Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico

NOTA: Vedere la Figura 1 per un’illustrazione che riassume il protocollo. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questo protocollo. Tutti i lavori che coinvolgono cellule e virus devono essere eseguiti in apposite cappe di biosicurezza e incubatori, separati da quelli regolarmente utilizzati per la manutenzione delle linee cellulari. Le apparecchiature e i reagenti che entrano in contatto con le cellule in coltura e i virus devono essere sterili. È essenziale che lo smaltimento dei reagenti pericolosi e dei materiali contaminati da virus sia eseguito in conformità con le schede di sicurezza dei materiali e in conformità con le leggi e le linee guida nazionali fornite dall’ufficio per la salute e la sicurezza ambientale di ciascuna istituzione. A partire da aprile 2019, le linee guida NIH per la ricerca che coinvolge molecole di acido nucleico ricombinanti o sintetiche classificano come agenti del gruppo di rischio 1 (non associati alla malattia negli esseri umani adulti sani) tutti i sierotipi di AAV, nonché i costrutti AAV ricombinanti o sintetici. Questa classificazione si applica quando il transgene non codifica per un prodotto genico potenzialmente tumorigenico o una tossina e i costrutti sono prodotti senza un virus helper. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità alla direttiva comunitaria dell’Unione Europea (2010/63/UE) per la cura e l’uso degli animali da laboratorio, recepita nella legge portoghese nel 2013 (D.Lgs. 113/2013). Inoltre, le procedure per animali sono state approvate dall’Organizzazione responsabile per il benessere degli animali della Facoltà di Medicina e dal Centro di Neuroscienze e Biologia Cellulare dell’Università di Coimbra con licenza per animali. I ricercatori hanno ricevuto una formazione adeguata (corso certificato FELASA) e una certificazione dalle autorità portoghesi (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lisbona, Portogallo) per eseguire gli esperimenti. 1. Costrutti plasmidici Seguire le istruzioni del produttore di un kit maxiprep privo di endotossine per isolare e purificare quantità sostanziali di DNA dei seguenti plasmidi: i) pITR: il vettore di trasferimento di interesse; ii) plasmide pAAV-RC: pRV1, contenente le sequenze AAV2 Rep e Cap 36; iii) plasmide pAAV-RC: pH21, contenente le sequenze AAV1 Rep e Cap 36; iv) plasmide pAAV-RC: pAAV2/9n, contenente le sequenze AAV2 Rep e AAV9 Cap ; v) pHelper: pFdelta6, plasmide36 adenovirus-helper. Esaminare l’integrità dei plasmidi generati eseguendo le restrizioni enzimatiche raccomandate36. Monitorare l’integrità dei plasmidi pITR mediante digestione con SmaI, un’endonucleasi di restrizione, che taglia due volte all’interno di una porzione instabile degli ITR53,54.NOTA: Poiché gli ITR sono altamente instabili e suscettibili di delezioni, si raccomanda l’uso di cellule supercompetenti SURE 2 per ridurre al minimo la ricombinazione in questi siti. 2. Coltura cellulare Coltura del rene embrionale umano 293, che esprime stabilmente la linea cellulare SV40 dell’antigene T grande (HEK293T) nell’alto glucosio Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10% di siero fetale bovino e l’1% di penicillina-streptomicina, a 37 °C, in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2, come punto di partenza per le fasi successive. Subcoltura delle cellule utilizzando 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sterile, pH 7,4, per lavare le cellule prima di aggiungere acido tripsina-etilendiamminotetraacetico allo 0,05% (EDTA).NOTA: Evitare di utilizzare cellule che hanno subito un numero eccessivo di passaggi (massimo 20). Testare regolarmente le colture cellulari per la contaminazione da micoplasma. 