Isolement de vecteurs viraux adéno-associés au moyen d’un protocole de chromatographie d’affinité d’héparine en une seule étape et semi-automatisé

REMARQUE : Voir la figure 1 pour une illustration résumant le protocole. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ce protocole. Tous les travaux impliquant des cellules et des virus doivent être effectués dans des enceintes et des incubateurs de biosécurité dédiés, séparés de ceux régulièrement utilisés pour la maintenance des lignées cellulaires. L’équipement et les réactifs entrant en contact avec les cellules cultivées et les virus doivent être stériles. Il est essentiel que l’élimination des réactifs dangereux et des matières contaminées par des virus soit effectuée conformément aux fiches de données de sécurité et aux lois et directives nationales fournies par le bureau de l’environnement, de la santé et de la sécurité de chaque établissement. En avril 2019, les lignes directrices des NIH pour la recherche impliquant des molécules d’acide nucléique recombinantes ou synthétiques classent comme agents du groupe de risque 1 (non associés à la maladie chez les humains adultes en bonne santé) tous les sérotypes d’AAV, ainsi que les constructions d’AAV recombinantes ou synthétiques. Cette classification s’applique lorsque le transgène ne code pas pour un produit génique potentiellement tumorigène ou une toxine, et que les constructions sont produites sans virus auxiliaire. Toutes les expériences sur des animaux ont été réalisées dans le respect de la directive de la Communauté européenne (2010/63/UE) sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, transposée dans la loi portugaise en 2013 (décret-loi 113/2013). De plus, les procédures animales ont été approuvées par l’Organisation responsable pour le bien-être animal de la Faculté de médecine et le Centre de neurosciences et de biologie cellulaire de l’animalerie agréée de l’Université de Coimbra. Les chercheurs ont reçu une formation adéquate (cours certifié par la FELASA) et une certification des autorités portugaises (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lisbonne, Portugal) pour réaliser les expériences. 1. Constructions plasmidiques Suivez les instructions du fabricant d’une trousse sans endotoxines maxiprep pour isoler et purifier des quantités substantielles d’ADN des plasmides suivants : i) pITR : le vecteur de transfert d’intérêt ; ii) plasmide pAAV-RC : pRV1, contenant les séquences AAV2 Rep et Cap 36 ; iii) plasmide pAAV-RC : pH21, contenant les séquences AAV1 Rep et Cap 36 ; iv) plasmide pAAV-RC : pAAV2/9n, contenant les séquences AAV2 Rep et AAV9 Cap ; v) pHelper : pFdelta6, plasmide36 auxiliaire de l’adénovirus. Examinez l’intégrité des plasmides générés en appliquant les restrictions enzymatiques recommandées36. Surveiller l’intégrité des plasmides pITR par digestion avec SmaI, une endonucléase de restriction, qui coupe deux fois dans une portion instable des RTI 53,54.REMARQUE : Étant donné que les ITR sont très instables et sensibles aux délétions, l’utilisation de cellules supercompétentes SURE 2 est recommandée pour minimiser la recombinaison dans ces sites. 2. Culture cellulaire Cultiver un rein embryonnaire humain 293, exprimant de manière stable la lignée cellulaire du grand antigène T (HEK293T) SV40 dans le milieu modifié Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, avec un taux de glucose élevé de 10 % de fœtus de bovin et 1 % de pénicilline-streptomycine, à 37 °C, sous une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2, comme point de départ pour les étapes suivantes. Sous-cultivez les cellules à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, pH 7,4, pour laver les cellules avant d’ajouter 0,05 % d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA).REMARQUE : Évitez d’utiliser des cellules qui ont subi un nombre excessif de passages (maximum 20). Testez régulièrement les cultures cellulaires pour détecter la contamination par les mycoplasmes. 