geben Sie die Mischung zu 4,557 mL nicht supplementiertem DMEM in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen. Mischen durch Klopfen. 1,365 ml sterile PEI-Lösung mit 1 mg/ml (pH 7,4) tropfenweise hinzufügen. Mischen durch Klopfen. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Bildung von DNA-PEI-Komplexen zu ermöglichen. Fügen Sie diese Mischung zu 231 mL vorgewärmtem supplementiertem DMEM hinzu. Ersetzen Sie das gesamte Nährmedium jeder Schale durch 22 mL dieser Transfektionsmischung. Inkubieren Sie die Zellen für 48 Stunden.HINWEIS: Dieser Schritt muss mit Vorsicht durchgeführt werden, um eine Zellablösung zu vermeiden. Tag 4: ZellernteWenn das pITR einen Fluoreszenzreporter kodiert, visualisieren Sie die transfizierten Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Sammeln Sie das Medium aus jeder Schale in 50 mL Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie diese bei 800 × g für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand.HINWEIS: Dieser Schritt ist optional und zielt darauf ab, transfizierte Zellen zu gewinnen, die sich aufgrund einer sehr hohen Konfluenz abgelöst haben könnten. Geben Sie 10 ml vorgewärmtes PBS auf jede Platte. Entfernen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber und sammeln Sie die Suspension in den 50 mL Zentrifugenröhrchen aus Schritt 3.3.2. Waschen Sie jeweils 5 Geschirr mit zusätzlichen 10 mL PBS und geben Sie die Suspension in die 50 mL Zentrifugenröhrchen aus Schritt 3.3.3. Die Zellen werden 10 Minuten lang bei 800 × g pelletiert und der Überstand wird entsorgt. Frieren Sie die Zellpellets bei -80 °C ein.HINWEIS: Zellpellets können mehrere Monate gelagert werden (Pausenpunkt). 4. rAAV-Extraktion und FPLC-Reinigung Tag 5: Vorbereitung des ZelllysatsTauen Sie die Zellpellets bei Raumtemperatur auf. Resuspendieren Sie die aus den 10 Schalen entnommenen Zellen in 100 mL eines sterilen Puffers, der 150 mM Natriumchlorid (NaCl) und 20 mM Tris, pH 8,0, in ultrareinem Wasser (Typ I) enthält. Mischen Sie die Suspension durch Auf- und Abpipettieren, um eine homogene Suspension zu gewährleisten. 12,5 ml einer frisch zubereiteten sterilen Lösung von 10 % Natriumdesoxycholat in Reinstwasser geben, um die Zelllyse zu induzieren. Mischen Sie, indem Sie auf und ab pipettieren.HINWEIS: Entsorgen Sie Natriumdesoxycholat sowie die Materialien, die damit in Berührung kommen, gemäß dem Sicherheitsdatenblatt und den Richtlinien des Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsbüros der Einrichtung. Es wird auch empfohlen, beim Umgang mit diesem Pulver eine Gesichtsmaske zu tragen. Nach dem Mischen wird die Lösung hochviskos. Fügen Sie der vorherigen Mischung 27 μl Benzonase-Nuklease hinzu. Gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren, bis die Probe nicht mehr viskos ist. Inkubieren Sie 1 h lang bei 37 °C und führen Sie alle 10 Minuten einen Wirbel durch.HINWEIS: Diese Endonuklease ist in der Lage, alle Formen von DNA und RNA effizient abzubauen, ohne eine proteolytische Aktivität zu zeigen. Entfernen Sie Zellreste, indem Sie das Gemisch 60 Minuten lang bei 3.000 × g bei 25 °C zentrifugieren. Filtrieren Sie den Überstand mit einem 0,45 μm sterilen Spritzenvorsatzfilter aus Polyvinylidendifluorid (PVDF) und füllen Sie ihn in einen neuen sterilen Behälter um.HINWEIS: Dieser wichtige Schritt stellt sicher, dass der größte Teil der zellulären Trümmer entfernt wird, wodurch das Verstopfen der Chromatographiesäulen verhindert