3. Produzione di rAAV per trasfezione transitoria Giorno 1: Placcatura cellularePer ogni produzione virale, le cellule HEK293T vengono distribuite in 10 piastre di coltura trattate (15 cm di diametro) il giorno prima della trasfezione, a una densità di 10,5 × 106 cellule per piastra in 22 mL di terreno di coltura integrato e incubano per 24 ore fino a quando le cellule sono confluenti al 70%-80% e pronte per la trasfezione. Giorno 2: Trasfezione cellulare mediante polietilenimmina (PEI)Per ogni produzione virale (equivalente a 10,5 piatti), preparare la seguente miscela di trasfezione in una provetta da microcentrifuga: 54,6 μg di pITR; 45,675 μg di pRV1; 45,675 μg di pH21 o pAAV2/9n; 109,2 μg di pFdelta6. Mescolare picchiettando. Aggiungere la miscela a 4,557 mL di DMEM non integrato in una provetta da centrifuga da 50 mL. Mescolare picchiettando. Aggiungere 1,365 mL di soluzione sterile di PEI a 1 mg/mL (pH 7,4), goccia a goccia. Mescolare picchiettando. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per consentire la formazione di complessi DNA-PEI. Aggiungere questa miscela a 231 ml di DMEM integrato preriscaldato. Sostituire l’intero terreno di coltura di ciascuna piastra con 22 mL di questa miscela di trasfezione. Incubare le cellule per 48 ore.NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito con cura per evitare il distacco delle cellule. Giorno 4: Raccolta delle celluleQuando il pITR codifica un reporter fluorescente, visualizzare le cellule trasfettate al microscopio a fluorescenza. Raccogliere il terreno da ogni piatto in provette da centrifuga da 50 ml e centrifugarle a 800 × g per 10 minuti. Scartare il surnatante.NOTA: Questo passaggio è facoltativo e mira a recuperare le cellule trasfettate che potrebbero essersi staccate a causa di una confluenza molto elevata. Aggiungere 10 ml di PBS preriscaldato a ciascuna piastra. Rimuovere delicatamente le cellule con un raschietto cellulare e raccogliere la sospensione nelle provette da centrifuga da 50 mL del passaggio 3.3.2. Lavare 5 piatti alla volta con altri 10 mL di PBS e trasferire la sospensione nelle provette da centrifuga da 50 mL del passaggio 3.3.3. Pellettare le cellule a 800 × g per 10 minuti e scartare il surnatante. Congelare i pellet cellulari a -80 °C.NOTA: I pellet cellulari possono essere conservati per diversi mesi (punto di pausa). 4. Estrazione rAAV e purificazione FPLC Giorno 5: preparazione del lisato cellulareScongelare i pellet cellulari a temperatura ambiente. Risospendere le cellule raccolte dalle 10 piastre in 100 mL di un tampone sterile contenente 150 mM di cloruro di sodio (NaCl) e 20 mM di Tris, pH 8,0, in acqua ultrapura (tipo I). Miscelare la sospensione pipettando su e giù, per garantire una sospensione omogenea. Aggiungere 12,5 ml di una soluzione sterile appena preparata di sodio desossicolato al 10% in acqua ultrapura per indurre la lisi cellulare. Mescolare pipettando su e giù.NOTA: Smaltire il desossicolato di sodio, nonché i materiali a contatto con esso, in conformità con la scheda di sicurezza dei materiali e le linee guida fornite dall’ufficio per la salute e la sicurezza ambientale dell’istituto. Si consiglia inoltre di indossare una maschera facciale durante la manipolazione di questa polvere. Dopo la miscelazione, la soluzione diventa altamente viscosa. Aggiungere 27 μl di nucleasi benzonasi alla miscela precedente. Miscelare accuratamente pipettando su e giù fino a quando il campione non è più viscoso. Incubare a 37 °C per 1 ora, eseguendo un vortice ogni 10 min.NOTA: Questa endonucleasi è in grado di degradare efficacemente tutte le forme di DNA e RNA senza mostrare alcuna attività proteolitica. Rimuovere i detriti cellulari centrifugando la miscela a 3.000 × g per 60 minuti a 25 °C. Filtrare il surnatante con un filtro per siringa sterile in polivinilidene difluoruro (PVDF) da 0,45 μm e trasferirlo in un nuovo contenitore sterile.NOTA: Questo importante passaggio garantisce che la maggior parte dei detriti cellulari venga rimossa, prevenendo così l’intasamento delle colonne cromatografiche. Conservare una piccola aliquota di questa miscela per l’analisi (passaggio facoltativo). Giorno 5 (continua): Purificazione della colonna di eparina dei rAAVNOTA: L’applicazione del campione può essere eseguita utilizzando una pompa del campione o