3. Production de rAAV par transfection transitoire Jour 1 : Placage cellulairePour chaque production virale, déposer HEK293T les cellules dans 10 boîtes de culture traitées (15 cm de diamètre) la veille de la transfection, à une densité de 10,5 × 106 cellules par boîte dans 22 mL de milieu de culture supplémenté et incuber pendant 24 h jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 70 % à 80 % et prêtes pour la transfection. Jour 2 : Transfection cellulaire à l’aide de polyéthylénimine (PEI)Pour chaque production virale (équivalant à 10,5 boîtes), mettre en place le mélange de transfection suivant dans un tube de microcentrifugation : 54,6 μg de pITR ; 45,675 μg de pRV1 ; 45,675 μg de pH21 ou pAAV2/9n ; 109,2 μg de pFdelta6. Mélanger en tapotant Ajouter le mélange à 4,557 mL de DMEM non supplémenté dans un tube à centrifuger de 50 mL. Mélanger en tapotant Ajouter 1,365 mL de solution stérile d’IPE à 1 mg/mL (pH 7,4), goutte à goutte. Mélanger en tapotant Incuber pendant 10 min à température ambiante pour permettre la formation de complexes ADN-PEI. Ajouter ce mélange à 231 ml de DMEM supplémenté préchauffé. Remplacer tout le milieu de culture de chaque plat par 22 mL de ce mélange de transfection. Incuber les cellules pendant 48 h.REMARQUE : Cette étape doit être effectuée avec soin pour éviter le détachement des cellules. Jour 4 : Récolte de cellulesLorsque le pITR code un rapporteur fluorescent, visualisez les cellules transfectées au microscope à fluorescence. Recueillir le milieu de chaque plat dans des tubes à centrifuger de 50 mL et les centrifuger à 800 × g pendant 10 min. Jetez le surnageant.REMARQUE : Cette étape est facultative et vise à récupérer les cellules transfectées qui peuvent s’être détachées en raison d’une très forte confluence. Ajouter 10 ml de PBS préchauffé dans chaque assiette. Retirez délicatement les cellules à l’aide d’un grattoir à cellules et recueillez la suspension dans les tubes à centrifuger de 50 ml à partir de l’étape 3.3.2. Lavez 5 plats à la fois avec 10 ml de PBS supplémentaires et transférez la suspension dans les tubes à centrifuger de 50 ml à partir de l’étape 3.3.3. Granulez les cellules à 800 × g pendant 10 min et jetez le surnageant. Congelez les granulés de cellule à -80 °C.REMARQUE : Les granulés de cellules peuvent être conservés pendant plusieurs mois (point de pause). 4. Extraction rAAV et purification FPLC Jour 5 : Préparation du lysat cellulaireDécongelez les granulés de cellules à température ambiante. Remettre en suspension les cellules prélevées dans les 10 boîtes dans 100 mL d’un tampon stérile contenant 150 mM de chlorure de sodium (NaCl) et 20 mM de Tris, pH 8,0, dans de l’eau ultrapure (type I). Mélanger la suspension par pipetage de haut en bas, pour assurer une suspension homogène. Ajouter 12,5 mL d’une solution stérile fraîchement préparée de désoxycholate de sodium à 10 % dans de l’eau ultrapure pour induire la lyse cellulaire. Mélanger par pipetage de haut en bas.REMARQUE : Éliminer le désoxycholate de sodium, ainsi que les matières qui y sont en contact, conformément à la fiche signalétique et aux lignes directrices fournies par le bureau de l’hygiène et de la sécurité environnementales de l’établissement. Il est également recommandé de porter un masque facial lors de la manipulation de cette poudre. Après mélange, la solution devient très visqueuse. Ajouter 27 μL de nucléase de benzonase au mélange précédent. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas jusqu’à ce que l’échantillon ne soit plus visqueux. Incuber à 37 °C pendant 1 h, en effectuant un vortex toutes les 10 min.REMARQUE : Cette endonucléase est capable de dégrader efficacement toutes les formes d’ADN et d’ARN sans présenter d’activité protéolytique. Éliminer les débris cellulaires en centrifugeant le mélange à 3 000 × g pendant 60 min à 25 °C. Filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre à seringue stérile en polyfluorure de vinylidène (PVDF) de 0,45 μm et transférez-le dans un nouveau récipient stérile.REMARQUE : Cette étape importante garantit que la plupart des débris cellulaires sont éliminés, empêchant ainsi le colmatage des colonnes de chromatographie. Conservez une petite partie aliquote de ce mélange pour l’analyse (étape facultative). Jour 5 (suite) : Purification