التصوير الحي وتوصيف ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في جنين الزرد
Summary
نوضح طريقة تستفيد من الفحص المجهري متحد البؤر للمسح السريع لإجراء تصوير مباشر لخلايا الخلايا الدبقية الصغيرة في القفص البصري لسمك الزرد النامي ، مما يسمح بتحليل ديناميكيات هذه الخلايا في الجسم الحي.
Abstract
الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا ديناميكية للغاية وهجرتها واستعمار حمة الدماغ هي خطوة حاسمة لنمو الدماغ ووظيفته بشكل صحيح. تمتلك أجنة الزرد النامية خارجيا شفافية بصرية ، والتي إلى جانب خطوط مراسل معدلة وراثيا جيدة المواصفات التي تصف الخلايا الدبقية الصغيرة بالفلورسنت ، تجعل الزرد نموذجا مثاليا للفقاريات لمثل هذه الدراسات. في هذه الورقة ، نستفيد من الميزات الفريدة لنموذج الزرد لتصور ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي وتحت الظروف الفسيولوجية. نستخدم الفحص المجهري متحد البؤر لتسجيل الفاصل الزمني لخلايا الخلايا الدبقية الصغيرة في القفص البصري لجنين الزرد ، ثم استخراج بيانات التتبع باستخدام برنامج IMARIS 10.0 للحصول على مسار هجرة الخلايا ومتوسط السرعة والتوزيع في القفص البصري في مراحل النمو المختلفة. يمكن أن يكون هذا البروتوكول أداة مفيدة لتوضيح الأهمية الفسيولوجية لسلوك الخلايا الدبقية الصغيرة في سياقات مختلفة ، مما يساهم في توصيف أعمق لهذه الخلايا شديدة الحركة.
Introduction
باعتبارها بلاعم مقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تمثل الخلايا الدبقية الصغيرة مجموعة متميزة غير عصبية تمثل ما يصل إلى 15٪ من جميع الخلايا الدبقية في الدماغ البالغ. اكتسبت دراسة بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة اهتماما متزايدا في السنوات الأخيرة بسبب أهميتها الراسخة في التنمية وعلم وظائف الأعضاء والمرض1. في ظل الظروف الفسيولوجية ، تكون الخلايا الدبقية الصغيرة ديناميكية للغاية ، وتقوم باستمرار بمسح حمة الدماغ 2,3. يسمح هذا السلوك للخلايا الدبقية الصغيرة باستعمار الدماغ ولعب أدوار محورية في تطوره مثل تشكيل الدوائر العصبية4 ، والتقليم المشبكي5 ، وتكوين الأوعية الدموية6. علاوة على ذلك ، تسمح هذه الطبيعة الديناميكية المتأصلة للخلايا الدبقية الصغيرة بمراقبة الجهاز العصبي المركزي باستمرار بحثا عن علامات العدوى أو الإصابة أو أي انحرافات عن التوازن7. لتشريح ديناميكيات الخلايا المعقدة هذه ، لا غنى عن التصوير الحي للخلايا الدبقية الصغيرة عبر المكان والزمان. لحسن الحظ ، فإن الشفافية البصرية لأجنة الزرد النامية خارجيا ، إلى جانب توفر خطوط مراسلة معدلة وراثيا جيدة المواصفات والتي تصف الخلايا الدبقية الصغيرة بالفلورسنت ، تضع الزرد كنموذج مثالي للفقاريات لمثل هذه التحقيقات. يوفر التصوير الحي في أجنة الزرد نهجا غير جراحي لا يتطلب جراحة أو معالجة واسعة النطاق للأنسجة، مما يقلل من الاضطرابات المحتملة لحالة الجهاز العصبي المركزي. هذا اعتبار حاسم عند دراسة الخلايا الدبقية الصغيرة ، لأنها حساسة للغاية حتى للتغيرات الطفيفة في البيئة خارج الخلية8.
هنا ، نقدم إرشادات لتتبع حركات الخلايا الدبقية الصغيرة 3D بنجاح في جنين الزرد ، مما يسمح برؤية غير مسبوقة لسلوك الخلايا الدبقية الصغيرة داخل البنية السليمة لحمة الدماغ النامية (انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة رسومية للبروتوكول). يوضح هذا البروتوكول خطوة بخطوة كيفية إعداد وتصوير الخلايا الدبقية الصغيرة لأسماك الزرد في مراحل النمو المختلفة وكيفية استخراج بيانات عالية الدقة حول حركة الخلايا الدبقية الصغيرة لتوفير رؤى قيمة حول أنماط هجرتها واستجاباتها للإشارات البيئية. نوضح أيضا أنه يمكن تكييف هذا البروتوكول لإجراء تصوير حي متعدد الألوان ، وبالتالي توسيع نطاق تطبيقه لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة مع الخطوط المعدلة وراثيا التي تميز الخلايا المجاورة ، بما في ذلك الخلايا العصبية3 ، والخلايا قليلة التغصن9 ، والخلايا البطانية10 (كما هو موضح في الشكل 2). من خلال الإضافة إلى صندوق الأدوات الذي يسمح للمرء بمراقبة وتوصيف ديناميكيات سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل مباشر في الوقت الفعلي وفي بيئتها الطبيعية ، من المحتمل أن يساهم هذا البروتوكول في توضيح وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل أفضل أثناء التطور المبكر ، سواء في علم وظائف الأعضاء أو المرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتيح البروتوكول الحالي التصوير في الجسم الحي لديناميات الخلايا الدبقية الصغيرة في جنين الفقاريات وتصور بيانات الحركة المكتسبة. يحدث استعمار الخلايا الدبقية الصغيرة للدماغ النامي في وقت مبكر جدا أثناء التطور الجنيني ويسبق الأحداث الحرجة مثل قمم تكوين الخلايا العصبية ، وتكوين الخلايا النجمية ، وتكوين القلة ، والعديد من العمليات الخلوية الأخرى17. لذلك ليس من المستغرب أن تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة وظائف مهمة في تشكيل جوانب محددة من نمو الدماغ18 ، على سبيل المثال ، من خلال تنظيم التمايز العصبي والهجرة والبقاء على قيد الحياة19،20،21 ، وكذلك التقليم المشبكي5 والميالين22،23،24.
