シングルステップおよび半自動ヘパリンアフィニティークロマトグラフィープロトコルによるアデノ随伴ウイルスベクターの単離

注:プロトコルの概要を示す図については、 図1 を参照してください。このプロトコルで使用されるすべての材料、器具、および試薬の詳細については、 材料の表 を参照してください。細胞やウイルスに関するすべての作業は、細胞株のメンテナンスに通常使用されるものとは別に、専用のバイオセーフティキャビネットやインキュベーターで行う必要があります。培養細胞やウイルスと接触する機器や試薬は無菌でなければなりません。ウイルスに汚染された有害試薬や物質の廃棄は、製品安全データシートに従い、各国の環境安全衛生局が定める国内法やガイドラインを遵守して行うことが不可欠です。2019年4月現在、組換えまたは合成核酸分子を含む研究に関するNIHガイドラインは、すべてのAAV血清型、および組換えまたは合成AAV構築物をリスクグループ1の薬剤(健康な成人ヒトの疾患に関連しない)として分類しています。この分類は、導入遺伝子が潜在的に腫瘍形成の可能性のある遺伝子産物または毒素をコードしておらず、構築物がヘルパーウイルスなしで産生される場合に適用されます。 動物を含むすべての実験は、2013年にポルトガルの法律(Decree Law 113/2013)に置き換えられた、実験動物の管理と使用に関する欧州連合共同体指令(2010/63/EU)に準拠して実施されました。さらに、動物法は、医学部の動物福祉担当組織およびコインブラ大学の認可された動物施設の神経科学および細胞生物学センターによって承認されました。研究者たちは、実験を行うために、ポルトガル当局(ポルトガル、リスボンのDirecção Geral de Alimentação e Veterinária)から適切なトレーニング(FELASA認定コース)と認定を受けました。 1. プラスミドコンストラクト maxiprepエンドトキシンフリーキットの製造元の指示に従って、次のプラスミドのかなりの量のDNAを分離および精製します:i)pITR:目的の転写ベクター。ii)pAAV-RCプラスミド:AAV2 RepおよびCap配列を含むpRV136;iii)pAAV-RCプラスミド:pH21、AAV1 RepおよびCap配列36を含む;iv) pAAV-RC プラスミド: pAAV2/9n、AAV2 Rep および AAV9 Cap 配列を含む;v)pHelper:pFdelta6、アデノウイルスヘルパープラスミド36。 推奨される酵素的制限を行うことにより、生成されたプラスミドの完全性をスクリーニングする36。ITRの不安定な部分内で2回切断される制限エンドヌクレアーゼであるSmaIによる消化により、pITRプラスミドの完全性をモニターします53,54。注:ITRは非常に不安定で欠失しやすいため、これらの部位での組換えを最小限に抑えるために、SURE 2スーパーコンピテントセルの使用が推奨されます。 2. 細胞培養 培養ヒト胚性腎臓293、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)高グルコースでSV40ラージT抗原(HEK293T)細胞株を安定的に発現させ、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを37°Cで、5%CO2を含む加湿雰囲気下で、後続のステップの開始点として。 滅菌済み1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4を使用して細胞を継代培養し、細胞を洗浄してから、0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加します。注:継代回数が多すぎる細胞(最大20個)は使用しないでください。細胞培養物にマイコプラズマ汚染がないか定期的に試験します。 3. 一過性トランスフェクションによるrAAV産生 1日目:セルめっき各ウイルス産生について、トランスフェクションの前日に、22 mLの添加培地に1皿あたり10.5 × 106細胞の 密度で、細胞HEK293T 10個の処理済み培養皿(直径15 cm)にプレートし、細胞が70%〜80%コンフルエントになり、トランスフェクションの準備が整うまで24時間インキュベートします。 2日目:ポリエチレンイミン(PEI)を用いた細胞導入各ウイルス産生(10.5皿に相当)について、以下のトランスフェクション混合物を微量遠心チューブにセットします:54.6 μgのpITR;45.675μgのpRV1;45.675μgのpH21またはpAAV2 / 9n;109.2μgのpFδ6。