Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie chez l’embryon de poisson-zèbre

Les poissons-zèbres ont été maintenus dans des conditions standard, selon FELASA42 et institutionnels (Université Libre de Bruxelles, Bruxelles, Belgique ; ULB) directives et règlements. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique pour le bien-être animal de l’ULB (CEBEA) de l’ULB. 1. Élevage du poisson-zèbre et préparation de l’embryon REMARQUE : La lignée transgénique de poisson-zèbre Tg(mpeg1 :eGFP)gl22 qui exprime la protéine eGFP fluorescente dans les macrophages, y compris la microglie, a été utilisée pour générer les données de suivi présentées dans ce protocole. D’autres lignes de rapporteurs de macrophages sont disponibles auprès de ZIRC et peuvent également être utilisées. Dans le choix de la lignée transgénique, il est important de considérer qu’une intensité de signal élevée facilitera l’acquisition d’images et la segmentation cellulaire. Maintenir le poisson-zèbre (Danio rerio) à une température de 28 °C et le gérer conformément aux protocoles établis11. Stimulez l’accouplement en plaçant les poissons femelles et mâles ensemble dans un bassin d’élevage, avec un fond grillagé et un séparateur, en fin d’après-midi avant la date de naissance des embryons souhaités. Retirez le séparateur le lendemain matin pour chronométrer l’accouplement du poisson. Prélevez les ovules fécondés à l’aide d’un filet et transférez-les dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant du milieu E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM de MgSO4) avec 0,01 % de bleu de méthylène. En fonction du patrimoine génétique de la lignée transgénique de poisson-zèbre utilisée, si la formation de pigments doit être inhibée pour faciliter l’imagerie, ajouter 0,003 % de N-phénylthiourée (PTU) au tampon E3 dans lequel les embryons se développent, en commençant 6 heures après la fécondation (hpf) et en actualisant la solution tous les 2 jours jusqu’à ce que le stade de développement souhaité soit atteint.REMARQUE : Pour éviter une longue exposition à la PTU qui pourrait affecter le développement embryonnaire12, il est suggéré d’utiliser, si disponible, une lignée transgénique sur un fond déficient en pigments, comme Casperw2, qui permet une imagerie claire sans avoir besoin d’exposer les embryons à la PTU pendant une période prolongée13. Si les embryons à imager sont inférieurs à 3 jours après la fécondation (dpf), déchorait-les à 24 hpf. À l’aide d’un stéréomicroscope, on peut confirmer que tous les embryons ont été déchoionnés et qu’ils ne sont pas endommagés par le traitement enzymatique (voir étape 1.4.2).Dans le cas d’un nombre limité d’ovules, faites-le manuellement à l’aide d’une pince à dissection fine pour pincer le chorion et tirer vers l’extérieur, en libérant soigneusement chaque embryon de son chorion. Dans le cas d’un nombre plus élevé d’œufs, effectuez la déchorionation enzymatique en incubant les œufs en vrac à température ambiante (RT) dans une solution de Pronase à 1 mg/mL dans un milieu E3 pendant une brève période (généralement 5 à 10 minutes, jusqu’à ce que les chorions s’ouvrent en remuant doucement). Ensuite, la solution de Pronase est jetée et les embryons sont rincés abondamment 3 fois avec de l’E3 frais, pour éliminer tout chorion restant et toute enzyme résiduelle. 2. Montage du poisson zèbre Préparez une solution d’agarose à faible point de fusion à 1 % dans un tampon E3. Refroidissez l’agarose à 37 °C dans un bloc chauffant de paillasse et ajoutez-y une solution de méthanesulfonate de tricaïne fraîchement préparée (160 mg/L), qui aidera à garder les embryons anesthésiés pendant l’imagerie. Vortex la solution pour l’homogénéiser en profondeur. Anesthésier les embryons en ajoutant 160 mg/L de méthanesulfonate de tricaïne dans la boîte de Pétri contenant les embryons dans le tampon E3. Vérifiez que le mouvement s’est arrêté et sélectionnez les embryons de poisson-zèbre avec la fluorescence souhaitée. Vérifiez la santé de l’embryon en visualisant son rythme cardiaque à l’aide d’un stéréomicroscope à fond clair. À l’aide d’une pipette de transfert à pointe large, prélevez un ou jusqu’à trois des embryons sélectionnés et transférez-les sur une plaque d’imagerie en verre inférieure. Sous un stéréomicroscope, utilisez une pipette pour prélever le plus de milieu possible, en faisant attention de ne