wird. Speichern Sie ein kleines Aliquot dieser Mischung für die Analyse (optionaler Schritt). Tag 5 (Fortsetzung): Aufreinigung von rAAVs mit Heparin-SäuleHINWEIS: Die Probenapplikation kann mit einer Probenpumpe oder einem 50 mL oder 150 mL Superloop als Teil des Systems durchgeführt werden. Da bei niedrigeren Temperaturen mehr Luft gelöst wird, ist es wichtig, den Puffern und Lösungen (die in der Regel bei 4 °C gelagert werden) ausreichend Zeit zu geben, sich an Raumtemperatur zu gewöhnen, bevor sie im FPLC-System verwendet werden.Optional: Wenn das System über einen längeren Zeitraum gelagert wurde, füllen Sie das System und alle Einläufe mit frisch zubereiteter Lagerlösung (20 % Ethanol) nach manuellen Anweisungen oder einer vordefinierten System-Cleaning-in-Place-Methode (System CIP). Waschen Sie den Flüssigkeitsströmungsweg vollständig mit sterilem Reinstwasser unter Verwendung manueller Anweisungen oder einer vordefinierten CIP-Methode des Systems. Schließen Sie eine vorgepackte 1-ml-Heparinsäule an, stellen Sie den Druckalarm ein und waschen Sie mit fünf Säulenvolumina (CVs) Reinstwasser bei einer Durchflussrate von 1 mL/min. Schalten Sie die Lösungen in der Pufferschale von Reinstwasser auf Puffer A (sterile Lösung von 100 mM NaCl und 20 mM Tris, pH 8, in Reinstwasser) für Einlass A (Systempumpe A) und auf Puffer B (sterile Lösung von 500 mM NaCl und 20 mM Tris, pH 8, in Reinstwasser) für Einlass B (Systempumpe B) um. Wenn das System über eine Probenpumpe verfügt, platzieren Sie den Puffereinlass des Probeneinlassventils in Puffer A. Waschen Sie die Systempumpe B mit Puffer B und füllen Sie den restlichen Flüssigkeitsströmungsweg mit Puffer A.HINWEIS: Trennen Sie die Säule bei Bedarf vom Strömungsweg und schließen Sie sie anschließend wieder an. Ein Probeneinlassschlauch aus dem Probeneinlassventil, z. B. S1, wird in den Behälter mit dem in Schritt 4.1.4 erhaltenen Viruspräparat eingeführt. (aus der Zelllysatpräparation). Den Strömungsweg vom Probeneinlass S1 zum Injektionsventil mit der Probenlösung anfüllen. Alternativ können Sie einen 50 mL oder 150 mL Superloop mit einer 50 mL Spritze mit der Probe befüllen, die rAAVs enthält. Die Säule wird mit einem Gesamtvolumen von fünf CVs unter Verwendung von 12,5 % Puffer B bei einer Geschwindigkeit von 1 ml/min äquilibriert. Geben Sie das Gesamtvolumen der Probe mit der Probenpumpe (wählen Sie die Option “Alle Probe mit Luftsensor injizieren”) oder dem Superloop mit 0,5 mL/min in die Säule und sammeln Sie den Durchfluss über die Auslassöffnung in einem neuen sterilen Behälter.HINWEIS: Wenn die Durchflussregelung zur Vermeidung von Überdruck aktiviert ist, verringert sich der Durchfluss automatisch, wenn die Säule verstopft. Wenn die Flussrate deutlich unter 0,5 ml/min fällt, stoppen Sie die Probenapplikation, führen Sie eine Wäsche mit 2-5 CVs Puffer A durch und setzen Sie dann die Probenapplikation fort. Waschen Sie die Säule bei 1 ml/min mit 20 CVs Puffer A und sammeln Sie den Durchfluss über den Auslassanschluss. Eluieren Sie die Probe bei 1 ml/min nach folgendem Schema: i) linearer Gradient mit einem Ziel von 50 % des Puffers B für fünf CVs; ii) Schritt mit einem Ziel von 90 % des Puffers B während fünf CVs; iii) Schritt mit einem Ziel von 100 % des Puffers B während fünf CVs. Sammeln Sie die eluierte Probe in 1-ml-Fraktionen mit einem Fraktionssammler und Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Retention (2 mL) und lagern Sie sie bei -20 °C.HINWEIS: Die rAAV-Fraktionen können mehrere Wochen gelagert werden (Pausenpunkt). Die Säule wird bei 1 ml/min mit 12,5 % des Puffers B für fünf CVs wieder ausgeglichen. Schalten Sie die Einlässe von den Pufferlösungen auf Reinstwasser um und waschen Sie die Säule mit 1 mL/min für fünf CVs. Schalten Sie die Einlässe von Reinstwasser auf 20 % Ethanol um und waschen Sie die Säule bei 1 ml/min für fünf CVs. Trennen Sie die Säule und lagern Sie sie bei 4 °C.HINWEIS: Säulen können ohne weitere größere Reinigungs- und Desinfektionsverfahren mehrmals wiederverwendet werden, wenn derselbe rAAV-Serotyp und dasselbe Transgen verwendet werden. Waschen Sie den Flüssigkeitsströmungsweg vollständig mit 20 % Ethanol unter Verwendung manueller Anweisungen oder einer vordefinierten CIP-Methode des Systems. 5. Konzentration der gereinigten rAAV Tag 6: Konzentrationsschritt 1Konzentrieren Sie rAAVs unter Verwendung einer 15-ml-Zentrifugalfiltereinheit mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 100 kDa. Laden Sie die gewünschten Fraktionen, die rAAVs enthalten (FPLC-Fraktionen 7 bis 16), in die 15 mL Zentrifugalfiltereinheit und zentrifugieren Sie diese bei 2.000 × g für 2 min bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass das konzentrierte Volumen in der Filtereinheit ca. 500 μl beträgt. Wenn das konzentrierte Volumen 500 μl stark übersteigt, wiederholen Sie die Zentrifugationsschritte in 1-Minuten-Intervallen, bis das gewünschte Volumen erreicht ist. Tag 6 (Fortsetzung): Austausch von PuffernGeben Sie 1 ml steriles PBS in die Zentrifugalfiltereinheit, die die rAAVs enthält. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um den Filter zu waschen. Zentrifugieren Sie bei 2.000 × g in 1-min-Intervallen, bis das endgültige Volumen von 500 μl erreicht ist. Tag 6 (Fortsetzung): Konzentrationsschritt 2Die im vorherigen Schritt erhaltenen 500 μl konzentrierter rAAVs werden in eine 0,5-ml-Zentrifugalfiltereinheit mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 100 kDa überführt und 1 min lang bei 6.000 × g zentrifugiert. Wiederholen Sie gegebenenfalls den Zentrifugationsschritt, bis ein Endvolumen von weniger als 100 μl erreicht ist. Tag 6 (Fortsetzung): ErholungUm das konzentrierte rAAV zurückzugewinnen, stellen Sie das Filtergerät kopfüber in ein neues Mikrozentrifugen-Sammelröhrchen. Legen Sie das Röhrchen mit der Kappe zur Mitte hin in eine Mikrozentrifuge und drehen Sie es länger in der Durchflusskammer, um konzentrierte rAAVs vom Gerät auf das Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Alternativ bei 1.000 × g für 2 min zentrifugieren. Ergänzen Sie mit sterilem Pluronic F-68 0,001% (optional).HINWEIS: Pluronic F-68 ist ein nichtionisches Tensid, das von der Food and Drug Administration für den menschlichen Gebrauch zugelassen ist und in der Lage ist, die Verluste von rAAVs zu mildern, indem es ihre Wechselwirkungen mit den Oberflächen von Materialien (Kunststoffen) verhindert, die während der Verdünnungsvorbereitung, der Spritzenbeladung und der Verabreichungsausrüstung verwendet werden55,56. Aliquot rAAVs in Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Retention und Lagerung bei -80 °C (Pausenpunkt). 