de la colonne d’héparine des rAAVREMARQUE : L’application de l’échantillon peut être effectuée à l’aide d’une pompe d’échantillonnage ou d’un superloop de 50 ml ou 150 ml dans le cadre du système. Étant donné qu’une plus grande quantité d’air est dissoute à des températures plus basses, il est important de laisser suffisamment de temps aux tampons et aux solutions (généralement stockés à 4 °C) pour s’acclimater à la température ambiante avant de les utiliser dans le système FPLC.Facultatif : Si le système a été stocké pendant de longues périodes, remplissez le système et toutes les entrées avec une solution de stockage fraîchement préparée (éthanol à 20 %) en suivant des instructions manuelles ou une méthode de nettoyage en place prédéfinie du système (NEP du système). Lavez complètement le chemin d’écoulement du liquide avec de l’eau ultrapure stérile à l’aide d’instructions manuelles ou d’une méthode CIP prédéfinie du système. Connectez une colonne d’héparine préemballée de 1 ml, réglez l’alarme de pression et lavez avec cinq volumes de colonne (CV) d’eau ultrapure à un débit de 1 mL/min. Basculez les solutions dans le bac tampon de l’eau ultrapure au tampon A (solution stérile de 100 mM de NaCl et 20 mM de Tris, pH 8, dans de l’eau ultrapure) pour l’entrée A (pompe du système A) et du tampon B (solution stérile de 500 mM de NaCl et 20 mM de Tris, pH 8, dans de l’eau ultrapure) pour l’entrée B (pompe du système B). Si le système est équipé d’une pompe d’échantillonnage, placez l’entrée du tampon de la vanne d’entrée d’échantillon dans le tampon A. Lavez la pompe du système B avec le tampon B et remplissez le reste du chemin d’écoulement du liquide avec le tampon A.REMARQUE : Si nécessaire, déconnectez la colonne du chemin d’écoulement et reconnectez-la par la suite. Insérez un tube d’entrée d’échantillon à partir de la vanne d’entrée d’échantillon, par exemple S1, dans le récipient contenant la préparation virale obtenue à l’étape 4.1.4. (à partir de la préparation de lysat cellulaire). Amorcez le chemin d’écoulement de l’entrée de l’échantillon S1 à la vanne d’injection avec la solution de l’échantillon. Vous pouvez également remplir une superloop de 50 mL ou 150 mL avec l’échantillon contenant des rAAV à l’aide d’une seringue de 50 mL. Équilibrer la colonne avec un volume total de cinq CV en utilisant 12,5 % de tampon B à un débit de 1 mL/min. Appliquez le volume total de l’échantillon dans la colonne à l’aide de la pompe d’échantillonnage (sélectionnez injecter tout l’échantillon à l’aide du capteur d’air) ou du superloop à 0,5 mL/min et recueillez l’écoulement à l’aide de l’orifice de sortie dans un nouveau récipient stérile.REMARQUE : Lorsque la fonction de contrôle de débit pour éviter la surpression est activée, le débit diminuera automatiquement en cas de colmatage de la colonne. Si le débit descend considérablement en dessous de 0,5 mL/min, arrêtez l’application de l’échantillon, effectuez un lavage avec 2 à 5 CV de tampon A, puis reprenez l’application de l’échantillon. Laver la colonne à 1 mL/min avec 20 CV de tampon A, en recueillant le flux à l’aide de l’orifice de sortie. Éluer l’échantillon à 1 mL/min avec le schéma suivant : i) gradient linéaire avec une cible de 50 % du tampon B pour cinq CV ; ii) étape avec un objectif de 90 % de la zone tampon B pendant cinq CV ; iii) étape avec un objectif de 100 % de la zone tampon B pendant cinq CV. Prélever l’échantillon élué en fractions de 1 mL à l’aide d’un collecteur de fractions et de tubes de microcentrifugation à faible rétention (2 mL) et les stocker à -20 °C.REMARQUE : Les fractions rAAV peuvent être conservées pendant plusieurs semaines (point de pause). Rééquilibrer la colonne à 1 mL/min avec 12,5 % de tampon B pour cinq CV. Remplacez les entrées des solutions tampons par de l’eau ultrapure et lavez la colonne à 1 mL/min pendant cinq CV. Passez de l’eau ultra-pure à l’éthanol à 20 % et lavez la colonne à 1 mL/min pendant cinq CV. Débranchez la colonne et stockez-la à 4 °C.REMARQUE : Les colonnes peuvent être réutilisées plusieurs fois sans aucune autre procédure de nettoyage et d’assainissement majeure si le même sérotype et le même transgène rAAV sont utilisés. Lavez complètement le chemin d’écoulement du liquide avec de l’éthanol à 20 % en suivant les instructions manuelles ou une méthode CIP prédéfinie du système. 