Demostramos un método que aprovecha la microscopía confocal de barrido rápido para realizar imágenes en vivo de las células de la microglía en el tectum óptico del pez cebra en desarrollo, lo que permite el análisis de la dinámica de estas células in vivo.
Las microglías son células altamente dinámicas y su migración y colonización del parénquima cerebral es un paso crucial para el desarrollo y la función cerebral adecuados. Los embriones de pez cebra que se desarrollan externamente poseen transparencia óptica, que junto con líneas reporteras transgénicas bien caracterizadas que marcan fluorescentemente la microglía, hacen del pez cebra un modelo de vertebrado ideal para tales estudios. En este artículo, aprovechamos las características únicas del modelo de pez cebra para visualizar la dinámica de las células de la microglía in vivo y en condiciones fisiológicas. Utilizamos microscopía confocal para registrar un lapso de tiempo de las células de la microglía en el tectum óptico del embrión de pez cebra y luego, extraemos los datos de seguimiento utilizando el software IMARIS 10.0 para obtener la ruta de migración de las células, la velocidad media y la distribución en el tectum óptico en diferentes etapas de desarrollo. Este protocolo puede ser una herramienta útil para dilucidar la importancia fisiológica del comportamiento de la microglía en diversos contextos, contribuyendo a una caracterización más profunda de estas células altamente móviles.
Como macrófagos residentes en el sistema nervioso central (SNC), la microglía representa una población no neuronal distinta que representa hasta el 15% de todas las células gliales en el cerebro adulto. El estudio de la biología de la microglía ha ganado cada vez más atención en los últimos años debido a su importancia establecida en el desarrollo, la fisiología y la enfermedad1. En condiciones fisiológicas, las células microgliales son altamente dinámicas, inspeccionando continuamente el parénquima cerebral 2,3. Este comportamiento permite que la microglía colonice el cerebro y desempeñe un papel fundamental en su desarrollo, como la conformación de los circuitos neuronales4, la poda sináptica5 y la vasculogénesis6. Además, esta naturaleza dinámica inherente permite a la microglía monitorear constantemente el SNC en busca de signos de infección, lesión o cualquier desviación de la homeostasis7. Para diseccionar estas intrincadas dinámicas celulares, es indispensable obtener imágenes en vivo de la microglía a través del espacio y el tiempo. Afortunadamente, la transparencia óptica de los embriones de pez cebra en desarrollo externo, junto con la disponibilidad de líneas reporteras transgénicas bien caracterizadas que marcan fluorescentemente la microglía, posiciona al pez cebra como un modelo de vertebrado ideal para tales investigaciones. Las imágenes en vivo en embriones de pez cebra ofrecen un enfoque no invasivo que no requiere cirugía ni manipulación extensa del tejido, lo que minimiza las posibles perturbaciones en el estado del SNC. Esta es una consideración crítica cuando se estudian las células microgliales, ya que son muy sensibles incluso a los cambios sutiles en el entorno extracelular8.
Aquí, proporcionamos una guía para rastrear con éxito los movimientos de las células microgliales en 3D en el embrión de pez cebra, lo que permite una vista sin precedentes del comportamiento de la microglía dentro de la arquitectura intacta del parénquima cerebral en desarrollo (consulte la Figura 1 para obtener una descripción gráfica del protocolo). Este protocolo paso a paso detalla cómo configurar y obtener imágenes de la microglía del pez cebra en diferentes etapas de desarrollo y cómo extraer datos de alta resolución sobre la motilidad de las células de la microglía para proporcionar información valiosa sobre sus patrones migratorios y respuestas a las señales ambientales. También demostramos que este protocolo se puede adaptar para realizar imágenes multicolor en vivo, extendiendo así su aplicabilidad al estudio de la microglía en combinación con líneas transgénicas que marcan las células vecinas, incluidas las neuronas3, los oligodendrocitos9 y las células endoteliales10 (como se muestra en la Figura 2). Al añadir a la caja de herramientas que permite observar y caracterizar directamente la dinámica del comportamiento de la microglía en tiempo real y en su entorno natural, este protocolo probablemente contribuirá a dilucidar mejor la funcionalidad de la microglía durante el desarrollo temprano, tanto en fisiología como en enfermedad.
El protocolo actual permite la obtención de imágenes in vivo de la dinámica de la microglía en un embrión de vertebrado y la visualización de los datos de motilidad adquiridos. La colonización de la microglía del cerebro en desarrollo ocurre muy temprano durante la embriogénesis y precede a eventos críticos como picos de neurogénesis, astrogliogénesis, oligodendrogénesis y muchos otros procesos celulares17. Por lo tanto, no es sorprendente que la microglía desempeñe funciones importantes en la configuración de aspectos específicos del desarrollo cerebral18, por ejemplo, a través de la regulación de la diferenciación neuronal, la migración y la supervivencia 19,20,21, así como la poda sináptica 5 y la mielinización 22,23,24.
