ゼブラフィッシュ胚におけるミクログリア動態のライブイメージングとキャラクタリゼーション

ゼブラフィッシュは、FELASA42および機関(Université Libre de Bruxelles、ブリュッセル、ベルギー;ULB)のガイドラインと規制。すべての実験手順は、ULBの動物福祉倫理委員会(CEBEA)によってULBから承認されました。 1. ゼブラフィッシュの飼育と胚の準備 注:ミクログリアを含むマクロファージで蛍光eGFPタンパク質を発現するゼブラフィッシュトランスジェニック系統 Tg(mpeg1:eGFP)gl22 を使用して、このプロトコルに示されている追跡データを生成しました。他のマクロファージレポーターラインはZIRCから入手でき、これも使用できます。トランスジェニック株を選択する際には、シグナル強度が高いと画像取得と細胞分節が容易になることを考慮することが重要です。 ゼブラフィッシュ(Danio rerio)を28°Cの温度に維持し、確立されたプロトコル11に従って管理します。 目的の胚の生年月日の前の午後遅くに、メスとオスの魚をメッシュの底とセパレーターを備えた繁殖タンクに一緒に配置することにより、交配を刺激します。翌朝、魚の交尾のタイミングを計るためにセパレーターを取り外します。 メッシュを使用して受精卵を収集し、E3培地(5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4)と0.01%メチレンブルーを含む100 mmシャーレに移します。使用したゼブラフィッシュトランスジェニック系統の遺伝的背景にもよりますが、イメージングを容易にするために色素形成を阻害する場合は、受精後6時間(hpf)から開始し、目的の発生段階に達するまで2日ごとに溶液をリフレッシュして、胚が発生しているE3バッファーに N-フェニルチオ尿素(PTU)の0.003%を追加します。注:胚発生12に影響を及ぼし得るPTUへの長時間の曝露を避けるために、可能であれば、Casperw2のような色素欠損の背景上のトランスジェニックラインを使用することが推奨される。これにより、胚を長期間PTUに曝露することなく明確なイメージングが可能になる13。 画像化する胚が受精後3日未満(dpf)の場合は、24 hpfでデコリオネートします。実体顕微鏡を使用して、すべての胚がデコレーションされ、酵素処理による損傷を受けていないことを確認します(ステップ1.4.2を参照)。卵の数が限られている場合は、細かい解剖鉗子を使用して絨毛膜をつまんで外側に引き抜き、各胚を絨毛膜から慎重に解放することにより、これを手動で行います。 卵の数が多い場合は、E3培地の1 mg / mLプロナーゼ溶液に卵を大量に室温(RT)で短時間(通常は5〜10分、穏やかに振って絨毛膜が開くまで)卵をインキュベートすることにより、酵素的にデコレーションを行います。.次に、プロナーゼ溶液を廃棄し、胚を新鮮なE3で3回徹底的にすすぎ、残っている絨毛膜と残留酵素を取り除きます。 2.ゼブラフィッシュの取り付け E3バッファーに1%低融点アガロース溶液を調製します。ベンチトップの加熱ブロックでアガロースを37°Cに冷却し、作りたてのトリカインメタンスルホン酸溶液(160 mg/L)を加えると、イメージング中に胚に麻酔をかけ続けることができます。溶液をボルテックスして、完全に均質化します。 E3バッファーに胚を含むペトリ皿に160 mg / Lのトリカインメタンスルホン酸を加えて胚を麻酔します。動きが止まったことを確認し、目的の蛍光を持つゼブラフィッシュの胚を選択します。胚の健康状態を、明視野実体顕微鏡で心拍を可視化して確認します。先端の広いトランスファーピペットを使用して、選択した胚の1つまたは最大3つを引き出し、底面のガラスイメージングプレートに移します。 実体顕微鏡下で、ピペットを使用してできるだけ多くの培地を取り出し、胚に触れたり損傷したりしないように注意してください。次に、培地を以前に調製した1%低融点アガロース溶液と交換します。次に、ティーリング針の端に固定されたプラスチック製の細い先細りの先端を使用して、各胚をイメージングプレートの底に優しく押し込み、背側がガラスに向くように向きを変えて、視眼蓋がよく見え、胚とガラスの間に低融点のアガロースが最小限に抑えられます。 高品質のPlan Apo対物レンズ(ここでは10x/0.45 Plan Apoまたは20x/0.75 Plan Apoを使用)を備えた倒立共焦点顕微鏡を使用して、マウントされた胚を迅速にイメージングします。タイムラプスが長時間(1時間以上)実行される場合は、下部のガラスイメージングプレートにトリカインメタンスルホン酸(160 mg / L)を含むE3バッファーを1〜2滴追加して、低融点のアガロースが過度に乾燥しないようにします。注:アガロースが完全に固化するのを待ってから、E3バッファーとトリカインメタンスルホン酸培地をイメージングディスクに追加することが重要です。そうしないと、魚がゆっくりと横方向および軸方向に移動し、タイムラプスでサンプルドリフトが発生する可能性があります。 希望の時間でのタイムラプス撮影の設定に進みます:画像解像度を1,024 x 1,024、ピクセルサイズを0.49μmに設定します。