5. Concentration des rAAV purifiés Jour 6 : Étape de concentration 1Concentrez les rAAV à l’aide d’une unité de filtration centrifuge de 15 mL avec une coupure de poids moléculaire de 100 kDa. Chargez les fractions souhaitées contenant des rAAV (fractions FPLC 7 à 16) dans l’unité de filtration centrifuge de 15 mL et centrifugez-la à 2 000 × g pendant 2 min à température ambiante. Assurez-vous que le volume concentré dans l’unité de filtration est d’environ 500 μL. Si le volume concentré dépasse largement 500 μL, répétez les étapes de centrifugation à intervalles de 1 minute jusqu’à ce qu’il atteigne le volume souhaité. Jour 6 (suite) : Échange de tamponsAjouter 1 mL de PBS stérile dans l’unité de filtration centrifuge contenant les rAAV. Pipetez soigneusement de haut en bas pour laver le filtre. Centrifuger à 2 000 × g par intervalles de 1 min jusqu’à ce que le volume final de 500 μL soit atteint. Jour 6 (suite) : Étape de concentration 2Transvaser les 500 μL de rAAV concentrés obtenus à l’étape précédente dans une unité de filtration centrifuge de 0,5 mL avec une coupure de poids moléculaire de 100 kDa et centrifuger à 6 000 × g pendant 1 min. Si nécessaire, répétez l’étape de centrifugation jusqu’à ce qu’un volume final inférieur à 100 μL soit atteint. Jour 6 (suite) : RécupérationPour récupérer le rAAV concentré, placez le dispositif de filtration à l’envers dans un nouveau tube de prélèvement de microcentrifugeuse. Placez le tube dans une microcentrifugeuse avec le capuchon vers le centre et effectuez une rotation prolongée à l’intérieur de la chambre d’écoulement pour transférer les rAAV concentrés de l’appareil vers le tube de la microcentrifugeuse. Vous pouvez également centrifuger à 1 000 × g pendant 2 min. Supplément avec du Pluronic F-68 stérile 0,001% (facultatif).REMARQUE : Pluronic F-68 est un tensioactif non ionique approuvé pour un usage humain par la Food and Drug Administration qui est capable d’atténuer les pertes de rAAV en empêchant leurs interactions avec les surfaces des matériaux (plastiques) utilisés lors de la préparation de la dilution, du chargement de la seringue et de l’équipement d’administration55,56. Aliquote des rAAV dans des tubes de microcentrifugation à faible rétention et stockez-les à -80 °C (point de pause). 6. Quantification des rAAV purifiés Jour 6 (suite) : Déterminer le titre des préparations de rAAV, exprimé en génomes viraux/μL (vg/μL), par réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (RT-qPCR) à l’aide d’un kit commercial et en suivant les instructions du fabricant.Incuber la solution de particules rAAV avec la DNase I à 37 °C pendant 20 min.REMARQUE : Cette procédure favorise la digestion de l’ADN génomique libre et de l’ADN plasmidique dérivé des cellules hôtes, garantissant ainsi que seule la séquence d’acide nucléique à l’intérieur des particules intactes de rAAV est préservée. Inactiver thermiquement la DNase I à 95 °C pendant 10 min. Ajouter le tampon de lyse et incuber pendant 10 min à 70 °C pour favoriser la dénaturation thermique des protéines des particules rAAV. Diluer la solution du génome rAAV obtenue dans un tampon de dilution avant de passer à la RT-qPCR. Préparer un ensemble d’étalons dilués en série du témoin positif (de 2 × 107 vg/μL à 2 ×10 2 vg/μL) fournis avec le kit. Effectuer un mélange réactionnel contenant 12,5 μL de mélange Taq II, 0,5 μL de mélange d’amorces diluées, 7 μL d’eau et 5 μL d’ADN rAAV dilué (échantillon et étalons AAV inconnus de l’étape 6.1.4.). Effectuez la RT-qPCR dans un système de détection PCR en temps réel, en utilisant le protocole suivant : 1 cycle à 95 °C pendant 2 min (dénaturation initiale) et 40 cycles à 95 °C pendant 5 s (dénaturation) et 60 °C pendant 30 s (recuit, extension et lecture de plaque), suivi d’une analyse de la courbe de fusion. Calculer la concentration absolue de l’échantillon à partir de la courbe standard (droite de régression linéaire), en tenant compte du facteur de dilution résultant de la préparation de l’échantillon rAAV.REMARQUE : La quantification du nombre de génomes viraux est réalisée par l’amplification de la séquence ITR d’AAV2 (séquence cible des amorces fournies par le kit). 