La contribución de la microglía disfuncional a la patogénesis y/o progresión de los trastornos del neurodesarrollo también está siendo cada vez más reconocida25. De hecho, la presencia temprana de microglía en el cerebro en formación expone a estas células a distintos estados fisiológicos26 y cambios ambientales. Esto puede tener un impacto significativo dado que la microglía es una célula longeva tanto en roedores como en humanos, manteniéndose durante toda la vida a través de la autorrenovación de los progenitores locales 27,28,29. Creemos que este protocolo podría servir como una herramienta poderosa para caracterizar mejor el comportamiento de la microglía en estos estados fisiológicos distintos, a medida que se desarrollan, maduran y establecen su red durante los pasos sucesivos de la morfogénesis cerebral.
Usando la configuración descrita aquí, hemos obtenido con éxito imágenes y datos sobre larvas de pez cebra de hasta 6 dpf. Es probable que la extensión del análisis a etapas posteriores del desarrollo tenga éxito, pero requerirá ajustar la configuración de las imágenes para tener en cuenta el mayor tamaño de la muestra, especialmente a lo largo del eje z. Al intentar esto, sugerimos centrarse en mantener una relación señal-ruido baja y un tiempo de escaneo rápido, ya que son parámetros clave para un análisis exitoso.
Sugerimos un tiempo mínimo de imagen de 1 h para permitir el seguimiento de la microglía; La ventana de imagen más larga que se ha probado con este protocolo es de 8 h. Además, es importante que el análisis de seguimiento mantenga el intervalo de tiempo entre fotogramas lo más corto posible, idealmente entre 30 s y 60 s. Esto permitirá obtener datos de seguimiento más precisos y detallados en los análisis posteriores. Por lo tanto, especialmente si se detecta más de un fluoróforo, es fundamental evitar la superposición espectral y garantizar una separación suficiente entre los dos espectros de emisión de fluoróforos para permitir una adquisición simultánea, sin fuga de señal.
Existen otros protocolos para la grabación de alta calidad del cerebro del pez cebra30, pero este es el primero que muestra cómo rastrear con éxito todo el movimiento de la microglía durante el desarrollo embrionario durante un período prolongado. Aunque el flujo de trabajo presentado aquí se centró en el seguimiento de la microglía en un contexto fisiológico, se puede aplicar fácilmente al análisis de la microglía en patología. De hecho, se han establecido varios modelos de trastornos del neurodesarrollo, como el autismo31, la epilepsia32 y la esquizofrenia33, pero también la neurodegeneración34 y el cáncer35, que brindan oportunidades únicas para determinar la respuesta y el comportamiento de la microglía en condiciones de enfermedad.
En particular, este protocolo de seguimiento es muy versátil y también podría ser fundamental para arrojar luz sobre los patrones de migración de varios tipos de células a través de diversas regiones anatómicas del embrión de pez cebra, lo que podría abrir vías para aplicaciones adicionales, más allá del alcance de la investigación microglial descrito en este artículo. Además, al aprovechar la capacidad de combinar múltiples líneas transgénicas fluorescentes, obtenemos la capacidad de discernir la relación espacial entre la microglía y otros tipos de células del microambiente cerebral, con el potencial de visualizar las interacciones celulares y las conversaciones cruzadas a lo largo de las grabaciones de lapso de tiempo, de una manera no invasiva. Esto podría ser fundamental para desentrañar la importancia fisiológica del comportamiento de la microglía y contribuir a una caracterización más profunda de estas células altamente móviles.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean expresar su más sincero agradecimiento al profesor Nicolas Bayens por proporcionar generosamente acceso al microscopio confocal esencial para este estudio. Este trabajo fue financiado en parte por los Fondos para la Investigación Científica (FNRS) bajo los números de subvención F451218F y UG03019F, la Fundación para la Investigación del Alzheimer (SAO-FRA) (a V.W.), A.M. cuenta con el apoyo de una beca de investigación del FNRS. La Figura 1 se creó en biorender.com.
1 L Breeding tanks | Tecniplast | ZB10BTE | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
Bottom glass imaging dish | FluoroDish | FD3510-100 | |
Disposable Graduated transfer pipette | avantor | 16001-188 | |
Dry block heater | Novolab | Grant QBD4 | To keep low melting agarose at 37 °C |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Imaris 10.0 | Oxford Instruments | analysis software | |
Imaris File Converter | Oxford Instruments | https://imaris.oxinst.com/big-data | |
Laser-scanning confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50081 | |
Petri dishes (90 mm) | avantor | 391-0559 | |
Pronase | Sigma-Aldrich | 11459643001 | |
Stainless Steel Forceps Dumont No. 5 | FineScienceTools | 11254-20 | |
Stereo microscope | Leica | Leica M80 | To mount the embryos |
teasing needle | avantor | 76549-024 |