كما يتم التعرف بشكل متزايد على مساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة المختلة وظيفيا في التسبب في اضطرابات النمو العصبي و / أو تطورها25. في الواقع ، فإن الوجود المبكر للخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ المتشكل يعرض هذه الخلايا لحالات فسيولوجية مميزة26 والتغيرات البيئية. يمكن أن يكون لهذا تأثير كبير بالنظر إلى أن الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا طويلة العمر في كل من القوارض والبشر ، ويتم الحفاظ عليها خلال العمر من خلال التجديد الذاتي للأسلاف المحليين27،28،29. نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن أن يكون بمثابة أداة قوية لتوصيف سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل أفضل في هذه الحالات الفسيولوجية المتميزة ، حيث تتطور وتنضج وتؤسس شبكتها خلال الخطوات المتتالية لتشكل الدماغ.
باستخدام الإعداد الموصوف هنا ، نجحنا في تصوير واكتساب بيانات عن يرقات الزرد التي يبلغ عمرها 6 dpf. من المحتمل أن ينجح توسيع نطاق التحليل ليشمل مراحل التطوير اللاحقة ولكنه سيتطلب تعديل إعداد التصوير لمراعاة حجم العينة المتزايد ، خاصة على طول المحور z. عند محاولة ذلك ، نقترح التركيز على الحفاظ على نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة ووقت مسح سريع ، لأنها معلمات أساسية لتحليل ناجح.
نقترح الحد الأدنى من وقت التصوير من 1 ساعة للسماح بتتبع الخلايا الدبقية الصغيرة. أطول نافذة تصوير تم اختبارها باستخدام هذا البروتوكول هي 8 ساعات. علاوة على ذلك ، من المهم أن يحافظ تحليل التتبع على الفاصل الزمني بين الإطارات قصيرا قدر الإمكان ، من الناحية المثالية بين 30 ثانية و 60 ثانية. سيسمح ذلك ببيانات تتبع أكثر دقة وتفصيلا في تحليلات المصب. لذلك ، خاصة في حالة اكتشاف أكثر من فلوروفور واحد ، من الضروري تجنب التداخل الطيفي وضمان الفصل الكافي بين طيفي انبعاث الفلوروفور للسماح باكتساب متزامن ، دون نزيف الإشارة.
تتوفر بروتوكولات أخرى لتسجيل الفاصل الزمني عالي الجودة لدماغ الزرد30 ، ولكن هذا هو البروتوكول الأول الذي يوضح كيفية تتبع جميع حركات الخلايا الدبقية الصغيرة بنجاح أثناء التطور الجنيني على مدى فترة طويلة. على الرغم من أن سير العمل المقدم هنا ركز على تتبع الخلايا الدبقية الصغيرة في سياق فسيولوجي ، إلا أنه يمكن تطبيقه بسهولة على تحليل الخلايا الدبقية الصغيرة في علم الأمراض. في الواقع ، تم إنشاء العديد من نماذج اضطرابات النمو العصبي ، مثل التوحد31 ، والصرع32 ، والفصام33 ، ولكن أيضا التنكس العصبي34 والسرطان35 ، في الزرد التي توفر فرصا فريدة لتحديد الاستجابة والسلوك الدبقي الصغير في حالات المرض.