un superloop da 50 mL o 150 mL come parte del sistema. Poiché a temperature più basse viene disciolta più aria, è importante lasciare un tempo sufficiente affinché i tamponi e le soluzioni (solitamente conservati a 4 °C) si acclimatino a temperatura ambiente prima del loro utilizzo nel sistema FPLC.Opzionale: se il sistema è stato immagazzinato per lunghi periodi, riempire il sistema e tutti gli ingressi con una soluzione di conservazione appena preparata (etanolo al 20%) utilizzando istruzioni manuali o un metodo predefinito di pulizia del sistema in loco (CIP del sistema). Lavare completamente il percorso del flusso del liquido con acqua ultrapura sterile utilizzando istruzioni manuali o un metodo CIP di sistema predefinito. Collegare una colonna di eparina preconfezionata da 1 mL, impostare l’allarme di pressione e lavare con cinque volumi di colonna (CV) di acqua ultrapura a una portata di 1 mL/min. Commutare le soluzioni nel vassoio tampone da acqua ultrapura a tampone A (soluzione sterile di 100 mM NaCl e 20 mM Tris, pH 8, in acqua ultrapura) per l’ingresso A (pompa del sistema A) e al tampone B (soluzione sterile di 500 mM di NaCl e 20 mM Tris, pH 8, in acqua ultrapura) per l’ingresso B (pompa del sistema B). Se il sistema dispone di una pompa di campionamento, posizionare l’ingresso del tampone della valvola di ingresso del campione nel tampone A. Lavare la pompa del sistema B con il tampone B e riempire il resto del percorso del flusso del liquido con il tampone A.NOTA: Se necessario, scollegare la colonna dal percorso di flusso e ricollegarla successivamente. Inserire un tubo di ingresso del campione dalla valvola di ingresso del campione, ad esempio S1, nel contenitore con la preparazione virale ottenuta al punto 4.1.4. (da preparazione di lisato cellulare). Adescare il percorso del flusso dall’ingresso del campione S1 alla valvola di iniezione con la soluzione del campione. In alternativa, riempire un superloop da 50 mL o 150 mL con il campione contenente rAAV utilizzando una siringa da 50 mL. Equilibrare la colonna con un volume totale di cinque CV utilizzando il 12,5% del tampone B a una velocità di 1 mL/min. Applicare il volume totale del campione nella colonna utilizzando la pompa del campione (selezionare iniettare tutto il campione utilizzando il sensore dell’aria) o il superloop a 0,5 mL/min e raccogliere il flusso utilizzando la porta di uscita in un nuovo contenitore sterile.NOTA: Quando la funzione di controllo del flusso per prevenire la sovrapressione è abilitata, il flusso diminuirà automaticamente in caso di intasamento della colonna. Se la portata scende significativamente al di sotto di 0,5 ml/min, interrompere l’applicazione del campione, eseguire un lavaggio con 2-5 CV del tampone A, quindi riprendere l’applicazione del campione. Lavare la colonna a 1 mL/min con 20 CV di tampone A, raccogliendo il flusso utilizzando la porta di uscita. Eluire il campione a 1 mL/min con il seguente schema: i) gradiente lineare con un target del 50% del tampone B per cinque CV; ii) passo con un obiettivo del 90% del buffer B durante cinque CV; iii) passo con un obiettivo del 100% del buffer B durante cinque CV. Raccogliere il campione eluito in frazioni da 1 mL utilizzando un collettore di frazioni e provette per microcentrifuga a bassa ritenzione (2 mL) e conservarle a -20 °C.NOTA: Le frazioni rAAV possono essere conservate per diverse settimane (punto di pausa). Riequilibrare la colonna a 1 mL/min con il 12,5% del tampone B per cinque CV. Passare gli ingressi dalle soluzioni tampone all’acqua ultrapura e lavare la colonna a 1 mL/min per cinque CV. Commutare gli ingressi da acqua ultrapura a etanolo al 20% e lavare la colonna a 1 mL/min per cinque CV. Scollegare la colonna e conservarla a 4 °C.NOTA: Le colonne possono essere riutilizzate più volte senza altre importanti procedure di pulizia e sanificazione se vengono utilizzati lo stesso sierotipo rAAV e lo stesso transgene. Lavare completamente il percorso del flusso del liquido con etanolo al 20% utilizzando istruzioni manuali o un metodo CIP di sistema predefinito. 