Выделение аденоассоциированных вирусных векторов с помощью одноэтапного и полуавтоматического протокола гепариновой аффинной хроматографии

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 приведена иллюстрация, обобщающая протокол. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в этом протоколе. Все работы, связанные с клетками и вирусами, должны выполняться в специальных шкафах и инкубаторах биобезопасности, отделенных от тех, которые регулярно используются для обслуживания клеточных линий. Оборудование и реагенты, вступающие в контакт с культивируемыми клетками и вирусами, должны быть стерильными. Важно, чтобы удаление опасных реагентов и материалов, зараженных вирусами, осуществлялось в соответствии с паспортами безопасности материалов и в соответствии с национальными законами и руководящими принципами, разработанными отделом по охране окружающей среды и безопасности каждого учреждения. По состоянию на апрель 2019 года в рекомендациях NIH по исследованиям с использованием рекомбинантных или синтетических молекул нуклеиновых кислот все серотипы AAV (не связанные с заболеванием у здоровых взрослых людей) классифицируются как агенты группы риска 1 (не связанные с заболеванием у здоровых взрослых людей), а также рекомбинантные или синтетические конструкции AAV. Эта классификация применяется, когда трансген не кодирует потенциально опухолевый генный продукт или токсин, и конструкции производятся без вируса-помощника. Все эксперименты с участием животных проводились в соответствии с директивой Сообщества Европейского союза (2010/63/EU) об уходе за лабораторными животными и их использовании, перенесенной в португальское законодательство в 2013 году (Законодательный декрет 113/2013). Кроме того, процедуры с животными были одобрены Ответственной организацией по благополучию животных медицинского факультета и Центром неврологии и клеточной биологии лицензированного ветеринарного учреждения Университета Коимбры. Исследователи прошли соответствующую подготовку (курс, сертифицированный FELASA) и сертификацию от португальских властей (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Лиссабон, Португалия) для проведения экспериментов. 1. Плазмидные конструкции Следуйте инструкциям производителя набора без эндотоксинов maxiprep для выделения и очистки значительного количества ДНК следующих плазмид: i) pITR: вектор переноса, представляющий интерес; ii) плазмида pAAV-RC: pRV1, содержащая последовательности AAV2 Rep и Cap 36; iii) плазмида pAAV-RC: pH21, содержащая последовательности AAV1 Rep и Cap 36; iv) плазмида pAAV-RC: pAAV2/9n, содержащая последовательности AAV2 Rep и AAV9 Cap ; v) pHelper: pFdelta6, аденовирус-хелперплазмида 36. Скрининг целостности сгенерированных плазмид путем выполнения рекомендуемых ферментативных ограничений36. Мониторинг целостности плазмид pITR путем расщепления с помощью SmaI, эндонуклеазы рестрикции, которая разрезает вдвое нестабильную часть ITR53,54.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ITR очень нестабильны и чувствительны к делециям, рекомендуется использовать сверхкомпетентные ячейки SURE 2 для минимизации рекомбинации в этих сайтах. 2. Клеточная культура Культивировали эмбриональную почку 293 человека, стабильно экспрессирующую клеточную линию большого Т-антигена (HEK293T) SV40 в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицином, при 37 °C, во влажной атмосфере, содержащей 5%CO2, в качестве отправной точки для последующих этапов. Субкультивируйте клетки с использованием стерильного 1x фосфатно-солевого буфера (PBS), pH 7,4, чтобы промыть клетки перед добавлением 0,05% трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования клеток, которые прошли чрезмерное количество проходов (максимум 20). Регулярно проверяйте клеточные культуры на контаминацию микоплазмой. 