タッピングで混ぜます。 50 mLの遠心分離チューブで、4.557 mLの非添加DMEMに混合物を加えます。タッピングで混ぜます。 1.365 mLの滅菌PEI溶液を1 mg / mL(pH 7.4)で一滴ずつ加えます。.タッピングで混ぜます。室温で10分間インキュベートして、DNA-PEI複合体の形成を可能にします。 この混合物を231mLの予熱済みサプリメントDMEMに加えます。.各ディッシュの培養培地全体を、このトランスフェクション混合物22mLと交換します。細胞を48時間インキュベートします。注:この手順は、細胞の剥離を避けるために注意して実行する必要があります。 4日目:細胞採取pITRが蛍光レポーターをコードしたら、トランスフェクションされた細胞を蛍光顕微鏡で可視化します。 各ディッシュから培地を50 mLの遠心チューブに集め、800 × g で10分間遠心分離します。上清を捨てます。注:このステップはオプションであり、非常に高いコンフルエンシーのために剥離した可能性のあるトランスフェクション細胞を回収することを目的としています。 各プレートに10mLの予熱PBSを加えます。細胞スクレーパーで細胞を静かに除去し、ステップ3.3.2から懸濁液を50mLの遠心分離チューブに回収します。 追加の10 mLのPBSで一度に5つの皿を洗い、ステップ3.3.3から50 mLの遠心チューブに懸濁液を移します。細胞を800× g で10分間ペレット化し、上清を捨てます。 細胞ペレットを-80°Cで凍結します。注:セルペレットは数ヶ月間保存することができます(一時停止ポイント)。 4. rAAV抽出とFPLC精製 5日目:細胞溶解液の調製細胞ペレットを室温で解凍します。10皿から採取した細胞を、150 mM塩化ナトリウム(NaCl)および20 mMトリス(pH 8.0)を含む滅菌緩衝液100 mLに超純水(I型)に再懸濁します。均質な懸濁液を確保するために、ピペッティングで上下させて懸濁液を混合します。 超純水に10%デオキシコール酸ナトリウムの新しく調製した滅菌溶液12.5mLを加えて、細胞溶解を誘導します。ピペッティングで上下に混ぜます。注意: デオキシコール酸ナトリウムとそれと接触している材料は、製品安全データシートおよび機関の環境衛生安全局が提供するガイドラインに従って廃棄してください。また、このパウダーを取り扱う際はフェイスマスクの着用もお勧めします。混合後、溶液は非常に粘性になります。 前の混合物に27 μLのベンゾナーゼヌクレアーゼを加えます。サンプルの粘性がなくなるまで、ピペッティングで上下に完全に混合します。37°Cで1時間インキュベートし、10分ごとにボルテックスを行います。注:このエンドヌクレアーゼは、タンパク質分解活性を示すことなく、あらゆる形態のDNAおよびRNAを効率的に分解することができます。 混合物を3,000 × g で25°Cで60分間遠心分離することにより、細胞の破片を除去します。 0.45 μmの滅菌ポリフッ化ビニリデン(PVDF)シリンジフィルターで上清をろ過し、新しい滅菌容器に移します。注:この重要なステップにより、細胞の破片のほとんどが確実に除去され、クロマトグラフィーカラムの目詰まりが防止されます。この混合物の少量のアリコートを分析用に保存します(オプションのステップ)。 5日目(続き):rAAVのヘパリンカラム精製注:サンプルアプリケーションは、システムの一部としてサンプルポンプまたは50mLまたは150mLのスーパーループを使用して実行できます。低温ではより多くの空気が溶解するため、FPLCシステムで使用する前に、バッファーと溶液(通常は4°Cで保存)が室温に順応するのに十分な時間を確保することが重要です。オプション:システムを長期間保管した場合は、手動の指示または事前定義されたシステム洗浄(システムCIP)方法を使用して、システムおよびすべての入口に新たに調製した保存溶液(20%エタノール)を充填します。 手動の指示または事前定義されたシステムCIPメソッドを使用して、液体の流路を滅菌超純水で完全に洗浄します。 1 mL の充填済みヘパリンカラムを接続し、圧力アラームをセットして、5 カラム容量(CV)の超純水で 1 mL/分の流速で洗浄します。 バッファートレイ内の溶液を超純水から、入口A(システムポンプA)のバッファーA(超純水中の100 mM NaClおよび20 mMトリスの滅菌溶液、pH 8)に、入口B(システムポンプB)のバッファーB(超純水中の500 mM NaClおよび20 mMトリスの滅菌溶液、pH 8)に切り替えます。