Demonstramos um método que aproveita a microscopia confocal de varredura rápida para realizar imagens ao vivo de células da microglia no tectum óptico do peixe-zebra em desenvolvimento, permitindo a análise da dinâmica dessas células in vivo.
A microglia é uma célula altamente dinâmica e sua migração e colonização do parênquima cerebral é uma etapa crucial para o desenvolvimento e função adequados do cérebro. Os embriões de peixe-zebra em desenvolvimento externo possuem transparência óptica, que, juntamente com linhas repórter transgênicas bem caracterizadas que rotulam fluorescentemente a microglia, tornam o peixe-zebra um modelo de vertebrado ideal para tais estudos. Neste artigo, aproveitamos as características únicas do modelo de peixe-zebra para visualizar a dinâmica das células da microglia in vivo e sob condições fisiológicas. Usamos microscopia confocal para registrar um lapso de tempo de células da microglia no tectum óptico do embrião de peixe-zebra e, em seguida, extraímos dados de rastreamento usando o software IMARIS 10.0 para obter o caminho de migração das células, velocidade média e distribuição no tectum óptico em diferentes estágios de desenvolvimento. Este protocolo pode ser uma ferramenta útil para elucidar o significado fisiológico do comportamento da microglia em vários contextos, contribuindo para uma caracterização mais profunda dessas células altamente móveis.
Como macrófagos residentes no sistema nervoso central (SNC), a microglia representa uma população não neuronal distinta que representa até 15% de todas as células gliais no cérebro adulto. O estudo da biologia da microglia tem ganhado cada vez mais atenção nos últimos anos devido à sua importância estabelecida no desenvolvimento, fisiologia e doença1. Em condições fisiológicas, as células microgliais são altamente dinâmicas, examinando continuamente o parênquima cerebral 2,3. Esse comportamento permite que a micróglia colonize o cérebro e desempenhe papéis fundamentais em seu desenvolvimento, como moldar os circuitos neuronais4, a poda sináptica5 e a vasculogênese6. Além disso, essa natureza dinâmica inerente permite que a microglia monitore constantemente o SNC em busca de sinais de infecção, lesão ou quaisquer desvios da homeostase7. Para dissecar essas intrincadas dinâmicas celulares, imagens ao vivo da microglia no espaço e no tempo são indispensáveis. Felizmente, a transparência óptica de embriões de peixe-zebra em desenvolvimento externo, juntamente com a disponibilidade de linhas repórter transgênicas bem caracterizadas que marcam fluorescentemente a microglia, posiciona o peixe-zebra como um modelo de vertebrado ideal para tais investigações. A imagem ao vivo em embriões de peixe-zebra oferece uma abordagem não invasiva que não requer cirurgia ou manipulação extensa de tecidos, minimizando possíveis perturbações no estado do SNC. Esta é uma consideração crítica ao estudar células microgliais, pois elas são altamente sensíveis até mesmo a mudanças sutis no ambiente extracelular8.
Aqui, fornecemos uma diretriz para rastrear com sucesso os movimentos das células microgliais 3D no embrião de peixe-zebra, permitindo uma visão sem precedentes do comportamento da microglia dentro da arquitetura intacta do parênquima cerebral em desenvolvimento (consulte a Figura 1 para obter uma visão geral gráfica do protocolo). Este protocolo passo a passo detalha como configurar e obter imagens da micróglia do peixe-zebra em diferentes estágios de desenvolvimento e como extrair dados de alta resolução sobre a motilidade das células da microglia para fornecer informações valiosas sobre seus padrões migratórios e respostas a pistas ambientais. Também demonstramos que este protocolo pode ser adaptado para realizar imagens multicoloridas ao vivo, estendendo assim sua aplicabilidade ao estudo da microglia em combinação com linhas transgênicas que marcam células vizinhas, incluindo neurônios3, oligodendrócitos9 e células endoteliais10 (como mostrado na Figura 2). Ao adicionar à caixa de ferramentas que permite observar e caracterizar diretamente a dinâmica do comportamento da microglia em tempo real e em seu ambiente natural, este protocolo provavelmente contribuirá para elucidar melhor a funcionalidade da microglia durante o desenvolvimento inicial, tanto na fisiologia quanto na doença.
O protocolo atual permite imagens in vivo da dinâmica da microglia em um embrião de vertebrado e visualização dos dados de motilidade adquiridos. A colonização da micróglia do cérebro em desenvolvimento ocorre muito cedo durante a embriogênese e precede eventos críticos, como picos de neurogênese, astrogliogênese, oligodendrogênese e muitos outros processos celulares17. Portanto, não é surpreendente que a microglia desempenhe funções importantes na formação de aspectos específicos do desenvolvimento do cérebro18, por exemplo, por meio da regulação da diferenciação, migração e sobrevivência neuronal19 , 20 , 21 , bem como poda sináptica5 e mielinização22 , 23 , 24 .