3. Получение rAAV транзиентной трансфекцией День 1: Покрытие ячеекДля каждой вирусной продукции планшет HEK293T клетки в 10 обработанных культуральных чашек (диаметром 15 см) за день до трансфекции с плотностью 10,5 ×10 6 клеток на чашку в 22 мл питательной среды с добавкой и инкубируют в течение 24 ч до тех пор, пока клетки не слится на 70%-80% и не будут готовы к трансфекции. День 2: Трансфекция клеток с использованием полиэтиленимина (ПЭИ)Для каждого вирусного производства (эквивалентно 10,5 чашкам) поместите следующую трансфекционную смесь в микроцентрифужную пробирку: 54,6 мкг pITR; 45,675 мкг pRV1; 45,675 мкг pH21 или pAAV2/9n; 109,2 мкг pFdelta6. Перемешайте постукиванием. Добавьте смесь в 4,557 мл DMEM без добавок в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Перемешайте постукиванием. Добавляйте 1,365 мл стерильного раствора PEI в концентрации 1 мг/мл (pH 7,4), капля за каплей. Перемешайте постукиванием. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить образование комплексов ДНК-ПЭИ. Добавьте эту смесь к 231 мл предварительно подогретого дополненного DMEM. Замените всю питательную среду каждой чашки 22 мл этой смеси для трансфекции. Инкубируйте клетки в течение 48 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходимо выполнять с осторожностью, чтобы избежать отслоения клеток. День 4: Сбор клетокКогда pITR кодирует флуоресцентный репортер, визуализируйте трансфицированные клетки под флуоресцентным микроскопом. Соберите среду из каждой чашки в центрифужные пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте их при 800 × г в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным и направлен на восстановление трансфицированных клеток, которые могли отделиться из-за очень высокой конфлюенции. Добавьте по 10 мл предварительно подогретого PBS на каждую тарелку. Аккуратно удалите клетки скребком для клеток и соберите суспензию в центрифужные пробирки объемом 50 мл на шаге 3.3.2. Вымойте 5 посуды за раз с добавлением дополнительных 10 мл PBS и перелейте суспензию в центрифужные пробирки объемом 50 мл с шага 3.3.3. Гранулируйте клетки по 800 × г в течение 10 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Заморозьте гранулы ячейки при -80 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные гранулы могут храниться в течение нескольких месяцев (точка паузы). 4. Экстракция rAAV и очистка FPLC День 5: Подготовка клеточного лизатаРазморозьте гранулы клеток при комнатной температуре. Ресуспендируйте клетки, собранные из 10 чашек, в 100 мл стерильного буфера, содержащего 150 мМ хлорида натрия (NaCl) и 20 мМ Tris, pH 8,0, в сверхчистой воде (тип I). Перемешайте суспензию, пипетируя вверх и вниз, чтобы обеспечить однородную суспензию. Добавьте 12,5 мл свежеприготовленного стерильного раствора 10% дезоксихолата натрия в сверхчистую воду, чтобы вызвать лизис клеток. Перемешайте, пипетируя вверх и вниз.ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизируйте дезоксихолат натрия, а также материалы, контактирующие с ним, в соответствии с паспортом безопасности материала и инструкциями, предоставленными отделом гигиены и безопасности окружающей среды учреждения. Также рекомендуется носить маску для лица во время работы с этим порошком. После смешивания раствор становится высоковязким. Добавьте 27 мкл бензоназной нуклеазы к предыдущей смеси. Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз, пока образец не перестанет быть вязким. Инкубировать при 37 °C в течение 1 ч, выполняя вихрь каждые 10 мин.Эта эндонуклеаза способна эффективно разрушать все формы ДНК и РНК, не проявляя никакой протеолитической активности. Удалите клеточный мусор, центрифугируя смесь при 3 000 × г в течение 60 мин при 25 °C. Отфильтруйте надосадочную жидкость стерильным шприцевым фильтром из поливинилидендифторида (PVDF) 0,45 мкм и переложите его в новый стерильный контейнер.