6. Quantifizierung von gereinigten rAAVs Tag 6 (Fortsetzung): Bestimmung des Titers von rAAV-Präparaten, exprimiert in viralen Genomen/μl (vg/μL), durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit (RT-qPCR) unter Verwendung eines kommerziellen Kits und gemäß den Anweisungen des Herstellers.Die rAAV-Partikellösung mit DNase I bei 37 °C für 20 min inkubieren.HINWEIS: Dieses Verfahren fördert die Verdauung von freier genomischer DNA und Plasmid-DNA, die aus Wirtszellen stammen, und stellt so sicher, dass nur die Nukleinsäuresequenz in intakten rAAV-Partikeln erhalten bleibt. DNase I bei 95 °C für 10 min hitzeinaktivieren. Lysis Buffer zugeben und 10 min bei 70 °C inkubieren, um die Hitzedenaturierung der Proteine von rAAV-Partikeln zu fördern. Verdünnen Sie die erhaltene rAAV-Genomlösung in einem Verdünnungspuffer, bevor Sie mit der RT-qPCR fortfahren. Bereiten Sie einen Satz seriell verdünnter Standards der Positivkontrolle (von 2 × 107 vg/μl bis 2 × 102 vg/μl) vor, die mit dem Kit geliefert werden. Es wird ein Reaktionsgemisch durchgeführt, das 12,5 μl Taq II-Mix, 0,5 μl verdünnte Primer-Mix, 7 μl Wasser und 5 μl verdünnte rAAV-DNA enthält (unbekannte AAV-Probe und Standards aus Schritt 6.1.4.). Führen Sie die RT-qPCR in einem Echtzeit-PCR-Nachweissystem unter Verwendung des folgenden Protokolls durch: 1 Zyklus bei 95 °C für 2 Minuten (Erstdenaturierung) und 40 Zyklen bei 95 °C für 5 s (Denaturierung) und 60 °C für 30 s (Glühen, Dehnen und Plattenlesen), gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse. Berechnen Sie die absolute Probenkonzentration aus der Standardkurve (lineare Regressionslinie) unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors, der sich aus der rAAV-Probenvorbereitung ergibt.HINWEIS: Die Quantifizierung der Anzahl der viralen Genome erfolgt durch die Amplifikation der ITR-Sequenz von AAV2 (Zielsequenz der im Kit enthaltenen Primer). 7. SDS-PAGE, Coomassie-Blaufärbung und Western Blot Denaturieren Sie 40 μl jeder Probe (jede FPLC-Fraktion, den Durchfluss, die Vorsäulenproben und insgesamt 2,3 × 1010 vg des konzentrierten Endprodukts) durch Zugabe von 6x Probenpuffer (0,5 M Tris-HCl/0,4 % Natriumdodecylsulfat (SDS) pH 6,8, 30 % Glycerin, 10 % SDS, 0,6 M Dithiothreitol (DTT), 0,012 % Bromphenolblau) und Inkubieren der Proben für 5 Minuten bei 95 °C. Laden Sie die denaturierten Proben (48 μl) in ein SDS-Polyacrylamid-Gel (4 % Stapel- und 10 % Auflösungsgel) und führen Sie die elektrophoretische Trennung bei 100 V für 70 Minuten neben einer Proteinleiter durch. ProteinanalytikHINWEIS: Es kann entweder eine Coomassie-Blaufärbung oder ein Western-Blotting durchgeführt werden.Coomassie-Blau-FärbungUm Proteinbanden sichtbar zu machen, färben Sie das Gel 10 Minuten lang mit einer 0,25%igen Coomassie-blauen G250-Lösung, die in 50 % Methanol und 10 % Essigsäure Glacial gelöst ist. Führen Sie die Gelentfärbung durch, indem Sie es mehrmals mit einer Lösung waschen, die 25 % Methanol und 5 % Essigsäure Eiszeit enthält, bis klare Streifen mit niedrigem Hintergrund sichtbar werden. Erfassen Sie Bilder mit einem geeigneten Bildgebungssystem. Western-BlotÜbertragen Sie die Proteine gemäß den Standardprotokollen auf eine PVDF-Membran. Blockieren Sie die Membran durch Inkubation in 5 % fettfreier Milch, verdünnt in TBS-T (0,1 % Tween 20 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung) für 1 h bei Raumtemperatur. Für die Inkubation über Nacht bei 4 °C sind die folgenden Primärantikörper (in Blockierungslösung verdünnt) zu verwenden: monoklonaler Maus-Anti-AAV-Antikörper VP1, VP2, VP3 (B1, 1:1.000) oder monoklonaler Maus-Anti-AAV-Antikörper VP1, VP2 (A69, 1:1.000). Die Membranen 3 x 15 min in TBS-T waschen und mit einem alkalischen Phosphatase-gekoppelten Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:10.000) 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Membranen 3 x 15 min in TBS-T. Fügen Sie ein verbessertes Chemifluoreszenzsubstrat (ECF) hinzu und visualisieren Sie Proteinbanden durch Chemifluoreszenzbildgebung. 8. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Legen Sie ein mit Formvar-Kohlenstoff beschichtetes 200-Mesh-Gitter kopfüber auf einen Tropfen einer rAAV-Probe und lassen Sie es 1 Minute lang absetzen. Waschen Sie die Gitter in einem Tropfen Wasser und trocknen Sie den Flüssigkeitsüberschuss mit Filterpapier ab. Färben Sie die Gitter 1 Minute lang negativ mit 1%iger Uranylacetatlösung (pH 7), um die Viruspartikel zu fixieren und zu kontrastieren. Waschen Sie die Gitter in einem Tropfen Wasser und trocknen Sie den Flüssigkeitsüberschuss mit Filterpapier ab. Untersuchen Sie die Proben in einem Transmissionselektronenmikroskop.HINWEIS: Hohe Salzkonzentrationen können sich direkt auf die Bindung von rAAVs an das Gitter auswirken und zur Visualisierung kristallartiger Strukturen führen. 9. Konsekutive Absorption von ultraviolettem und sichtbarem Licht, statische Lichtstreuung und dynamische Lichtstreuanalyse Laden Sie auf eine 96-Well-Quantifizierungsplatte 2 μl einer rAAV-Probe und 2 μl PBS, um sie als Pufferrohling zu verwenden (führen Sie dies in Duplikaten durch). Verwenden Sie die AAV Quant-Anwendung in der Client-Analysesoftware, platzieren Sie die Namen der Proben an der richtigen Stelle der Platte, wählen Sie den AAV-Serotyp aus und klicken Sie auf Weiter. Legen Sie die 96-Well-Quantifizierungsplatte in das spezielle Gerät ein und fahren Sie mit der Plattenablesung für die Datenerfassung fort. 10. In-vitro-Transduktionsassays Verschiedene Zelllinien können verwendet werden, um die Transduktionseffizienz von rAAVs schnell zu analysieren.Gleichmäßige Aussaat HEK293T Zellen in 24-Well-Platten (bei einer Dichte von 137.500 Zellen/Well) und eine Maus-Neuroblastom-2A (Neuro2a)-Zelllinie entweder in 24-Well-Platten (50.000 Zellen/Well) oder in einem 8-Well-Kammerobjektträger (27.000 Zellen/Well) unter Verwendung von DMEM mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin, wie oben beschrieben. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 anhaften. Sammeln Sie konditioniertes Medium aus jeder Vertiefung (250 μl von 24-Well-Platten und 50 μl von der 8-Well-Kammer) und lagern Sie es bei 4 °C für die spätere Verwendung. Geben Sie die folgenden rAAV-Präparate in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C in einer 5 % CO2 -Atmosphäre.50 μl der FPLC-gesammelten Fraktionen F2-F16 zugeben und in HEK293T Zellen durchfließen, die in 24-Well-Platten plattiert sind. Geben Sie insgesamt 5,5 × 109 vg der konzentrierten rAAVs, verdünnt in 50 μl PBS, zu Neuro2a-Zellen, die in 24-Well-Platten plattiert sind, (fügen Sie eine Negativkontrollvertiefung hinzu, indem Sie den Zellen 50 μl PBS zusetzen). Geben Sie insgesamt 2,75 × 109 vg der konzentrierten rAAVs, verdünnt in 25 μl PBS, zu Neuro2a-Zellen, die in einem 8-Well-Kammerobjektträger plattiert sind (schließen Sie die negative Kontrollbedingung ein, indem Sie den Zellen 50 μl PBS zusetzen). Das zuvor gelagerte konditionierte Medium (Schritt 10.1.2) wird in jede Vertiefung gegeben und 24 Stunden lang inkubiert. Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen 2x mit PBS. Eine 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung, ergänzt mit 4% Saccharose in PBS, vorgewärmt auf 37 °C, in jede Vertiefung geben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 2x mit PBS waschen und bei 4 °C lagern, bis die Bildgebung durchgeführt wird (Pausenpunkt). Erfassen Sie Bilder mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 10x/0,30-Objektiv ausgestattet ist, oder einem inversen konfokalen Mikroskop, das mit einem 40x/1,4 Öl-DIC-Objektiv ausgestattet ist. Um ein relevanteres und reflektierenderes Modell der In-vivo-Umgebung zu erhalten, verwenden Sie primäre neuronale Kulturen wie folgt:Bereiten Sie Primärkulturen von kortikalen Neuronen vor, wie zuvor von Santos et al. beschrieben.57. Kurz gesagt, 200.000 Zellen/ml in 12-Well-Platten aussäen und bis zum Tag in vitro in Kultur aufbewahren 16. Sammeln Sie konditioniertes Medium aus jeder Vertiefung (100 μl) und lagern Sie es bei 4 °C für die spätere Verwendung. In jede Vertiefung werden die zu testenden rAAV gegeben: insgesamt 2,75 × 109 vg der konzentrierten rAAVs, verdünnt in 25 μl PBS (einschließlich der Negativkontrolle: 25 μl PBS). 24 h bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubieren. Fügen Sie das zuvor gelagerte konditionierte Medium hinzu und inkubieren Sie es 24 Stunden lang. Entsorgen Sie das Medium in jeder Vertiefung und waschen Sie es 2x mit PBS. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % PFA/4 % Saccharose in PBS, wie in Schritt 10.1.6 beschrieben. 2x mit PBS waschen. Inkubieren Sie jede Vertiefung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 5 μg/ml Weizenkeimaggglutinin (WGA), konjugiert mit Alexa Fluor 633 (optionaler Schritt: stattdessen Immunzytochemie durchführen). 2x mit PBS waschen. In 0,25% Triton X-100 in PBS 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Mit PBS waschen. Inkubieren Sie mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 5 min bei Raumtemperatur. 2x mit PBS waschen. Erfassen Sie Bilder mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 40x/0,95-Objektiv ausgestattet ist, oder einem inversen konfokalen Mikroskop, das mit einem 40x/1,4 Öl-DIC-Objektiv ausgestattet ist. 11. In-vivo-Experimente HINWEIS: Die Tiere wurden in einem klimatisierten Raum untergebracht, der in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten wurde. Nahrung und Wasser wurden ad libitum zur Verfügung gestellt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leid der Tiere so gering wie möglich zu halten. Stereotaktische Injektion in das KleinhirnBetäubung von 9 Wochen alten C57BL/6-Tieren durch Inhalation von 2 % Isofluran in Gegenwart von Sauerstoff (0,8 l/min) in einer Kammer, die mit einem Verdampfer verbunden ist. Legen Sie das anästhesierte Tier in den stereotaktischen Apparat (auf ein 35 °C erwärmtes Pad) und setzen Sie die Isofluranmaske in die Nase des Tieres ein. Senken Sie den Isofluranspiegel auf 1,3-1,7%.HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass das Tier korrekt betäubt ist, bevor Sie fortfahren (Verlust des Beugereflexes in beiden Hintergliedmaßen). Tragen Sie eine Gleitaugensalbe auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu vermeiden, und injizieren Sie dem Tier ein zugelassenes Analgetikum.HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Nach der Rasur des Kopffells des Tieres und der Desinfektion des Operationsbereichs legen Sie den Schädel frei und platzieren Sie die Spitze einer 30-G-Injektionsnadel mit stumpfer Spitze, die mit einer 10-μl-Hamilton-Spritze verbunden ist, direkt