5. Concentrazione di rAAV purificati Giorno 6: Fase di concentrazione 1Concentrare gli rAAV utilizzando un’unità filtrante centrifuga da 15 mL con un cutoff del peso molecolare di 100 kDa. Caricare le frazioni desiderate contenenti rAAV (frazioni FPLC da 7 a 16) nell’unità filtro centrifugo da 15 mL e centrifugarla a 2.000 × g per 2 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che il volume concentrato nell’unità filtro sia di circa 500 μl. Se il volume concentrato supera ampiamente i 500 μl, ripetere le fasi di centrifugazione a intervalli di 1 minuto fino a raggiungere il volume desiderato. Giorno 6 (continua): Scambio di bufferAggiungere 1 mL di PBS sterile all’unità filtro centrifugo contenente gli rAAV. Pipettare con cura su e giù per lavare il filtro. Centrifugare a 2.000 × g a intervalli di 1 minuto fino a raggiungere il volume finale di 500 μl. Giorno 6 (continua): Fase di concentrazione 2Trasferire i 500 μL di rAAV concentrati ottenuti nella fase precedente in un’unità filtrante centrifuga da 0,5 mL con un cutoff di peso molecolare di 100 kDa e centrifugare a 6.000 × g per 1 min. Se necessario, ripetere la fase di centrifugazione fino a raggiungere un volume finale inferiore a 100 μl. Giorno 6 (continua): RecuperoPer recuperare l’rAAV concentrato, posizionare il dispositivo filtrante capovolto in una nuova provetta di raccolta per microcentrifuga. Posizionare la provetta in una microcentrifuga con il tappo rivolto verso il centro ed eseguire una rotazione prolungata all’interno della camera di flusso per trasferire i rAAV concentrati dal dispositivo alla provetta della microcentrifuga. In alternativa, centrifugare a 1.000 × g per 2 min. Integrare con Pluronic F-68 sterile 0,001% (opzionale).NOTA: Pluronic F-68 è un tensioattivo non ionico approvato per uso umano dalla Food and Drug Administration che è in grado di mitigare le perdite di rAAV prevenendo le loro interazioni con le superfici dei materiali (plastica) utilizzati durante la preparazione della diluizione, il caricamento della siringa e l’attrezzatura di somministrazione55,56. Aliquotare gli rAAV in provette per microcentrifuga a bassa ritenzione e conservarli a -80 °C (punto di pausa). 6. Quantificazione di rAAV purificati Giorno 6 (continua): determinare il titolo dei preparati di rAAV, espressi in genomi virali/μL (vg/μL), mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale (RT-qPCR) utilizzando un kit commerciale e seguendo le istruzioni del produttore.Incubare la soluzione di particelle di rAAV con DNasi I a 37 °C per 20 minuti.NOTA: Questa procedura promuove la digestione del DNA genomico libero e del DNA plasmidico derivato dalle cellule ospiti, garantendo così che venga preservata solo la sequenza di acido nucleico all’interno delle particelle di rAAV intatte. Inattivare a caldo la DNasi I a 95 °C per 10 min. Aggiungere il tampone di lisi e incubare per 10 minuti a 70 °C per favorire la denaturazione termica delle proteine delle particelle rAAV. Diluire la soluzione del genoma rAAV ottenuta in tampone di diluizione prima di procedere alla RT-qPCR. Preparare una serie di standard diluiti in serie del controllo positivo (da 2 × 107 vg/μL a 2 × 102 vg/μL) forniti con il kit. Eseguire una miscela di reazione contenente 12,5 μl di miscela Taq II, 0,5 μl di miscela di primer diluita, 7 μl di acqua e 5 μl di DNA rAAV diluito (campione AAV sconosciuto e standard del passaggio 6.1.4.). Eseguire la RT-qPCR in un sistema di rilevamento PCR in tempo reale, utilizzando il seguente protocollo: 1 ciclo a 95 °C per 2 min (denaturazione iniziale) e 40 cicli a 95 °C per 5 s (denaturazione) e 60 °C per 30 s (ricottura, estensione e lettura della piastra), seguiti da un’analisi della curva di fusione. Calcolare la concentrazione assoluta del campione dalla curva standard (linea di regressione lineare), considerando il fattore di diluizione risultante dalla preparazione del campione rAAV.NOTA: La quantificazione del numero di genomi virali si ottiene attraverso l’amplificazione della sequenza ITR di AAV2 (sequenza target dei primer forniti dal kit). 