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот важный шаг обеспечивает удаление большей части клеточного мусора, тем самым предотвращая засорение хроматографических колонок. Сохраните небольшую аликвоту этой смеси для анализа (необязательный шаг). День 5 (продолжение): Гепариновая колонная очистка rAAVПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение образца может быть выполнено с помощью насоса для отбора проб или суперпетли объемом 50 мл или 150 мл в составе системы. Поскольку при более низких температурах растворяется больше воздуха, важно дать буферам и растворам (обычно хранящимся при 4 °C) достаточно времени для акклиматизации до комнатной температуры перед их использованием в системе FPLC.Опция: Если система хранилась в течение длительного времени, заполните систему и все приточные отверстия свежеприготовленным раствором для хранения (20% этанол), используя инструкции по эксплуатации или заранее заданный метод безразборной мойки системы (система CIP). Полностью промойте канал потока жидкости стерильной сверхчистой водой, следуя инструкциям по эксплуатации или заранее определенному системному методу безразборной мойки. Подключите предварительно упакованную гепариновую колонку объемом 1 мл, установите сигнализацию давления и промойте пять колонок сверхчистой водой со скоростью потока 1 мл/мин. Переключите растворы в буферном лотке со сверхчистой воды на буфер A (стерильный раствор 100 мМ NaCl и 20 мМ Tris, pH 8, в сверхчистой воде) на входе A (системный насос A) и на буфер B (стерильный раствор 500 мМ NaCl и 20 мМ Tris, pH 8, в сверхчистой воде) на входе B (системный насос B). Если в системе есть насос для отбора проб, поместите входное отверстие буфера впускного клапана в буфер A. Промойте системный насос B буфером B и заполните оставшуюся часть потока жидкости буфером A.ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отсоедините колонну от проточной части, а затем снова подсоедините ее. Вставьте трубку для впуска пробы, например, S1, в контейнер с вирусным препаратом, полученным на шаге 4.1.4. (из препарата клеточного лизата). Подготовьте раствор образца на пути потока от входного отверстия для образца S1 до клапана впрыска. В качестве альтернативы можно заполнить суперпетлю объемом 50 мл или 150 мл образцом, содержащим rAAV, с помощью шприца объемом 50 мл. Уравновесить колонку общим объемом пять CV, используя 12,5% буфера B со скоростью 1 мл/мин. Нанесите общий объем пробы в колонку с помощью насоса для отбора проб (выберите ввод всей пробы с помощью воздушного датчика) или суперпетли со скоростью 0,5 мл/мин и соберите проточный поток с помощью выпускного отверстия в новом стерильном контейнере.ПРИМЕЧАНИЕ: Если включена функция управления потоком для предотвращения избыточного давления , поток будет автоматически уменьшаться в случае засорения колонны. Если расход значительно падает ниже 0,5 мл/мин, прекратите нанесение образца, выполните промывку с 2-5 CV буфера А, а затем возобновите нанесение образца. Промыть колонку со скоростью 1 мл/мин 20 CV буфера А, собирая проточный поток с помощью выпускного отверстия. Элюирование образца со скоростью 1 мл/мин по следующей схеме: i) линейный градиент с целевым показателем 50% буфера B для пяти CV; ii) шаг с целевым показателем 90% буфера B в течение пяти CV; iii) шаг с целевым значением 100% буфера B в течение пяти CV. Соберите элюированный образец на фракции объемом 1 мл с помощью сборника фракций и микроцентрифужных пробирок с низким удержанием (2 мл) и храните их при температуре -20 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Фракции rAAV могут храниться в течение нескольких недель (точка паузы). Восстановите равновесие в колонке со скоростью 1 мл/мин с 12,5% буфера B для пяти CV. Переключите входные отверстия с буферных растворов на сверхчистую воду и промойте колонку со скоростью 1 мл/мин в течение пяти CV. Переключите входные отверстия со сверхчистой воды на 20% этанол и промойте колонку со скоростью 1 мл/мин в течение пяти CV. Отсоедините колонку и храните ее при температуре 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Колонки можно использовать несколько раз без каких-либо других серьезных процедур очистки и дезинфекции, если используется один и тот же серотип rAAV и трансген. Полностью промойте путь потока жидкости 20% этанолом, используя инструкции по эксплуатации или предварительно заданный метод безразборной мойки. 