pas toucher ou endommager les embryons ; Ensuite, remplacez le milieu par la solution d’agarose à 1 % à bas point de fusion préalablement préparée. Ensuite, utilisez une pointe mince en plastique fixée à l’extrémité d’une aiguille de taquinerie pour pousser doucement chaque embryon vers le bas de la plaque d’imagerie, en l’orientant de manière à ce que sa face dorsale soit face au verre pour assurer une bonne vue du tectum optique et une quantité minimale d’agarose à faible fusion entre l’embryon et le verre. Imagez rapidement l’embryon monté à l’aide d’un microscope confocal inversé doté d’un objectif Plan Apo de haute qualité (10x/0,45 Plan Apo ou 20x/0,75 Plan Apo utilisé ici). Si le timelapse dure une période prolongée (plus d’une heure), ajoutez une ou deux gouttes de tampon E3 avec du méthanesulfonate de tricaïne (160 mg/L) sur la plaque d’imagerie en verre inférieure pour empêcher l’agarose à bas point de fusion de sécher excessivement.REMARQUE : Il est crucial d’attendre que l’agarose se solidifie complètement avant d’ajouter un tampon E3 et un média de méthanesulfonate de tricaïne au disque d’imagerie ; Sinon, le poisson pourrait se déplacer lentement latéralement et axialement, provoquant ainsi une dérive de l’échantillon dans le timelapse. Procédez à la configuration de l’acquisition timelapse pour la durée souhaitée : réglez la résolution de l’image sur 1 024 x 1 024, avec une taille de pixel de 0,49 μm. Collectez des coupes optiques par incréments de 2 à 3 μm pour garantir une résolution acceptable sur l’axe z. Dans l’embryon de poisson-zèbre, enfermez le tectum optique dans une pile en Z de 100 à 150 μm, selon le stade de développement utilisé. Pour garantir un suivi réussi des cellules, maintenez l’intervalle de temps entre les images entre 30 s et 60 s. 3. Analyse du suivi et exportation des données Convertissez le fichier timelapse au format IMS à l’aide du logiciel de conversion de fichiers Imaris (voir la table des matériaux). Au lancement du logiciel, faites glisser et déposez les fichiers dans la zone de saisie ou utilisez l’option Ajouter des fichiers… pour les sélectionner manuellement. Dans le menu Sortie , désignez l’emplacement des fichiers convertis, en optant pour le même dossier que les fichiers d’entrée ou en spécifiant un dossier particulier. Assurez-vous que les dimensions de la taille du voxel affichées sont correctes en cliquant sur le bouton Définir la taille du voxel et, une fois la taille du voxel vérifiée, appuyez sur le bouton Démarrer tout pour démarrer la conversion du fichier (voir le fichier supplémentaire 1 pour un guide étape par étape de toute l’analyse des données).REMARQUE : Si le timelapse a été effectué sur deux embryons ou plus en parallèle, le fichier sera automatiquement divisé en positions uniques, séparant chaque embryon en différents fichiers. Il est possible d’utiliser le logiciel en mode batch et de télécharger et convertir plusieurs fichiers en même temps. Les fichiers IMS seront créés et enregistrés dans le dossier de destination sélectionné ou dans le dossier où se trouvent les fichiers d’entrée. Une fois lancé, laissez le logiciel d’analyse démarrer dans l’Arena ; cliquez sur Observer le dossier pour ouvrir le fichier précédemment converti. Une fois le fichier chargé dans le logiciel, utilisez la vue Slice pour faire défiler la pile z, à l’aide du curseur de la barre d’outils Slice située à gauche de la zone d’affichage, et mesurez certains diamètres de cellules en dessinant le diamètre des cellules sélectionnées à l’aide du pointeur. Cliquez et faites glisser la souris pour dessiner un segment couvrant le noyau de la cellule ; observez la longueur du segment dessiné dans la barre d’outils Mesure, située à droite de la zone d’affichage.REMARQUE : En utilisant les paramètres d’imagerie à l’étape 2.5, on peut s’attendre à ce que le diamètre du corps cellulaire soit compris entre 6 μm et 8 μm. Pour détecter automatiquement les cellules, revenez à la vue 3D et cliquez sur l’icône Spot dans la barre d’outils d’objets pour ajouter un nouvel objet Spots dans la liste d’objets et ouvrez l’assistant de création automatique de Spots. Dans la première étape de l’assistant, cochez l’option permettant de segmenter uniquement une région d’intérêt. Ensuite, activez l’option Suivre les points (au fil du temps) pour calculer les données de suivi, ainsi que les statistiques