システムにサンプルポンプがある場合は、サンプルインレットバルブのバッファーインレットをバッファーAに配置します。 システムポンプBをバッファーBで洗浄し、残りの液体流路をバッファーAで満たします。注:必要に応じて、カラムを流路から切り離し、後で再接続します。 サンプルインレットバルブからのサンプルインレットチューブ(S1など)を、ステップ4.1.4で得られたウイルス調製物を入れた容器に挿入します。(細胞溶解物調製物から)。サンプルインレットS1から注入バルブまでの流路をサンプル溶液でプライミングします。または、50 mL シリンジを使用して、rAAV を含むサンプルを 50 mL または 150 mL のスーパーループに充填します。 1 mL/分の速度でバッファー B の 12.5% を使用して、総容量 5 CV でカラムを平衡化します。 サンプルポンプ( エアセンサーを使用してすべてのサンプルを注入を選択)またはスーパーループを使用してサンプルの総量をカラムに0.5 mL/minで塗布し、新しい滅菌容器の出口ポートを使用してフロースルーを収集します。注意: 過圧を防ぐための流量制御 機能が有効になっている場合、カラムが目詰まりした場合、流量は自動的に減少します。流速が 0.5 mL/分を大幅に下回った場合は、サンプル塗布を中止し、バッファー A を 2-5 CV で洗浄してから、サンプル塗布を再開します。 カラムをバッファー A 20 CV で 1 mL/分で洗浄し、アウトレットポートを使用してフロースルーを収集します。 以下のスキームでサンプルを1mL/分溶出します:i)5つのCVに対してバッファーBの50%をターゲットとする線形グラジエント。ii)5つのCV中にバッファーBの90%を目標にステップする。iii)5回のCV中にバッファーBの100%を目標にステップします。 溶出したサンプルをフラクションコレクターと低保持マイクロ遠心チューブ(2 mL)を使用して1 mLのフラクションで回収し、-20°Cで保存します。注:rAAVフラクションは数週間保存される場合があります(一時停止ポイント)。 カラムを 1 mL/分でバッファー B 12.5% で 5 CV 再平衡化します。 注入口をバッファー溶液から超純水に切り替え、カラムを 1 mL/分で 5 CV 洗浄します。 注入口を超純水から20%エタノールに切り替え、カラムを1 mL/分で5CV洗浄し、カラムを外して4°Cで保存します。注:同じrAAV血清型と導入遺伝子が使用されている場合、カラムは他の主要な洗浄および消毒手順なしで数回再利用できます。 手動の指示または事前定義されたシステムCIPメソッドを使用して、液体の流路を20%エタノールで完全に洗浄します。 5. 精製されたrAAVの濃度 6日目:集中ステップ1分子量100 kDaのカットオフ値を持つ15 mL遠心フィルターユニットを使用して、rAAVを濃縮します。rAAVを含む所望の画分(FPLC画分7〜16)を15 mL遠心フィルターユニットにロードし、室温で2,000 × g で2分間遠心分離します。フィルターユニット内の濃縮容量が約500μLであることを確認してください。濃縮容量が500 μLを大幅に超える場合は、目的の容量に達するまで1分間隔で遠心分離ステップを繰り返します。 6日目(続き):バッファー交換rAAVを含む遠心フィルターユニットに滅菌PBS1mLを加えます。慎重に上下にピペットで動かしてフィルターを洗います。最終容量が500 μLに達するまで、1分間隔で2,000 × g で遠心分離します。 6日目(続き):集中ステップ2前のステップで得られた500 μLの濃縮rAAVを、分子量100 kDaカットオフの0.5 mL遠心フィルターユニットに移し、6,000 × g で1分間遠心分離します。必要に応じて、最終容量が100 μL未満になるまで遠心分離ステップを繰り返します。 6日目(続き):回復濃縮されたrAAVを回収するには、フィルターデバイスを逆さまにして、新しい微量遠心分離機の収集チューブに入れます。キャップを中央に向けてチューブを微量遠心分離機に入れ、フローチャンバー内で長時間回転させて、濃縮されたrAAVをデバイスから微量遠心チューブに移します。または、1,000 × g で2分間遠心分離します。 滅菌プルロニックF-68 0.001%(オプション)を補充します。注:プルロニックF-68は、食品医薬品局によってヒトでの使用が承認された非イオン性界面活性剤であり、希釈調製、注射器の装填、および送達装置55,56中に使用される材料(プラスチック)の表面との相互作用を防ぐことにより、rAAVの損失を軽減することができる。 