A contribuição da microglia disfuncional para a patogênese e/ou progressão dos distúrbios do neurodesenvolvimento também está sendo cada vez mais reconhecida25. De fato, a presença precoce de microglia no cérebro em formação expõe essas células a estados fisiológicos distintos26 e mudanças ambientais. Isso pode ter um impacto significativo, uma vez que a microglia são células de vida longa em roedores e humanos, sendo mantidas durante a vida útil por meio da auto-renovação de progenitores locais 27,28,29. Acreditamos que este protocolo pode servir como uma ferramenta poderosa para caracterizar melhor o comportamento da microglia nesses estados fisiológicos distintos, à medida que se desenvolvem, amadurecem e estabelecem sua rede durante as etapas sucessivas da morfogênese cerebral.
Usando a configuração descrita aqui, temos imagens e adquirimos com sucesso dados sobre larvas de peixe-zebra com até 6 dpf. Estender a análise para estágios posteriores de desenvolvimento provavelmente será bem-sucedido, mas exigirá o ajuste da configuração da imagem para levar em consideração o aumento do tamanho da amostra, especialmente ao longo do eixo z. Ao tentar isso, sugerimos focar na manutenção de uma baixa relação sinal-ruído e tempo de varredura rápido, pois são parâmetros-chave para uma análise bem-sucedida.
Sugerimos um tempo mínimo de imagem de 1 h para permitir o rastreamento da microglia; A janela de imagem mais longa que foi testada com este protocolo é de 8 h. Além disso, é importante que a análise de rastreamento mantenha o intervalo de tempo entre os quadros o mais curto possível, idealmente entre 30 s e 60 s. Isso permitirá dados de rastreamento mais precisos e detalhados em análises posteriores. Portanto, especialmente se detectar mais de um fluoróforo, é fundamental evitar a sobreposição espectral e garantir separação suficiente entre os dois espectros de emissão de fluoróforos para permitir uma aquisição simultânea, sem sangramento de sinal.
Outros protocolos para gravação de lapso de tempo de alta qualidade do cérebro do peixe-zebra estão disponíveis30, mas este é o primeiro que mostra como rastrear com sucesso todo o movimento da microglia durante o desenvolvimento embrionário por um período prolongado. Embora o fluxo de trabalho apresentado aqui tenha se concentrado no rastreamento da microglia em um contexto fisiológico, ele pode ser facilmente aplicado à análise da microglia em patologia. De fato, vários modelos de distúrbios do neurodesenvolvimento, como autismo31, epilepsia32 e esquizofrenia33, mas também neurodegeneração34 e câncer35, foram estabelecidos em peixes-zebra que fornecem oportunidades únicas para determinar a resposta e o comportamento microglial em condições de doença.
Notavelmente, este protocolo de rastreamento é altamente versátil e também pode ser fundamental para lançar luz sobre os padrões de migração de vários tipos de células em diversas regiões anatômicas do embrião de peixe-zebra, abrindo assim potencialmente caminhos para aplicações adicionais, além do escopo de investigação microglial descrito neste artigo. Além disso, ao aproveitar a capacidade de combinar várias linhas transgênicas fluorescentes, ganhamos a capacidade de discernir a relação espacial entre a microglia e outros tipos de células do microambiente cerebral, com o potencial de visualizar interações celulares e conversas cruzadas ao longo de gravações de lapso de tempo, de forma não invasiva. Isso pode ser fundamental para desvendar o significado fisiológico do comportamento da microglia e contribuir para uma caracterização mais profunda dessas células altamente móveis.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de expressar sua sincera gratidão ao professor Nicolas Bayens por generosamente fornecer acesso ao microscópio confocal essencial para este estudo. Este trabalho foi financiado em parte pelos Fundos para Pesquisa Científica (FNRS) sob os números de concessão F451218F e UG03019F, a Alzheimer Research Foundation (SAO-FRA) (para VW), AM é apoiado por uma bolsa de pesquisa do FNRS. A Figura 1 foi criada em biorender.com.
1 L Breeding tanks | Tecniplast | ZB10BTE | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
Bottom glass imaging dish | FluoroDish | FD3510-100 | |
Disposable Graduated transfer pipette | avantor | 16001-188 | |
Dry block heater | Novolab | Grant QBD4 | To keep low melting agarose at 37 °C |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Imaris 10.0 | Oxford Instruments | analysis software | |
Imaris File Converter | Oxford Instruments | https://imaris.oxinst.com/big-data | |
Laser-scanning confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50081 | |
Petri dishes (90 mm) | avantor | 391-0559 | |
Pronase | Sigma-Aldrich | 11459643001 | |
Stainless Steel Forceps Dumont No. 5 | FineScienceTools | 11254-20 | |
Stereo microscope | Leica | Leica M80 | To mount the embryos |
teasing needle | avantor | 76549-024 |