5. Концентрация очищенных rAAV День 6: Концентрация, шаг 1Концентрируйте rAAV с помощью центробежной фильтрующей установки объемом 15 мл с молекулярной массой 100 кДа. Загрузите желаемые фракции, содержащие rAAV (фракции FPLC от 7 до 16), в центробежный фильтр объемом 15 мл и центрифугируйте его при 2 000 × г в течение 2 мин при комнатной температуре. Убедитесь, что концентрированный объем в фильтрующем блоке составляет около 500 μл. Если концентрированный объем значительно превышает 500 мкл, повторяйте этапы центрифугирования с интервалом в 1 мин до достижения желаемого объема. День 6 (продолжение): Обмен буферамиДобавьте 1 мл стерильного PBS в блок центробежного фильтра, содержащий rAAV. Осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы промыть фильтр. Центрифугируйте при 2 000 × г с интервалом в 1 мин до достижения конечного объема 500 мкл. День 6 (продолжение): Этап концентрации 2Перенесите 500 мкл концентрированных rAAV, полученных на предыдущем этапе, в центробежную фильтрующую установку объемом 0,5 мл с отсечкой молекулярной массы 100 кДа и центрифугируйте при 6000 × г в течение 1 мин. При необходимости повторяют стадию центрифугирования до тех пор, пока не будет достигнут конечный объем менее 100 мкл. День 6 (продолжение): ВосстановлениеЧтобы извлечь концентрированный rAAV, поместите фильтрующее устройство вверх дном в новую сборную трубку микроцентрифуги. Поместите пробирку в микроцентрифугу крышкой к центру и выполните длительное вращение внутри проточной камеры, чтобы перенести концентрированные rAAV из устройства в микроцентрифужную пробирку. В качестве альтернативы центрифугируйте при 1 000 × г в течение 2 мин. Добавка со стерильным Pluronic F-68 0,001% (по желанию).ПРИМЕЧАНИЕ: Плюроновый F-68 является неионогенным поверхностно-активным веществом, одобренным для использования человеком Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), которое способно смягчать потери rAAV, предотвращая их взаимодействие с поверхностями материалов (пластмасс), используемых во время приготовления разбавления, загрузки шприцев и оборудования для доставки55,56. Аликвоты rAAV помещают в микроцентрифужные пробирки с низким удержанием и хранят при -80 °C (точка паузы). 6. Количественная оценка очищенных rAAV День 6 (продолжение): Определить титр препаратов rAAV, экспрессируемых в вирусных геномах/мкл (vg/μL), методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-кПЦР) с использованием коммерческого набора и в соответствии с инструкциями производителя.Инкубировать раствор частиц rAAV с ДНКазой I при 37 °C в течение 20 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура способствует перевариванию свободной геномной ДНК и плазмидной ДНК, полученной из клеток-хозяев, тем самым гарантируя, что сохраняется только последовательность нуклеиновой кислоты внутри неповрежденных частиц rAAV. Нагревать ДНКазу I при 95 °C в течение 10 мин. Добавьте буфер для лизиса и инкубируйте в течение 10 минут при 70 °C, чтобы стимулировать тепловую денатурацию белков частиц rAAV. Полученный раствор генома rAAV развести в разбавляющем буфере перед переходом к ОТ-кПЦР. Подготовить набор серийно разбавленных стандартов положительного контроля (от 2 × 107 вг/мкл до 2 × 102 вг/мкл), прилагаемых к набору. Проводят реакционную смесь, содержащую 12,5 мкл смеси Taq II, 0,5 мкл разбавленной смеси праймеров, 7 мкл воды и 5 мкл разбавленной ДНК rAAV (неизвестный образец AAV и стандарты, описанные на шаге 6.1.4). Выполните ОТ-кПЦР в системе обнаружения ПЦР в режиме реального времени по следующему протоколу: 1 цикл при 95 °C в течение 2 мин (начальная денатурация) и 40 циклов при 95 °C в течение 5 с (денатурация) и 60 °C в течение 30 с (отжиг, растяжение и чтение планшета) с последующим анализом кривой расплава. Рассчитайте абсолютную концентрацию образца по стандартной кривой (линии линейной регрессии) с учетом коэффициента разбавления, полученного в результате подготовки образца rAAV.ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка количества вирусных геномов достигается путем амплификации последовательности ITR AAV2 (последовательность-мишень праймеров, поставляемых набором). 7. SDS-PAGE, синее окрашивание Кумасси и западная блота Денатурируйте 40 мкл каждого образца (каждая фракция FPLC; протекающая часть; образцы предварительной колонки и в общей сложности 2,3 × 1010 vg конечного концентрированного продукта) путем добавления 6x буфера для образцов (0,5 М Tris-HCl/0,4% додецилсульфата натрия (SDS) pH 6,8, 30% глицерина, 10% SDS, 0,6 М дитиотреитола (DTT), 0,012% бромфенолового синего) и инкубации образцов в течение 5 мин при 95 °C. Загрузите денатурированные образцы (48 мкл) в SDS-полиакриламидный гель (4% укладки и 10% растворяющий гель) и выполните электрофоретическое разделение при 100 В в течение 70 мин рядом с белковой лестницей. Анализ белкаПРИМЕЧАНИЕ: Может быть выполнено окрашивание синим цветом Кумасси или вестерн-блоттинг.Окрашивание в синий цвет КумассиДля визуализации белковых полос окрашивайте гель в течение 10 мин 0,25% раствором Coomassie blue G250, растворенным в 50% метанола и 10% уксусной кислоты ледниковой. Гель обезжирить, промыв его несколько раз раствором, содержащим 25% метанола и 5% уксусной кислоты ледниковой, до тех пор, пока не станут видны прозрачные полосы с низким фоном. Делайте снимки с помощью соответствующей системы обработки изображений. Вестерн-блотПеренесите белки на мембрану PVDF в соответствии со стандартными протоколами. Заблокируйте мембрану путем инкубации в 5% обезжиренном молоке, разведенном в TBS-T (0,1% Tween 20 в трис-буферном физрастворе) в течение 1 ч при комнатной температуре. Для ночной инкубации при 4 °C используют следующие первичные антитела (разведенные в блокирующем растворе): мышиные моноклональные антитела против AAV, VP1, VP2, VP3 (B1, 1:1000) или мышиные моноклональные антитела против AAV, VP1, VP2 (A69, 1:1000). Промывайте мембраны в течение 3 x 15 минут в TBS-T и инкубируйте с щелочным фосфатазой козьим вторичным антителом против мышей (1:10 000) в течение 2 часов при комнатной температуре. Промывайте мембраны в течение 3 x 15 минут в TBS-T. Добавьте улучшенную хемифлуоресцентную подложку (ECF) и визуализируйте белковые полосы с помощью хемифлуоресцентной визуализации. 8. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) Поместите сетку 200 меш с углеродным покрытием Formvar вверх дном поверх капли образца rAAV и дайте ей осесть в течение 1 минуты. Вымойте решетки в капле воды и высушите излишки жидкости фильтровальной бумагой. Отрицательно окрашивайте сетки 1% раствором уранилацетата (pH 7) в течение 1 минуты, чтобы зафиксировать и контрастировать вирусные частицы. Вымойте решетки в капле воды и высушите излишки жидкости фильтровальной бумагой. Исследуйте образцы в просвечивающем электронном микроскопе.ПРИМЕЧАНИЕ: Высокие концентрации солей могут напрямую влиять на связывание rAAV с сеткой и приводить к визуализации кристаллоподобных структур. 9. Последовательное поглощение ультрафиолетового видимого света, статическое рассеяние света и динамический анализ рассеяния света На 96-луночный планшет для количественного определения загрузите 2 мкл образца rAAV и 2 мкл PBS для использования в качестве заглушки буфера (выполняйте это в двух экземплярах). Используйте приложение AAV Quant в программном обеспечении для анализа клиента, поместите имена образцов в правильное расположение пластины, выберите серотип AAV и нажмите кнопку Далее. Загрузите 96-луночную платину для количественного определения в специальное оборудование и продолжайте считывание показаний планшета для сбора данных. 10. Анализ трансдукции in vitro Для быстрого анализа эффективности трансдукции rAAV можно использовать различные клеточные линии.