rAAVを低保持マイクロ遠心チューブに分注し、-80°C(一時停止点)で保存します。 6. 精製されたrAAVの定量 6日目(続き):市販のキットを使用し、製造元の指示に従って、リアルタイムの定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)により、ウイルスゲノム/μL(vg/μL)で発現するrAAV製剤の力価を決定します。rAAV粒子溶液をDNase Iと37°Cで20分間インキュベートします。注:この手順は、宿主細胞に由来する遊離ゲノムDNAおよびプラスミドDNAの消化を促進し、したがって、インタクトなrAAV粒子内の核酸配列のみが保存されるようにする。 DNase Iを95°Cで10分間熱不活化します。 Lysis Bufferを添加し、70°Cで10分間インキュベートして、rAAV粒子のタンパク質の熱変性を促進します。 得られた rAAV ゲノム溶液を希釈バッファーで希釈してから、RT-qPCR に進みます。キットに付属のポジティブコントロールの段階希釈標準試料のセット(2 ×107 vg/μL から 2 × 102 vg/μL まで)を調製します。 12.5 μLのTaq IIミックス、0.5 μLの希釈プライマーミックス、7 μLの水、および5 μLの希釈rAAV DNA(未知のAAVサンプルおよびステップ6.1.4の標準)を含む反応混合物を実行します。 RT-qPCRは、95°Cで1サイクルで2分間(初期変性)、95°Cで40サイクルで5秒間(変性)、60°Cで30秒間(アニーリング、伸長、プレート読み取り)のプロトコルを使用して、リアルタイムPCR検出システムで実行し、その後、メルトカーブ分析を行います。 rAAVサンプル調製から生じる希釈係数を考慮して、標準曲線(線形回帰直線)から絶対サンプル濃度を計算します。注:ウイルスゲノム数の定量化は、AAV2のITR配列(キットによって提供されるプライマーの標的配列)の増幅によって達成されます。 7. SDS-PAGE、クマシーブルー染色、ウェスタンブロット 6x サンプルバッファー(0.5 M Tris-HCl/0.4% Dodecyl Sufate (SDS) pH 6.8、30% グリセロール、10% SDS、0.6 M ジチオスレイトール(DTT)、0.012% ブロモフェノールブルー)を加え、サンプルを 95 °C で 5 分間インキュベートして、各サンプルの 40 μL (各 FPLC 画分、フロースルー、プレカラムサンプル、および最終濃縮産物の合計 2.3 × 1010 vg )を変性させます。 変性したサンプル(48 μL)をSDS-ポリアクリルアミドゲル(4%スタッキングゲル、10%分離ゲル)にロードし、タンパク質ラダーに隣接して100 Vで70分間電気泳動分離を行います。 タンパク質分析注:クマシーブルー染色またはウェスタンブロッティングのいずれかを実行できます。クマシーブルー染色タンパク質バンドを可視化するには、50%メタノールと10%酢酸氷に溶解した0.25%クマシーブルーG250溶液でゲルを10分間染色します。 メタノール25%、酢酸5%の氷河を含む溶液で、バックグラウンドの低い透明なバンドが見えるまで数回洗浄し、ゲル脱染を行います。 適切なイメージングシステムを使用して画像をキャプチャします。 ウェスタンブロット標準的なプロトコルに従って、タンパク質をPVDFメンブレンに移します。 TBS-T(0.1%Tween 20 in Tris緩衝生理食塩水)で希釈した5%脱脂乳を室温で1時間インキュベートすることにより、メンブレンをブロックします。 4°Cで一晩インキュベートするには、以下の一次抗体(ブロッキング溶液で希釈したもの)を使用してください:マウスモノクローナル抗AAV、VP1、VP2、VP3抗体(B1、1:1,000)、またはマウスモノクローナル抗AAV、VP1、VP2抗体(A69、1:1,000)。 メンブレンをTBS-Tで3 x 15分間洗浄し、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体(1:10,000)と室温で2時間インキュベートします。 TBS-Tでメンブレンを3 x 15分間洗浄します。強化された化学蛍光基質(ECF)を添加し、化学蛍光イメージングによってタンパク質バンドを可視化します。 8. 透過型電子顕微鏡(TEM) Formvarカーボンコーティングされた200メッシュグリッドを逆さまにして、rAAVサンプルの滴の上に置き、1分間沈殿させます。 