objet-objet pour permettre la comparaison entre les points et élargir la plage de données qui seront disponibles plus tard dans l’analyse. Enfin, procédez dans l’assistant en cliquant sur le bouton Suivant en bas à droite de la fenêtre de l’assistant. Dans la deuxième étape, procédez à la spécification d’une zone de région d’intérêt (ROI) qui entoure le tectum optique de l’embryon. Modifiez la taille du ROI en cliquant et en faisant glisser les petites flèches blanches présentes sur chaque face de celui-ci. Une fois la taille du retour sur investissement définie, étendez-la à toutes les images enregistrées en ajustant l’intervalle de temps. Ensuite, sélectionnez comme Canal source le canal utilisé pour détecter les cellules, et définissez la mesure du diamètre de la cellule, précédemment obtenue à l’étape 3.2, comme Diamètre XY estimé. Activez l’option Soustraction d’arrière-plan et cliquez sur Suivant. À ce stade de l’assistant de création de spots, le logiciel intègre une étape de filtrage de qualité dans laquelle les spots sont filtrés par l’intensité du signal mesurée au centre de chaque spot ; dans le chenal où les taches ont été détectées. Ajustez le seuil d’intensité en saisissant la valeur directement dans le champ de données des cases de seuil inférieur et supérieur ou en faisant glisser les lignes colorées correspondantes dans l’histogramme affiché en bas de l’assistant de création, afin que toutes les cellules soient détectées, y compris celles localisées plus profondément dans le tissu, qui présentent généralement une intensité de signal plus faible. Toutes ces modifications sont visibles simultanément dans la zone d’affichage.REMARQUE : Il est possible d’observer plusieurs points étiquetant une seule cellule à ce stade, mais cela peut être corrigé plus tard dans l’analyse.Dans les timelapses plus longs, si un photoblanchiment est observé, vérifiez la zone d’affichage de plusieurs images avant de définir le seuil pour vous assurer que toutes les cellules sont également détectées dans les images les plus récentes et donc les plus faibles. Une fois satisfait, cliquez sur Suivant pour valider le seuillage de qualité sélectionné. Tous les spots satisfaisant au paramètre de seuillage de qualité et ayant un diamètre correspondant au diamètre XY estimé seront étiquetés comme un spot. Visualisez-le comme un aperçu dans la zone de vue, où les points satisfaisant ces deux paramètres seront superposés au canal source. À l’étape suivante, sélectionnez le mouvement autorégressif comme algorithme de suivi pour suivre les cellules qui ont un mouvement plus ou moins continu. Jugez de la plus longue distance parcourue par une cellule entre deux points temporels en observant attentivement le mouvement des points entre deux images et entrez un nombre estimé dans le champ Distance maximale . Il s’agit de la distance à laquelle un point est autorisé à s’écarter de la position future prévue. Réglez la taille maximale de l’écart sur le nombre minimum de points temporels pendant lesquels le point peut disparaître sans interrompre la piste. Si l’intervalle entre les images est inférieur à 60 s, utilisez une taille de 3. Si l’intervalle de temps entre les images est plus long, augmentez la taille maximale de l’espace autorisée pour réduire la fragmentation de la piste. Activez l’option Remplir les espaces avec tous les objets détectés pour abaisser le seuil de détection près de la position attendue prédite par l’algorithme de suivi et connecter les pistes interrompues par un échec de la détection ponctuelle. Enfin, cliquez sur Suivant et laissez le logiciel générer automatiquement des traces pour tous les spots précédemment générés. Si les traces obtenues semblent trop nombreuses ou fragmentées, retournez dans l’assistant de création, en cliquant sur le bouton Précédent , et ajustez la distance maximale précédemment définie, en augmentant ou en diminuant le nombre jusqu’à ce que la plupart des pistes obtenues soient représentatives des mouvements des cellules.REMARQUE : Le nombre de pistes doit correspondre à peu près au nombre de cellules microgliales, donc compris entre 30 et 50, selon l’âge de l’embryon. Cependant, avant la fin de l’analyse, un nombre plus élevé est attendu en raison de traces erronées. Une fois les traces calculées, le logiciel intègre une étape de filtrage pour filtrer toutes les traces très brèves car