Равномерно засейте HEK293T клетки в 24-луночные планшеты (плотность 137 500 клеток/лунку) и клеточную линию нейробластомы мыши-2А (Neuro2a) либо в 24-луночные планшеты (50 000 клеток/лунку), либо в предметное стекло с 8-луночной камерой (27 000 клеток/лунку), используя DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненные 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицином, как описано выше. Дайте ячейкам прилипнуть в течение ночи при температуре 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5%CO2. Соберите кондиционированную среду из каждой лунки (250 μл из 24-луночных планшетов и 50 μл из 8-луночного предметного стекла) и храните ее при 4 °C для последующего использования. Добавьте следующие препараты rAAV в каждую лунку и инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C в атмосфере 5%CO2 .Добавьте 50 мкл фракций, собранных FPLC, F2-F16 и протекайте в HEK293T ячейки, покрытые 24-луночными планшетами. Добавьте в общей сложности 5,5 ×10,9 vg концентрированных rAAV, разведенных в 50 μL PBS, к клеткам Neuro2a, помещенным в 24-луночные планшеты (включите отрицательную контрольную лунку, добавив 50 μL PBS в клетки). Добавьте в общей сложности 2,75 × 109 vg концентрированных rAAV, разведенных в 25 мкл PBS, к клеткам Neuro2a, помещенным в предметное стекло с 8-луночной камерой (включите условие отрицательного контроля, добавив 50 мкл PBS в клетки). Добавьте ранее хранившуюся кондиционированную среду (шаг 10.1.2) в каждую лунку и инкубируйте в течение 24 ч. Выбросьте среду и промойте клетки 2 раза PBS. Добавьте в каждую лунку 4% раствор параформальдегида (PFA) с добавлением 4% сахарозы в PBS, предварительно подогретого до 37 °C, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут. Промыть 2 раза PBS и хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока не будет выполнена визуализация (точка паузы). Получение изображений с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом 10x/0,30, или инвертированного конфокального микроскопа, оснащенного объективом Oil DIC 40x/1,4. Чтобы получить более актуальную и отражающую модель среды in vivo , используйте первичные культуры нейронов следующим образом:Подготовить первичные культуры корковых нейронов, как ранее было описано Santos et al.57. Вкратце, высейте 200 000 клеток/мл в 12-луночные планшеты и выдержите их в культуре до дня in vitro 16. Соберите кондиционированную среду из каждой лунки (100 мкл) и храните ее при температуре 4 °C для последующего использования. Добавьте тестируемые rAAV в каждую лунку: в общей сложности 2,75 × 10,9 vg концентрированных rAAV, разведенных в 25 μL PBS (включая отрицательный контроль: 25 μL PBS). Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C в атмосфере 5%CO2. Добавьте предварительно хранившуюся кондиционированную среду и выдерживайте в течение 24 ч. Слейте среду в каждую лунку и промойте 2 раза PBS. Зафиксируйте клетки 4% ПФА/4% сахарозы в PBS, как описано в шаге 10.1.6. Постирайте 2 раза с PBS. Инкубируйте каждую лунку с 5 мкг/мл агглютинина зародышей пшеницы (WGA), конъюгированного с Alexa Fluor 633, в течение 10 минут при комнатной температуре (дополнительный шаг: вместо этого выполните иммуноцитохимию). Постирайте 2 раза с PBS. Инкубировать в 0,25% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Постирайте с помощью PBS. Инкубировать с 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в течение 5 мин при комнатной температуре. Постирайте 2 раза с PBS. Получение изображений на инвертированном флуоресцентном микроскопе, оснащенном объективом 40x/0,95, или инвертированном конфокальном микроскопе, оснащенном объективом Oil DIC 40x/1,4. 11. Эксперименты in vivo ПРИМЕЧАНИЕ: Животные содержались в помещении с регулируемой температурой, поддерживаемом 12-часовым циклом свет/темнота. Еда и вода предоставлялись в свободном количестве. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных. Стереотаксическая инъекция в мозжечокОбезболить 9-недельных животных C57BL/6 путем ингаляции 2% изофлурана в присутствии кислорода (0,8 л/мин) в камере, подключенной к испарителю. Поместите животное, находящееся под наркозом, в стереотаксический аппарат (на подогретую при температуре 35 °C подушку) и поместите изофлурановую маску в нос животного. Снизить уровень изофлурана до 1,3-1,7%.