光学スライスを2〜3μm刻みで収集して、z軸上の許容可能な解像度を確保します。ゼブラフィッシュの胚では、使用する発生段階に応じて、視蓋を100〜150μmのzスタックに閉じ込めます。セルの追跡を成功させるには、フレーム間の時間間隔を 30 秒から 60 秒の間に保ちます。 3. トラッキング分析とデータエクスポート Imarisファイルコンバータソフトウェアを使用して、タイムラプスファイルをIMS形式に変換します( 資料の表を参照)。ソフトウェアを起動したら、ファイルを入力領域にドラッグアンドドロップするか、 ファイルの追加… 手動で選択するためのボタン。[ 出力 ]メニューで、変換されたファイルの場所を指定し、入力ファイルと同じフォルダを選択するか、特定のフォルダを指定します。[ Set Voxel Size ]ボタンをクリックして、表示されるボクセル サイズの寸法が正しいことを確認し、ボクセル サイズを確認したら、[ Start All ]ボタンを押してファイル変換を開始します(すべてのデータ分析のステップバイステップ ガイドについては 、補足ファイル 1 を参照してください)。注:タイムラプスが2つ以上の胚で並行して行われた場合、ファイルは自動的に1つの位置に分割され、各胚は異なるファイルに分割されます。ソフトウェアをバッチモードで使用し、複数のファイルを同時にアップロードおよび変換することが可能です。IMSファイルは、選択した宛先フォルダまたは入力ファイルが配置されているフォルダに作成され、保存されます。 起動したら、アリーナで分析ソフトウェアを起動します。「Observe Folder」をクリックして、以前に変換したファイルを開きます。ファイルがソフトウェアにロードされたら、スライスビューを使用して、ビューエリアの左側にあるスライスツールバーのスライダーを使用してzスタックをスクロールし、ポインターを使用して選択したセルの直径を描画してセルの直径を測定します。マウスをクリックしてドラッグし、セル コアにまたがるセグメントを描画します。表示領域の右側にあるメジャーツールバーに描かれたセグメントの長さを観察します。注:ステップ2.5のイメージング設定を使用すると、細胞本体の直径は6μmから8μmの間であると予想できます。 セルを自動的に検出するには、3Dビューに戻り、オブジェクトツールバーのスポットアイコンをクリックして、オブジェクトリストに新しいスポットオブジェクトを追加し、自動スポット作成ウィザードを開きます。ウィザードの最初のステップで、関心のある領域のみをセグメント化するオプションにチェックを入れます。次に、トラッキング データを計算するための Track Spots (over time) オプションと、スポット間の比較を可能にし、分析の後半で使用できるデータの範囲を拡大するための Object-Object Statistics を有効にします。最後に、ウィザードウィンドウの右下にある[次へ]ボタンをクリックして、ウィザードを続行します。 第2ステップでは、胚の視蓋を囲む関心領域(ROI)領域の指定に進みます。ROIのサイズを変更するには、ROIの各面にある小さな白い矢印をクリックしてドラッグします。ROIサイズを定義したら、時間間隔を調整して、記録されたすべてのフレームにROIサイズを拡張します。 次に、セルの検出に使用したチャンネルを Source Channel として選択し、ステップ3.2で取得したセル直径測定値を Estimated XY Diameterとして設定します。 [バックグラウンド減算 ]オプションを有効にして、[ 次へ]をクリックします。 スポット作成ウィザードのこの時点で、ソフトウェアには、各スポットの中心で測定された信号強度によってスポットがフィルタリングされる品質フィルタリングステップが組み込まれています。スポットが検出されたチャネルで。強度の閾値を調整するには、下限閾値と上限閾値ボックスのデータフィールドに値を直接入力するか、作成ウィザードの下部に表示されるヒストグラムの対応する色の線をドラッグして、組織の深部に局在する細胞(通常はシグナル強度が低い細胞を含む)をすべて検出します。これらの変更はすべて、ビューエリアに同時に表示されます。注:この時点で、1つのセルにラベル付けする複数のスポットが観察される可能性がありますが、これは分析の後半で修正できます。長時間のタイムラプスで、光退色が見られる場合は、しきい値を設定する前に複数のフレーム の表示領域 をチェックして、すべてのセルが最新のフレーム、したがって暗いフレームでも検出されていることを確認してください。 問題がなければ、[ 次へ ]をクリックして、選択した品質しきい値を検証します。品質しきい値パラメータを満たし、直径が推定XY直径と一致するすべてのスポットは、スポットとしてラベル付けされます。 これを View Area でプレビューとして視覚化すると、これら 2 つのパラメーターを満たすスポットが Source Channel に重ねられます。 次のステップでは、トラッキングアルゴリズムとして 「自己回帰運動 」を選択し、多かれ少なかれ連続的な運動を持つ細胞を追跡します。2 つのフレーム間のスポットの動きを注意深く観察して、セルが 2 つの時点間を移動する最長距離を判断し、[ 最大距離 ] フィールドに推定値を入力します。