elles sont souvent imprécises ou non informatives. Excluez les pistes de moins de 3 à 8 minutes (min) en saisissant la valeur directement dans le champ de données pour la limite inférieure du filtre de durée de piste, ou en faisant glisser les lignes colorées correspondantes dans l’histogramme affiché en bas de l’assistant de création. Cliquez sur Suivant pour valider le filtre et avancer dans l’assistant de création.REMARQUE : Comme mentionné précédemment, en modifiant le seuil de durée maximale (max) et minimale (min) des pistes, il est possible de prévisualiser les pistes qui seront filtrées et exclues de l’analyse. Les pistes filtrées peuvent ensuite être dupliquées dans un nouvel objet pour une analyse plus approfondie. Le seuil de temps exact pour le filtrage peut varier en fonction des résultats de l’étape précédente de l’assistant de création. Nous vous recommandons d’affiner ces paramètres de filtre en examinant l’aperçu dans la zone d’affichage pour des résultats optimaux. Étant donné que la lignée transgénique Tg(mpeg1 :eGFP) marque tous les phagocytes mononucléaires, les macrophages cutanés en plus de la microglie seront également détectés dans les films timelapse. Supprimer manuellement les traces générées à partir des macrophages cutanés de l’analyse pour se concentrer sur la microglie parenchymateuse cérébrale (Figure 3). Corrigez manuellement d’autres erreurs potentielles dans les pistes dans l’éditeur de pistes, où chaque point de données est affiché comme un objet dans la piste. Activez le bouton de sélection de cercle à droite de la zone d’affichage et mettez en évidence les pistes qui nécessitent des modifications ou des ajustements. Une fois la piste problématique sélectionnée, à l’aide des boutons de connexion et de déconnexion, modifiez-la pour représenter correctement les mouvements de la cellule. Utilisez l’éditeur de pistes pour sélectionner et supprimer également des points uniques dupliqués ou de petits fragments de piste qui représentent par erreur la même cellule en les sélectionnant avec le mode de sélection circulaire et en appuyant sur Canc ou Suppr pour les éliminer.REMARQUE : Si les paramètres du suivi sont corrects, cette étape ne doit être requise que pour un petit pourcentage des cellules suivies. Si la ligne rapporteure de la microglie est utilisée en combinaison avec des transgéniques fluorescents marquant d’autres types de cellules dans le parenchyme, effectuez la segmentation en tant que nouvel objet de surface ou objet ponctuel pour les visualiser. Pour ce faire, répétez les étapes ci-dessus (des étapes 3.2 à 3.14), en modifiant l’entrée du canal source à l’étape 3.5, pour qu’elle soit celle utilisée pour imager la deuxième population de cellules, et en prenant soin d’adapter les paramètres descriptifs spécifiques aux cellules d’intérêt tels que le diamètre XY estimé (étape 3.5), la distance maximale (étape 3.8) à la nouvelle population de cellules. D’autres étapes peuvent être répétées sans modifications.REMARQUE : Dans le cas d’une nouvelle création de surface, le diamètre XY estimé est remplacé par une option de seuillage basée sur la soustraction d’arrière-plan, où l’entrée à donner est le diamètre de la plus grande sphère qui s’insère dans l’objet. Cette valeur peut être estimée à partir de la vue Tranche à l’aide de la barre d’outils Mesurer , comme expliqué à l’étape 3.2. Une fois satisfait des traces obtenues, extrayez les statistiques de suivi souhaitées depuis l’onglet Statistiques . En cliquant sur le bouton des paramètres , sélectionnez les statistiques à calculer pour chaque objet ponctuel ou objet de surface précédemment créé. Si plusieurs objets ont été créés dans la même analyse, deux objets ponctuels ou un objet ponctuel et un objet surface, les statistiques décrivant la position relative d’un objet par rapport à l’autre, telles que la distance la plus courte entre les deux, seront également disponibles pour l’exportation.REMARQUE : Toutes les valeurs souhaitées peuvent être des valeurs spécifiques ou moyennes, et toutes les données brutes sont téléchargeables sous forme de fichier CSV (Comma Separated Values) à l’aide des boutons situés en bas de l’onglet Statistiques . À condition que l’analyse inclue également d’autres types de cellules, des statistiques supplémentaires sur la distance relative d’un objet par rapport à l’autre seront également disponibles.