7. SDS-PAGE, coloration au bleu Coomassie et western blot Dénaturer 40 μL de chaque échantillon (chaque fraction de FPLC ; le flux continu ; les échantillons de précolonne et un total de 2,3 × 1010 vg du produit concentré final) en ajoutant 6 tampons d’échantillon (0,5 M de Tris-HCl/0,4 % de dodécylsulfate de sodium (SDS) pH 6,8, 30 % de glycérol, 10 % de SDS, 0,6 M de dithiothréitol (DTT), 0,012 % de bleu de bromophénol) et en incubant les échantillons pendant 5 min à 95 °C. Charger les échantillons dénaturés (48 μL) dans un gel de polyacrylamide SDS (gel d’empilement à 4 % et gel de résolution à 10 %) et effectuer la séparation électrophorétique à 100 V pendant 70 min, à côté d’une échelle protéique. Analyse des protéinesREMARQUE : Une coloration au bleu de Coomassie ou un western blot peut être effectué.Coloration au bleu de CoomassiePour visualiser les bandes de protéines, colorez le gel pendant 10 minutes avec une solution de bleu de Coomassie G250 à 0,25 % dissoute dans du méthanol à 50 % et de l’acide acétique glacial à 10 %. Effectuez la décoloration du gel en le lavant plusieurs fois avec une solution contenant 25% de méthanol et 5% d’acide acétique glacial jusqu’à ce que des bandes claires avec un faible bruit de fond deviennent visibles. Capturez des images à l’aide d’un système d’imagerie approprié. Transfert WesternTransférez les protéines sur une membrane PVDF selon les protocoles standard. Bloquer la membrane par incubation dans du lait écrémé à 5 % dilué dans du TBS-T (0,1 % de Tween 20 dans une solution saline tamponnée au Tris) pendant 1 h à température ambiante. Utiliser les anticorps primaires suivants (dilués dans une solution bloquante) pour l’incubation nocturne à 4 °C : anticorps monoclonaux anti-AAV de souris, anticorps anti-AAV monoclonaux de souris, anticorps anti-AAV VP1, VP2 (B1, 1:1 000) ou anticorps monoclonaux anti-AAV de souris, VP1, anticorps anti-VP2 (A69, 1:1 000). Laver les membranes pendant 3 x 15 min dans du TBS-T et incuber avec un anticorps secondaire de chèvre anti-souris lié à la phosphatase alcaline (1:10 000), pendant 2 h à température ambiante. Laver les membranes pendant 3 x 15 min dans du TBS-T. Ajoutez un substrat de chimifluorescence amélioré (ECF) et visualisez les bandes de protéines par imagerie par chimifluorescence. 8. Microscopie électronique à transmission (MET) Placez une grille de 200 mailles recouverte de carbone Formvar à l’envers sur une goutte d’échantillon rAAV et laissez-la reposer pendant 1 min. Lavez les grilles dans une goutte d’eau et séchez l’excès de liquide avec du papier filtre. Colorez négativement les grilles avec une solution d’acétate d’uranyle à 1 % (pH 7) pendant 1 min pour fixer et contraster les particules virales. Lavez les grilles dans une goutte d’eau et séchez l’excès de liquide avec du papier filtre. Examinez les échantillons au microscope électronique à transmission.REMARQUE : Des concentrations élevées de sel peuvent avoir un impact direct sur la liaison des rAAV à la grille et conduire à la visualisation de structures cristallines. 9. Analyse consécutive de l’absorption de la lumière ultraviolette-visible, de la diffusion statique de la lumière et de la diffusion dynamique de la lumière Sur une plaque de quantification à 96 puits, chargez 2 μL d’un échantillon rAAV et 2 μL de PBS à utiliser comme blanc tampon (effectuez cette opération en doubles). Utilisez l’application AAV Quant dans le logiciel d’analyse du client, placez les noms des échantillons au bon endroit de la plaque, sélectionnez le sérotype AAV et cliquez sur Suivant. Chargez la plaque de quantification à 96 puits dans l’équipement dédié et procédez à la lecture de la plaque pour l’acquisition des données. 