7. SDS-PAGE, colorazione blu di Coomassie e western blot Denaturare 40 μl di ciascun campione (ogni frazione FPLC, il flusso continuo, i campioni precolonna e un totale di 2,3 × 1010 vg del prodotto concentrato finale) aggiungendo 6 tamponi campione (0,5 M Tris-HCl/0,4% di sodio dodecil solfato (SDS) pH 6,8, 30% di glicerolo, 10% di SDS, 0,6 M di ditiotreitolo (DTT), 0,012% di blu di bromofenolo) e incubando i campioni per 5 minuti a 95 °C. Caricare i campioni denaturati (48 μL) in un gel di poliacrilammide SDS (4% di impilamento e 10% di gel risolutivo) ed eseguire la separazione elettroforetica a 100 V per 70 minuti, adiacente a una scala proteica. Analisi delle proteineNOTA: È possibile eseguire la colorazione blu di Coomassie o il western blotting.Colorazione blu CoomassiePer visualizzare le bande proteiche, colorare il gel per 10 minuti con una soluzione di blu Coomassie G250 allo 0,25% disciolta in metanolo al 50% e acido acetico glaciale al 10%. Eseguire la decolorazione in gel lavandolo più volte con una soluzione contenente il 25% di metanolo e il 5% di acido acetico glaciale fino a quando non diventano visibili bande chiare con fondo basso. Acquisire immagini utilizzando un sistema di imaging appropriato. Western blotTrasferire le proteine su una membrana in PVDF secondo protocolli standard. Bloccare la membrana mediante incubazione in latte scremato al 5% diluito in TBS-T (0,1% Tween 20 in soluzione salina tamponata con Tris) per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzare i seguenti anticorpi primari (diluiti in soluzione bloccante) per l’incubazione notturna a 4 °C: anticorpi monoclonali di topo anti-AAV, anticorpi VP1, VP2, VP3 (B1, 1:1.000) o anticorpi monoclonali di topo anti-AAV, VP1, VP2 (A69, 1:1.000). Lavare le membrane per 3 x 15 minuti in TBS-T e incubare con un anticorpo secondario di capra anti-topo legato alla fosfatasi alcalina (1:10.000), per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare le membrane per 3 x 15 minuti in TBS-T. Aggiungi un substrato chemifluorescente potenziato (ECF) e visualizza le bande proteiche mediante imaging a chemifluorescenza. 8. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) Posizionare una griglia da 200 mesh rivestita in carbonio Formvar capovolta sopra una goccia di un campione rAAV e lasciarla riposare per 1 minuto. Lavare le griglie in una goccia d’acqua e asciugare il liquido in eccesso con carta da filtro. Colorare negativamente le griglie con una soluzione di acetato di uranile all’1% (pH 7) per 1 minuto per fissare e contrastare le particelle virali. Lavare le griglie in una goccia d’acqua e asciugare il liquido in eccesso con carta da filtro. Esaminare i campioni in un microscopio elettronico a trasmissione.NOTA: Alte concentrazioni di sale possono avere un impatto diretto sul legame degli rAAV alla griglia e portare alla visualizzazione di strutture cristalline. 9. Analisi consecutiva dell’assorbimento della luce ultravioletto-visibile, della diffusione statica della luce e della diffusione dinamica della luce Su una piastra di quantificazione a 96 pozzetti, caricare 2 μL di un campione rAAV e 2 μL di PBS da utilizzare come bianco tampone (eseguire questa operazione in duplicati). Utilizzare l’applicazione AAV Quant nel software di analisi del cliente, posizionare i nomi dei campioni nella posizione corretta della piastra, selezionare il sierotipo AAV e fare clic su Avanti. Caricare la piastra di quantificazione a 96 pozzetti nell’apparecchiatura dedicata e procedere con la lettura della piastra per l’acquisizione dei dati. 10. Saggi di trasduzione in vitro Diverse linee cellulari possono essere utilizzate per analizzare rapidamente l’efficienza di trasduzione degli rAAV.Seminare uniformemente HEK293T cellule in piastre a 24 pozzetti (a una densità di 137.500 cellule/pozzetto) e una linea cellulare di neuroblastoma-2A (Neuro2a) di topo in piastre a 24 pozzetti (50.000 