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что животное правильно обезболилось, прежде чем продолжить (потеря рефлекса сгибания в обеих задних конечностях). Нанесите мазь-смазку для глаз, чтобы избежать пересыхания роговицы, и введите животному одобренный анальгетик.ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги должны выполняться в стерильных условиях. После бритья шерсти на голове животного и дезинфекции хирургической области обнажить череп и поместить наконечник иглы для инъекций с тупым наконечником 30 г, соединенной со шприцем Гамильтона объемом 10 мкл, непосредственно над брегмой (используйте брегму как ноль для вычисления стереотаксических координат). Переместите иглу в нужное положение и просверлите отверстие в черепе, куда будет входить игла.ПРИМЕЧАНИЕ: В рамках данного исследования была выполнена однократная инъекция в центр мозжечка. Вводят 4 мкл раствора rAAV, содержащего в общей сложности 8 × 109 vg, разбавленного в PBS, со скоростью инфузии 0,5 мкл/мин с помощью автоматического инжектора. Используйте следующие координаты, рассчитанные по брегме, для выполнения однократной инъекции по центру мозжечка взрослой мыши C57BL/6: передне-задний: -6,5 мм; боковой: 0 мм; брюшной: -2,9 мм.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти координаты могут варьироваться в зависимости от штамма мыши, пола и возраста используемых животных. Чтобы свести к минимуму обратный поток и обеспечить диффузию вирусного вектора, после завершения инфузии оставьте иглу шприца в этих координатах на 3 мин, затем медленно втяните ее на 0,3 мм и оставьте на месте еще 2 мин до ее полного удаления из мозга мыши. Закройте разрез и очистите его дезинфицирующим средством (например, 10% повидон-йодом). Дайте животным восстановиться после анестезии, прежде чем возвращать их в домашние клетки. Сбор и подготовка тканейПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте уровни трансдукции наблюдались через 12 недель после инъекции, но та же процедура может быть оценена уже через 4 недели после инъекции.Смертельная анестезия животных путем внутрибрюшинного введения передозировки ксилазина/кетамина (8/160 мг/кг массы тела). Транскардиально перфузирируют животных ледяным PBS в течение 6 мин со скоростью 2,5 мл/мин с последующей перфузией свежеприготовленным ледяным 4% раствором PFA в течение 10 мин с той же скоростью. Поместите вырезанные мозги в 4% PFA на ночь при комнатной температуре, а затем перенесите их в 25% раствор сахарозы/PBS для криозащиты. Как только мозги опустятся (примерно через 48 часов), храните их при температуре -80 °C. Вырежьте серийные сагиттальные срезы толщиной 30 мкм с помощью криостата при -21 °C. Для каждого животного соберите 96 сагиттальных срезов полушария мозга в анатомических сериях в виде свободно плавающих срезов в PBS с добавлением 0,05% азида натрия. Хранить при температуре 4 °C до дальнейшей обработки. Стандартная флуоресцентная иммуногистохимияВыберите восемь сагиттальных срезов для каждого животного, на расстоянии 240 мкм друг от друга. Инкубировать свободно плавающие участки в блокирующем/пермеабилизирующем растворе (0,1% Triton X-100, содержащем 10% нормальной козьей сыворотки (NGS) в PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре. Инкубируйте срезы в течение ночи при 4 °C с первичным куриным поликлональным антителом против GFP (1:1000). Промыть в течение 3 x 15 мин в PBS и инкубировать срезы в течение 2 ч при комнатной температуре с вторичным антителом козьего поликлонального антитела против курицы, конъюгированным с флуорофором Alexa Fluor 488 (1:200). Стирать 3 x 15 мин в PBS. Инкубировать с DAPI в течение 5 минут при комнатной температуре. Стирать 3 x 15 мин в PBS. Поместите срезы в предметные стекла с желатиновым покрытием и покройте флуоресцентным монтажным материалом. Получение изображений на слайдовом сканере, флуоресцентном микроскопе, оснащенном объективом 20x/0,8.