これは、スポットが予測された将来の位置から逸脱できる距離です。 [最大ギャップ サイズ] を、トラックを中断せずにスポットが消える最小のタイム ポイント数に設定します。フレーム間の間隔が 60 秒未満の場合は、サイズ 3 を使用します。フレーム間の時間間隔が長い場合は、トラックの断片化を減らすために許容される最大ギャップサイズを大きくします。 [ 検出されたすべてのオブジェクトでギャップを埋め る] を有効にすると、検出しきい値をトラッキング アルゴリズムによって予測された予想位置に近づけ、スポット検出の失敗によって中断されたトラックが接続されます。最後に、[ 次へ ]をクリックして、ソフトウェアが以前に生成されたすべてのスポットのトラックを自動的に生成します。 取得したトラックが多すぎたり断片化されていると思われる場合は、 作成ウィザードに戻り、[ 前へ ]ボタンをクリックして、以前に定義した最大距離を調整し、取得したトラックのほとんどがセルの動きを表すようになるまで数を増やすか減らします。注:トラックの数は、ミクログリア細胞の数とほぼ一致させる必要があるため、胚の年齢に応じて 30〜50の範囲です。ただし、解析が完了する前に、誤ったトラックのために、より多くの数値が予想されます。 トラックが計算されると、ソフトウェアはフィルタリングステップを組み込んで、不正確または情報量が少ないことが多いため、非常に短いトラックをすべてフィルタリングします。3 分から 8 分未満のトラックを除外するには、トラック期間フィルター の下限 のデータ フィールドに値を直接入力するか、 作成ウィザードの下部に表示されるヒストグラムで対応する色の線をドラッグします。[ 次へ ]をクリックしてフィルターを検証し、作成ウィザードに進みます。注:前述のように、トラックの最大(最大)および最小(最小)のしきい値を変更することで、フィルタリングされて分析から除外されるトラックをプレビューできます。フィルタリングされたトラックは、さらに分析するために新しいオブジェクトに複製できます。フィルタリングの正確な時間しきい値は、前の 作成ウィザード 手順の結果によって異なる場合があります。これらのフィルター設定を微調整するには、 表示領域 のプレビューを確認して最適な結果を得ることをお勧めします。 Tg(mpeg1:eGFP)トランスジェニックラインはすべての単核食細胞を標識するため、タイムラプス動画ではミクログリアに加えて皮膚マクロファージも検出されます。皮膚マクロファージから生成されたトラックを解析から手動で削除し、脳実質ミクログリアに焦点を当てます(図3)。 トラックエディタでトラック内の他の潜在的な間違いを手動で修正します。各データポイントはトラック内のオブジェクトとして表示されます。ビューエリアの右側にあるサークルセレクトモードボタンをアクティブにして、変更や調整が必要なトラックをハイライトします。問題のあるトラックを選択したら、接続ボタンと切断ボタンを使用して、セルの動きを正しく表すように編集します。トラックエディタを使用して、重複した単一のスポットや、同じセルを誤って表す小さなトラックフラグメントも選択および削除します。それらを円選択モードで選択し、Canc または Delete を押して削除します。注: 追跡の設定が正しい場合、この手順は追跡されるセルのごく一部にのみ必要です。 ミクログリアレポーター株を、実質内の他の細胞種を標識する蛍光トランスジェニックと組み合わせて使用する場合は、新しい表面オブジェクトまたはスポットオブジェクトとしてセグメンテーションを行い、それらを視覚化します。これを行うには、上記の手順(手順3.2から3.14)を繰り返し、手順3.5の ソースチャネル 入力を変更して、2番目の細胞集団のイメージングに使用するものに変更し、 推定XY直径 (ステップ3.5)、 最大距離 (ステップ3.8)など、目的の細胞に固有の記述パラメーターを新しい細胞集団に適合させます。他の手順は変更せずに繰り返すことができます。注: 新しいサーフェスを作成する場合、[推定 XY 直径] は、オブジェクトに収まる最大の球の直径が入力される [背景の減算] に基づくしきい値オプションに置き換えられます。この値は、ステップ 3.2 で説明したように、Measure ツールバーを使用して Slice ビューから推定できます。 取得したトラックに満足したら、[ 統計 ]タブから目的のトラッキング統計を抽出します。 設定 ボタンをクリックして、以前に作成した各スポットオブジェクトまたはサーフェスオブジェクトに対して計算する統計を選択します。同じ解析でさらにオブジェクトが作成された場合、2つのスポットオブジェクト、またはスポットとサーフェスオブジェクトの場合、2つのオブジェクト間の最短距離など、1つのオブジェクトと他のオブジェクトの相対位置を示す統計もエクスポートできます。注:必要なすべての値は、特定の値または平均値のいずれかであり、すべての生データは、[ 統計 ]タブの下部にあるボタンを使用してカンマ区切り値(CSV)ファイルとしてダウンロードできます。解析に他のセルタイプも含まれる場合、1つのオブジェクトと他のオブジェクトとの相対距離に関する追加の統計も利用可能になります。