cellule/pozzetto) o in un vetrino a 8 pozzetti (27.000 cellule/pozzetto), utilizzando DMEM ad alto glucosio, integrato con il 10% di siero fetale bovino e l’1% di penicillina-streptomicina, come descritto sopra. Lasciare aderire le celle per una notte a 37 °C in un’atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2. Raccogliere il terreno condizionato da ciascun pozzetto (250 μl da piastre a 24 pozzetti e 50 μl dal vetrino della camera a 8 pozzetti) e conservarlo a 4 °C per un uso successivo. Aggiungere i seguenti preparati rAAV a ciascun pozzetto e incubare le cellule per 24 ore a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5%.Aggiungere 50 μl delle frazioni F2-F16 raccolte da FPLC e fluire in HEK293T le cellule piastrate in piastre a 24 pozzetti. Aggiungere un totale di 5,5 × 109 vg di rAAV concentrati diluiti in 50 μL di PBS alle cellule Neuro2a piastrate in piastre a 24 pozzetti (includere un pozzetto di controllo negativo, aggiungendo 50 μL di PBS alle cellule). Aggiungere un totale di 2,75 × 109 vg di rAAV concentrati diluiti in 25 μL di PBS alle cellule Neuro2a piastrate in un vetrino a 8 pozzetti (includere la condizione di controllo negativo, aggiungendo 50 μL di PBS alle cellule). Aggiungere il terreno condizionato precedentemente conservato (fase 10.1.2) in ciascun pozzetto e incubare per 24 ore. Scartare il terreno e lavare le celle 2 volte con PBS. Aggiungere una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4%, integrata con saccarosio al 4% in PBS, preriscaldata a 37 °C, in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Lavare 2 volte con PBS e conservare a 4 °C fino all’esecuzione dell’imaging (punto di pausa). Acquisizione di immagini su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un obiettivo 10x/0,30 o su un microscopio confocale invertito dotato di un obiettivo DIC a olio 40x/1,4. Per avere un modello più rilevante e riflessivo dell’ambiente in vivo , utilizzare colture neuronali primarie come segue:Preparare colture primarie di neuroni corticali come precedentemente descritto da Santos et al.57. In breve, seminare 200.000 cellule/mL in piastre a 12 pozzetti e mantenerle in coltura fino al giorno in vitro 16. Raccogliere il terreno condizionato da ciascun pozzetto (100 μL) e conservarlo a 4 °C per un uso successivo. Aggiungere i rAAV da testare a ciascun pozzetto: un totale di 2,75 × 109 vg di rAAV concentrati diluiti in 25 μL di PBS (includere il controllo negativo: 25 μL di PBS). Incubare per 24 ore a 37 °C in atmosfera di CO2 al 5%. Aggiungere il terreno condizionato precedentemente conservato e incubare per 24 ore. Scartare il terreno in ogni pozzetto e lavare 2 volte con PBS. Fissare le celle con il 4% di PFA/4% di saccarosio nel PBS, come descritto al punto 10.1.6. Lavare 2 volte con PBS. Incubare ogni pozzetto con 5 μg/mL di agglutinina di germe di grano (WGA) coniugata con Alexa Fluor 633 per 10 minuti a temperatura ambiente (passaggio opzionale: eseguire invece l’immunocitochimica). Lavare 2 volte con PBS. Incubare in Triton X-100 allo 0,25% in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare con PBS. Incubare con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare 2 volte con PBS. Acquisisci immagini su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un obiettivo 40x/0,95 o su un microscopio confocale invertito dotato di un obiettivo 40x/1,4 Oil DIC. 11. Esperimenti in vivo NOTA: Gli animali sono stati alloggiati in una stanza a temperatura controllata, mantenuta su un ciclo luce/buio di 12 ore. Cibo e acqua sono stati forniti ad libitum. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza degli animali. Iniezione stereotassica nel cervellettoAnestetizzare animali C57BL/6 di 9 settimane mediante inalazione di isoflurano al 2% in presenza di ossigeno (0,8 L/min) in una camera collegata a un vaporizzatore. Posizionare l’animale anestetizzato nell’apparato stereotassico (su un tampone riscaldato a 35 °C) e posizionare la maschera di isoflurano nel naso dell’animale. Abbassa il livello di isoflurano all’1,3-1,7%.NOTA: Assicurarsi che l’animale sia correttamente anestetizzato prima di procedere (perdita del riflesso per flessione in entrambi gli arti posteriori). Applicare un unguento lubrificante per gli occhi per evitare l’essiccazione delle cornee e iniettare all’animale un analgesico approvato.NOTA: Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti in condizioni sterili. Dopo aver rasato il pelo della testa dell’animale e disinfettato l’area chirurgica, esporre il cranio e posizionare la punta di un ago per iniezione a punta smussata da 30 G, collegato a una siringa Hamilton da 10 μL, direttamente sopra il bregma (utilizzare il bregma come zero per il calcolo delle coordinate stereotassiche). Sposta l’ago nella coordinata prevista e pratica un foro attraverso il cranio dove entrerà l’ago.NOTA: Nell’ambito di questo studio, una singola iniezione è stata eseguita centralmente nel cervelletto. Iniettare 4 μL di una soluzione di rAAV contenente un totale di 8 × 109 vg, diluita in PBS, ad una velocità di infusione di 0,5 μL/min utilizzando un iniettore automatico. Utilizzare le seguenti coordinate, calcolate da bregma, per eseguire una singola iniezione centralmente nel cervelletto di un topo adulto C57BL/6: antero-posteriore: -6,5 mm; laterale: 0 mm; ventrale: -2,9 mm.NOTA: Queste coordinate possono variare in base al ceppo del topo, al sesso e all’età degli animali in uso. Per ridurre al minimo il riflusso e consentire la diffusione del vettore virale, una volta completata l’infusione, lasciare l’ago della siringa a queste coordinate per 3 minuti, quindi ritrarlo lentamente di 0,3 mm e lasciarlo rimanere in posizione per altri 2 minuti prima della sua completa rimozione dal cervello del topo. Chiudere l’incisione e pulirla con un agente disinfettante (ad es. 10% di iodio povidone). Consenti agli animali di riprendersi dall’anestesia prima di riportarli nelle gabbie di casa. Raccolta e preparazione dei tessutiNOTA: In questo esperimento, i livelli di trasduzione sono stati osservati 12 settimane dopo l’iniezione, ma la stessa procedura potrebbe essere valutata già 4 settimane dopo l’iniezione.Anestetizzare terminalmente gli animali mediante somministrazione intraperitoneale di un sovradosaggio di xilazina/ketamina (8/160 mg/kg di peso corporeo). Perfondere transcardicamente gli animali con PBS ghiacciato per 6 minuti a una velocità di 2,5 ml/min, seguito dalla perfusione con una soluzione di PFA al 4% ghiacciata appena preparata per 10 minuti alla stessa velocità. Postfissare i cervelli asportati in PFA al 4% per una notte a temperatura ambiente e poi trasferirli in una soluzione di saccarosio/PBS al 25% per la crioprotezione. Una volta che il cervello affonda (circa 48 ore dopo), conservalo a -80 °C. Tagliare sezioni sagittali seriali con uno spessore di 30 μm utilizzando un criostato a -21 °C. Per ogni animale, raccogliere 96 sezioni sagittali di un emisfero cerebrale in serie anatomiche come sezioni flottanti in PBS integrate con azoturo di sodio allo 0,05%. Conservare a 4 °C fino a nuova lavorazione. Immunoistochimica a fluorescenza standardSelezionare otto sezioni sagittali per animale, a una distanza di 240 μm l’una dall’altra. Incubare le sezioni flottanti in una soluzione bloccante/permeabilizzante (0,1% Triton X-100 contenente il 10% di siero normale di capra (NGS) in PBS) per 1 ora a temperatura ambiente. Incubare le sezioni per una notte a 4 °C con anticorpo primario policlonale anti-GFP di pollo (1:1.000). Lavare per 3 x 15 minuti in PBS e incubare le sezioni per 2 ore a temperatura ambiente con l’anticorpo policlonale secondario capra anticorpo anti-pollo coniugato al fluoroforo Alexa Fluor 488 (1:200). Lavare per 3 x 15 min in PBS. Incubare con DAPI per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare per 3 x 15 min in PBS. Posizionare le sezioni in vetrini rivestiti di gelatina e vetrino coprioggetti con mezzo di montaggio a fluorescenza. Acquisizione di immagini su un microscopio a fluorescenza con scanner per vetrini dotato di obiettivo 20x/0,8.