10. Essais de transduction in vitro Différentes lignées cellulaires peuvent être utilisées pour analyser rapidement l’efficacité de transduction des rAAV.Ensemencer uniformément HEK293T cellules dans des plaques à 24 puits (à une densité de 137 500 cellules/puits) et une lignée cellulaire de neuroblastome-2A de souris (Neuro2a) dans des plaques à 24 puits (50 000 cellules/puits) ou dans une lame à 8 puits (27 000 cellules/puits), en utilisant du DMEM à haute teneur en glucose, complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine, comme décrit ci-dessus. Laisser les cellules adhérer toute la nuit à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Prélever le milieu conditionné de chaque puits (250 μL des plaques à 24 puits et 50 μL de la lame de chambre à 8 puits) et le stocker à 4 °C pour une utilisation ultérieure. Ajouter les préparations rAAV suivantes dans chaque puits et incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 .Ajouter 50 μL des fractions F2-F16 recueillies par le FPLC et les faire circuler dans HEK293T cellules plaquées dans des plaques à 24 puits. Ajouter un total de 5,5 × 109 vg des rAAV concentrés dilués dans 50 μL de PBS aux cellules Neuro2a plaquées dans des plaques à 24 puits (inclure un puits de contrôle négatif, en ajoutant 50 μL de PBS aux cellules). Ajouter un total de 2,75 × 109 vg des rAAV concentrés dilués dans 25 μL de PBS aux cellules Neuro2a plaquées dans une lame de chambre à 8 puits (inclure la condition de contrôle négatif, en ajoutant 50 μL de PBS aux cellules). Ajouter le milieu conditionné préalablement stocké (étape 10.1.2) dans chaque puits et incuber pendant 24 h. Jetez le milieu et lavez les cellules 2 fois avec du PBS. Ajouter une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %, complétée par du saccharose à 4 % dans du PBS, préchauffé à 37 °C, dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 20 min. Laver 2 fois avec du PBS et conserver à 4 °C jusqu’à ce que l’imagerie soit effectuée (point de pause). Acquérez des images sur un microscope à fluorescence inversée équipé d’un objectif 10x/0,30, ou un microscope confocal inversé équipé d’un objectif 40x/1,4 Oil DIC. Pour avoir un modèle plus pertinent et plus représentatif de l’environnement in vivo , utilisez les cultures neuronales primaires comme suit :Préparer des cultures primaires de neurones corticaux comme décrit précédemment par Santos et al.57. En bref, ensemencer 200 000 cellules/mL dans des plaques à 12 puits et les maintenir en culture jusqu’au jour in vitro 16. Prélever le milieu conditionné de chaque puits (100 μL) et le stocker à 4 °C pour une utilisation ultérieure. Ajouter les rAAV à tester dans chaque puits : un total de 2,75 × 109 vg de rAAV concentrés dilués dans 25 μL de PBS (inclure le témoin négatif : 25 μL de PBS). Incuber pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère à 5% de CO2 . Ajouter le milieu conditionné préalablement stocké et incuber pendant 24 h. Jetez le milieu dans chaque puits et lavez-le 2 fois avec du PBS. Fixer les cellules avec 4 % de PFA/4 % de saccharose dans du PBS, comme décrit à l’étape 10.1.6. Laver 2 fois avec du PBS. Incuber chaque puits avec 5 μg/mL d’agglutinine de germe de blé (WGA) conjuguée à Alexa Fluor 633 pendant 10 min à température ambiante (étape facultative : effectuer plutôt une immunocytochimie). Laver 2 fois avec du PBS. Incuber dans 0,25% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Laver avec du PBS. Incuber avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min à température ambiante. Laver 2 fois avec du PBS. Acquérez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’un objectif 40x/0,95 ou d’un microscope confocal inversé équipé d’un objectif 40x/1,4 Oil DIC. 11. Expériences in vivo REMARQUE : Les animaux ont été logés dans une pièce à température contrôlée, maintenue selon un cycle lumière/obscurité de 12 heures. De la nourriture et de l’eau ont été fournies ad libitum. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale. Injection stéréotaxique dans le cerveletAnesthésier des animaux C57BL/6 âgés de 9 semaines par inhalation d’isoflurane à 2 % en présence d’oxygène (0,8 L/min) dans une chambre reliée à un vaporisateur. Placez l’animal anesthésié dans l’appareil stéréotaxique (sur un tampon chauffé à 35 °C) et placez le masque à l’isoflurane dans le nez de l’animal. Baissez le niveau d’isoflurane à 1,3-1,7 %.REMARQUE : S’assurer que l’animal est correctement anesthésié avant de procéder (perte du réflexe de flexion dans les deux membres postérieurs). Appliquez une pommade oculaire lubrifiante pour éviter le dessèchement des cornées et injectez à l’animal un analgésique approuvé.REMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles. Après avoir rasé la fourrure de la tête de l’animal et désinfecté la zone chirurgicale, exposez le crâne et placez l’extrémité d’une aiguille d’injection à bout émoussé de 30 G, reliée à une seringue Hamilton de 10 μL, directement sur bregma (utilisez bregma comme zéro pour le calcul des coordonnées stéréotaxiques). Déplacez l’aiguille à la coordonnée prévue et percez un trou dans le crâne où l’aiguille entrera.REMARQUE : Dans le cadre de cette étude, une seule injection a été réalisée au centre du cervelet. Injecter 4 μL d’une solution de rAAV contenant un total de 8 × 109 vg, diluée dans du PBS, à un débit de perfusion de 0,5 μL/min à l’aide d’un injecteur automatique. Utilisez les coordonnées suivantes, calculées à partir de bregma, pour effectuer une injection unique au centre du cervelet d’une souris C57BL/6 adulte : antéro-postérieure : -6,5 mm ; latéral : 0 mm ; ventrale : -2,9 mm.REMARQUE : Ces coordonnées peuvent varier en fonction de la souche de souris, du sexe et de l’âge des animaux utilisés. Pour minimiser le reflux et permettre la diffusion du vecteur viral, une fois la perfusion terminée, laissez l’aiguille de la seringue à ces coordonnées pendant 3 min, puis rétractez-la lentement de 0,3 mm et laissez-la rester en place pendant 2 minutes supplémentaires avant de le retirer complètement du cerveau de la souris. Fermez l’incision et nettoyez-la avec un agent désinfectant (par ex. 10 % de povidone iodée). Laissez les animaux se remettre de l’anesthésie avant de les ramener dans leurs cages d’origine. Prélèvement et préparation de tissusREMARQUE : Dans cette expérience, les niveaux de transduction ont été observés 12 semaines après l’injection, mais la même procédure a pu être évaluée dès 4 semaines après l’injection.Anesthésier les animaux en phase terminale par l’administration intrapéritonéale d’une surdose de xylazine/kétamine (8/160 mg/kg de poids corporel). Perfuser les animaux par voie transcardique avec du PBS glacé pendant 6 minutes à un débit de 2,5 mL/min, suivi de la perfusion avec une solution glacée de PFA à 4 % fraîchement préparée pendant 10 minutes au même rythme. Postfixez les cerveaux excisés dans 4% de PFA pendant la nuit à température ambiante, puis transférez-les dans une solution de saccharose/PBS à 25% pour la cryoprotection. Une fois que la cervelle coule (environ 48 h plus tard), stockez-la à -80 °C. Découpez en série des coupes sagittales d’une épaisseur de 30 μm à l’aide d’un cryostat à -21 °C. Pour chaque animal, prélever 96 sections sagittales d’un hémisphère cérébral dans des séries anatomiques sous forme de sections flottantes dans du PBS complété par 0,05% d’azoture de sodium. Conserver à 4 °C jusqu’à nouvel ordre. Immunohistochimie par fluorescence standardSélectionnez huit sections sagittales par animal, à une distance de 240 μm les unes des autres. Incuber les sections flottantes dans une solution de blocage/perméabilisation (0,1 % de Triton X-100 contenant 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS) pendant 1 h à température ambiante. Incuber les sections pendant la nuit à 4 °C avec l’anticorps primaire polyclonal anti-GFP de poulet (1:1 000). Laver 3 x 15 min dans du PBS et incuber les sections pendant 2 h à température ambiante avec l’anticorps secondaire de chèvre polyclonal anti-poulet conjugué au fluorophore Alexa Fluor 488 (1:200). Laver pendant 3 x 15 min dans PBS. Incuber avec du DAPI pendant 5 min à température ambiante. Laver pendant 3 x 15 min dans PBS. Placez les sections dans des lames recouvertes de gélatine et une lamelle avec un milieu de montage par fluorescence. Acquérez des images sur un microscope à fluorescence à balayage de lames équipé d’un objectif 20x/0,8.