グリッドを一滴の水で洗い、余分な液体を濾紙で乾かします。 1%酢酸ウラニル溶液(pH 7)でグリッドを1分間ネガティブ染色し、ウイルス粒子を固定して造影します。 グリッドを一滴の水で洗い、余分な液体を濾紙で乾かします。 透過型電子顕微鏡で試料を検査します。注:高塩濃度は、rAAVのグリッドへの結合に直接影響を与え、結晶様構造の可視化につながる可能性があります。 9. 連続的な紫外可視光吸収、静的光散乱、動的光散乱解析 96ウェル定量プレートに、2 μLのrAAVサンプルと2 μLのPBSをロードして、バッファーブランクとして使用します(これを重複して実行します)。 クライアント解析ソフトウェアのAAV Quantアプリケーションを使用して、サンプルの名前をプレートの正しい位置に置き、 AAV血清型を選択して、 Nextをクリックします。 96ウェル定量プレートを専用装置にロードし、データ取得のためのプレート読み取りを進めます。 10. in vitro 形質導入アッセイ さまざまな細胞株を使用して、rAAVの形質導入効率を迅速に分析できます。24ウェルプレート(密度137,500細胞/ウェル)およびマウス神経芽細胞腫-2A(Neuro2a)細胞株に、24ウェルプレート(50,000細胞/ウェル)または8ウェルチャンバースライド(27,000細胞/ウェル)のいずれかで、上記のように10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したDMEM高グルコースを用いて、HEK293T細胞を均等に播種する。細胞を37°Cで一晩接着させ、5%CO2を含む加湿雰囲気で接着させます。 各ウェルから馴化培地(24ウェルプレートから250 μL、8ウェルチャンバースライドから50 μL)を回収し、後で使用するために4°Cで保存します。 以下のrAAV調製物を各ウェルに加え、細胞を5%CO2 雰囲気中で37°Cで24時間インキュベートします。FPLCで回収したフラクションF2-F16を50 μL加え、24ウェルプレートに播種したHEK293T細胞にフロースルーします。 50 μLのPBSで希釈した濃縮rAAVの合計5.5 × 109 vgを、24ウェルプレートに播種したNeuro2a細胞に添加します(50 μLのPBSを細胞に添加することにより、ネガティブコントロールウェルを含む)。 25 μLのPBSで希釈した濃縮rAAVの合計2.75 × 109 vgを、8ウェルチャンバースライドでプレーティングしたNeuro2a細胞に加えます(50 μLのPBSを細胞に添加して、ネガティブコントロール条件を含めます)。 以前に保存した馴化培地(ステップ10.1.2)を各ウェルに加え、24時間インキュベートします。 培地を廃棄し、細胞をPBSで2回洗浄します。 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液にPBS溶液を添加し、37°Cに予熱して各ウェルに添加し、室温で20分間インキュベートします。 PBSで2回洗浄し、イメージングが行われるまで4°Cで保存します(一時停止ポイント)。 10倍/0.30対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡、または40倍/1.4オイルDIC対物レンズを備えた倒立共焦点顕微鏡で画像を取得します。 in vivo環境のより適切で反射的なモデルを得るには、次のように初代ニューロン培養を使用します。Santosらによって以前に記述された皮質ニューロンの初代培養物を調製する。57.簡単に、200,000細胞/ mLを12ウェルプレートに播種し、 in vitro 16日目まで培養に保持します。 各ウェルから馴化培地(100 μL)を採取し、後で使用するために4°Cで保存します。 試験するrAAVを各ウェルに加えます:25μLのPBSで希釈した濃縮rAAVの合計2.75×109 vg(ネガティブコントロールを含む:25μLのPBS)。5% CO2 雰囲気中で37°Cで24時間インキュベートします。 予め保存した馴化培地を加え、24時間インキュベートする。 各ウェルの培地を捨て、PBSで2回洗浄します。 ステップ10.1.6で説明したように、PBS中の4%PFA/4%スクロースで細胞を固定します。PBSで2回洗ってください。 Alexa Fluor 633と結合した5 μg/mLの小麦胚芽凝集素(WGA)と室温で10分間、各ウェルをインキュベートします(オプションのステップ:代わりに免疫細胞化学を実行します)。PBSで2回洗ってください。 