über Bregma (verwenden Sie Bregma als Null für die Berechnung der stereotaktischen Koordinaten). Bewegen Sie die Nadel auf die vorgesehene Koordinate und bohren Sie ein Loch durch den Schädel, in das die Nadel eintritt.HINWEIS: Im Rahmen dieser Studie wurde eine einzelne Injektion zentral im Kleinhirn durchgeführt. Injizieren Sie 4 μl einer rAAV-Lösung, die insgesamt 8 × 109 vg, verdünnt in PBS, mit einer Infusionsrate von 0,5 μl/min unter Verwendung eines automatischen Injektors. Verwenden Sie die folgenden, aus Bregma berechneten Koordinaten, um eine einzelne Injektion zentral in das Kleinhirn einer erwachsenen C57BL/6-Maus durchzuführen: antero-posterior: -6,5 mm; seitlich: 0 mm; Bauch: -2,9 mm.HINWEIS: Diese Koordinaten können je nach Mausstamm, Geschlecht und Alter der verwendeten Tiere variieren. Um den Rückfluss zu minimieren und die Diffusion des viralen Vektors zu ermöglichen, belassen Sie die Spritzennadel nach Abschluss der Infusion 3 Minuten lang an diesen Koordinaten, ziehen Sie sie dann langsam um 0,3 mm zurück und lassen Sie sie weitere 2 Minuten an Ort und Stelle bleiben, bevor sie vollständig aus dem Gehirn der Maus entfernt wird. Schließen Sie den Schnitt und reinigen Sie ihn mit einem Desinfektionsmittel (z. B. 10% Povidon-Jod). Lassen Sie die Tiere sich von der Narkose erholen, bevor Sie sie in ihre Käfige zurückbringen. Gewebeentnahme und -aufbereitungHINWEIS: In diesem Experiment wurden die Transduktionsniveaus 12 Wochen nach der Injektion beobachtet, aber das gleiche Verfahren konnte bereits 4 Wochen nach der Injektion evaluiert werden.Betäubung der Tiere durch intraperitoneale Verabreichung einer Überdosis Xylazin/Ketamin (8/160 mg/kg Körpergewicht). Die Tiere werden transkardial für 6 min mit eiskaltem PBS mit einer Geschwindigkeit von 2,5 mL/min perfundiert, gefolgt von der Perfusion mit einer frisch zubereiteten eiskalten 4%igen PFA-Lösung für 10 min mit der gleichen Rate. Das herausgeschnittene Gehirn wird über Nacht bei Raumtemperatur in 4 % PFA fixiert und dann zur Kryoprotektion in eine 25 %ige Saccharose/PBS-Lösung überführt. Sobald das Gehirn absinkt (ca. 48 h später), lagern Sie es bei -80 °C. Schneiden Sie serielle sagittale Schnitte mit einer Dicke von 30 μm mit einem Kryostaten bei -21 °C. Sammeln Sie für jedes Tier 96 sagittale Schnitte einer Gehirnhalbkugel in anatomischen Reihen als frei schwebende Schnitte in PBS, ergänzt mit 0,05 % Natriumazid. Bis zur weiteren Verarbeitung bei 4 °C lagern. Standard-Fluoreszenz-ImmunhistochemieWählen Sie acht sagittale Schnitte pro Tier in einem Abstand von 240 μm zueinander. Die frei schwebenden Abschnitte werden 1 h lang bei Raumtemperatur in Blockierungs-/Permeabilisierungslösung (0,1 % Triton X-100 mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) in PBS) inkubiert. Die Schnitte werden über Nacht bei 4 °C mit einem polyklonalen Anti-GFP-Primärantikörper (1:1.000) inkubiert. 3 x 15 min in PBS waschen und die Schnitte 2 h lang bei Raumtemperatur mit dem sekundären Antikörper polyklonaler Anti-Hühner-Antikörper inkubieren, der an Alexa Fluor 488 Fluorophor (1:200) konjugiert ist. 3 x 15 min in PBS waschen. Mit DAPI 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 3 x 15 min in PBS waschen. Legen Sie die Schnitte in gelatinebeschichtete Objektträger und Deckglas mit Fluoreszenzeindeckmedium. Erfassen Sie Bilder mit einem Dia-Scanner-Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 20x/0,8-Objektiv ausgestattet ist.