والجدير بالذكر أن بروتوكول التتبع هذا متعدد الاستخدامات ويمكن أن يكون مفيدا أيضا لإلقاء الضوء على أنماط الهجرة لأنواع مختلفة من الخلايا عبر مناطق تشريحية متنوعة من جنين الزرد ، مما قد يفتح سبلا لتطبيقات إضافية ، خارج نطاق التحقيق الدبقي الصغير الموصوف في هذه المقالة. علاوة على ذلك ، من خلال تسخير القدرة على الجمع بين خطوط محورة وراثيا فلورية متعددة ، نكتسب القدرة على تمييز العلاقة المكانية بين الخلايا الدبقية الصغيرة وأنواع الخلايا الأخرى في البيئة الدقيقة للدماغ ، مع إمكانية تصور التفاعلات الخلوية والمحادثات المتقاطعة عبر تسجيلات الفاصل الزمني ، بطريقة غير جراحية. يمكن أن يكون هذا مفيدا في كشف الأهمية الفسيولوجية لسلوك الخلايا الدبقية الصغيرة والمساهمة في توصيف أعمق لهذه الخلايا شديدة الحركة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يعربوا عن خالص امتنانهم للبروفيسور نيكولاس باينز لتوفيره بسخاء الوصول إلى المجهر متحد البؤر الضروري لهذه الدراسة. تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل صناديق البحث العلمي (FNRS) بموجب أرقام المنح F451218F و UG03019F ، ومؤسسة أبحاث الزهايمر (SAO-FRA) (إلى VW) ، يتم دعم AM من خلال زمالة بحثية من FNRS. تم إنشاء الشكل 1 على biorender.com.
Materials
| 1 L Breeding tanks | Tecniplast | ZB10BTE | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
| Bottom glass imaging dish | FluoroDish | FD3510-100 | |
| Disposable Graduated transfer pipette | avantor | 16001-188 | |
| Dry block heater | Novolab | Grant QBD4 | To keep low melting agarose at 37 °C |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Imaris 10.0 | Oxford Instruments | analysis software | |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | https://imaris.oxinst.com/big-data | |
| Laser-scanning confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50081 | |
| Petri dishes (90 mm) | avantor | 391-0559 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 11459643001 | |
| Stainless Steel Forceps Dumont No. 5 | FineScienceTools | 11254-20 | |
| Stereo microscope | Leica | Leica M80 | To mount the embryos |
| teasing needle | avantor | 76549-024 |
References
- Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. Microglia in physiology and disease. Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Sci Rep. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Marın-Teva, J. L., et al. Microglia promote the death of developing Purkinje cells. Neuron. 41 (4), 535-547 (2004).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Hattori, Y. The microglia-blood vessel interactions in the developing brain. Neurosci Res. 187, 58-66 (2023).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
- Xu, H. -. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
- Shin, J., Park, H. -. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25 (1), 7-14 (2003).
- Chi, N. C., et al. Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation. Genes Dev. 22 (6), 734-739 (2008).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PLoS ONE. 6 (8), e22991 (2011).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), e2093 (2010).
- Ferrero, G., et al. Embryonic microglia derive from primitive macrophages and are replaced by cmyb-dependent definitive microglia in zebrafish. Cell Rep. 24 (1), 130-141 (2018).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia colonization of developing zebrafish midbrain is promoted by apoptotic neuron and lysophosphatidylcholine. Dev Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Dev Neurobiol. 73 (1), 60-71 (2013).
- Thion, M. S., Garel, S. Microglial ontogeny, diversity and neurodevelopmental functions. Curr Opin Genet Dev. 65, 186-194 (2020).
- Bohlen, C. J., Friedman, B. A., Dejanovic, B., Sheng, M. Microglia in brain development, homeostasis, and neurodegeneration. Annu Rev Genet. 53, 263-288 (2019).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Rep. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Green, L. A., O’Dea, M. R., Hoover, C. A., DeSantis, D. F., Smith, C. J. The embryonic zebrafish brain is seeded by a lymphatic-dependent population of mrc1+ microglia precursors. Nat. Neurosci. 25 (7), 849-864 (2022).
- Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nat Neurosci. 23 (9), 1055-1066 (2020).
- Yu, Q., et al. C1q is essential for myelination in the central nervous system (CNS). iScience. 26 (12), 108518 (2023).
- Zengeler, K. E., Lukens, J. R. Innate immunity at the crossroads of healthy brain maturation and neurodevelopmental disorders. Nat Rev Immunol. 21 (7), 454-468 (2021).
- Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Réu, P., et al. The lifespan and turnover of microglia in the human brain. Cell Rep. 20 (4), 779-784 (2017).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat Neurosci. 10 (12), 1544-1553 (2007).
- Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. Visualizing the developing brain in living zebrafish using Brainbow and time-lapse confocal imaging. J Vis Exp. (157), e60593 (2020).
- Tayanloo-Beik, A., et al. Zebrafish modeling of autism spectrum disorders, current status and future prospective. Front Psychiatry. 13, 911770 (2022).
- D’Amora, M., et al. Zebrafish as an innovative tool for epilepsy modeling: State of the art and potential future directions. Int J Mol Sci. 24 (9), 7702 (2023).
- Langova, V., Vales, K., Horacek, J. The role of zebrafish and laboratory rodents in schizophrenia research. Front Psychiatry. 11, 549232 (2020).
- Chia, K., Klingseisen, A., Sieger, D., Priller, J. Zebrafish as a model organism for neurodegenerative disease. Front Mol Neurosci. 15, 940484 (2022).
- Astell, K. R., Sieger, D. Zebrafish in vivo models of cancer and metastasis. Cold Spring Harb Perspect Med. 10 (8), 037077 (2020).