0.25% Triton X-100 in PBSで5分間、室温でインキュベートします。PBSで洗ってください。 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)と室温で5分間インキュベートします。PBSで2回洗ってください。 40倍/0.95対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡、または40倍/1.4オイルDIC対物レンズを備えた倒立共焦点顕微鏡で画像を取得します。 11. 生体内 実験 注:動物は温度管理された部屋に収容され、12時間の明暗サイクルで維持されました。食料と水は 自由に提供されました。動物の苦しみを最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。 小脳への脳定位注射気化器に接続されたチャンバー内の酸素 (0.8 L/分) の存在下で 2% イソフルランを吸入することにより、9 週齢の C57BL/6 動物に麻酔をかけます。 麻酔をかけた動物を定位固定装置(35°Cの温めたパッドの上)に入れ、イソフルランマスクを動物の鼻に入れます。イソフルランレベルを1.3〜1.7%に下げます。注:続行する前に、動物が正しく麻酔されていることを確認してください(両方の後肢の屈曲に対する反射の喪失)。 角膜の乾燥を避けるために潤滑剤の眼軟膏を塗布し、承認された鎮痛剤を動物に注射します。注:後続のすべての手順は、無菌状態で実行する必要があります。 動物の頭の毛皮を剃り、手術部位を消毒した後、頭蓋骨を露出させ、10μLのハミルトン注射器に接続された30Gの鈍い先端注射針の先端をブレグマの真上に置きます(脳定位固定装置の座標の計算にはブレグマをゼロとして使用します)。 針を目的の座標に移動し、針が入る頭蓋骨に穴を開けます。注:この研究の枠組みでは、単回注射が小脳の中心で行われました。 自動インジェクターを使用して、PBSで希釈した合計8 × 109 vgを含むrAAVの溶液4μLを注入します。bregmaから計算された以下の座標を使用して、成体C57BL / 6マウスの小脳の中心に単回注射を行う:前後:-6.5mm;横方向:0 mm;腹側:-2.9 mm。注:これらの座標は、マウスの系統、性別、および使用中の動物の年齢によって異なる場合があります。 逆流を最小限に抑え、ウイルスベクターの拡散を可能にするために、注入が完了したら、シリンジ針をこれらの座標に3分間放置し、次にゆっくりと0.3mm引っ込め、マウスの脳から完全に除去する前にさらに2分間所定の位置に留まらせます。 切開部を閉じ、消毒剤(例:10 %ポビドンヨード)で洗浄します。 動物を家のケージに戻す前に、麻酔から回復させます。 組織の収集と準備注:この実験では、形質導入レベルは注射後12週間で観察されましたが、注射後4週間で同じ手順を評価できました。キシラジン/ケタミンの過剰摂取(8/160 mg / kg体重)の腹腔内投与により、動物に終末麻酔をかけます。. 氷冷PBSを2.5mL/分の割合で6分間経心灌流し、続いて調製したばかりの氷冷4%PFA溶液を同じ速度で10分間灌流します。 切除した脳を室温で一晩4%PFAに浸し、凍結保護のために25%スクロース/ PBS溶液に移します。脳が沈んだら(約48時間後)、-80°Cで保存します。 -21°Cのクライオスタットを使用して、厚さ30μmの連続矢状切片を切断します。 動物ごとに、0.05%アジ化ナトリウムを添加したPBSの浮遊切片として、解剖学的シリーズで脳半球の96の矢状切片を収集します。次の処理まで4°Cで保存してください。 標準的な蛍光免疫組織化学動物ごとに8つの矢状切片を、互いに240μmの距離で選択します。 フリーフローティング切片をブロッキング/透過化溶液(PBSに10%の正常ヤギ血清(NGS)を含む0.1% Triton X-100)で室温で1時間インキュベートします。 切片をチキンポリクローナル抗GFP一次抗体(1:1,000)とともに4°Cで一晩インキュベートします。 PBSで15分間×3回洗浄し、Alexa Fluor 488蛍光色素に結合した二次抗体ヤギポリクローナル抗ニワトリ抗体(1:200)と室温で2時間インキュベートします。 PBSで3 x 15分間洗浄します。DAPIと室温で5分間インキュベートします。 PBSで3 x 15分間洗浄します。ゼラチンでコーティングされたスライドに切片を置き、蛍光封入剤で覆います。 20x/0.8対物レンズを装備したスライドスキャナー蛍光顕微鏡で画像を取得します。