Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia nell'embrione di zebrafish

I pesci zebra sono stati mantenuti in condizioni standard, secondo FELASA42 e istituzionali (Université Libre de Bruxelles, Bruxelles, Belgio; ULB) linee guida e regolamenti. Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico per il Benessere Animale (CEBEA) dell’ULB. 1. Allevamento del pesce zebra e preparazione degli embrioni NOTA: La linea transgenica di zebrafish Tg(mpeg1:eGFP)gl22 che esprime la proteina fluorescente eGFP nei macrofagi, inclusa la microglia, è stata utilizzata per generare i dati di tracciamento mostrati in questo protocollo. Altre linee di reporter per macrofagi sono disponibili presso ZIRC e possono essere utilizzate. Nella scelta della linea transgenica, è importante considerare che un’elevata intensità del segnale faciliterà l’acquisizione dell’immagine e la segmentazione cellulare. Mantenere il pesce zebra (Danio rerio) a una temperatura di 28 °C e gestirlo secondo i protocolli stabiliti11. Stimolare l’accoppiamento mettendo insieme pesci femmina e maschio in una vasca di riproduzione, con fondo a rete e separatore, nel tardo pomeriggio prima della data di nascita degli embrioni desiderati. Rimuovere il separatore la mattina seguente per programmare l’accoppiamento dei pesci. Raccogliere gli ovuli fecondati utilizzando una rete e trasferirli in una piastra di Petri da 100 mm contenente terreno E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) con 0,01% di blu di metilene. A seconda del background genetico della linea transgenica di pesce zebra utilizzata, se la formazione del pigmento deve essere inibita per facilitare l’imaging, aggiungere lo 0,003% di N-feniltiourea (PTU) al tampone E3 in cui si stanno sviluppando gli embrioni, a partire da 6 ore dopo la fecondazione (hpf) e rinfrescando la soluzione ogni 2 giorni fino al raggiungimento dello stadio di sviluppo desiderato.NOTA: Per evitare una lunga esposizione alla PTU che potrebbe influenzare lo sviluppo embrionale12, si suggerisce di utilizzare, se disponibile, una linea transgenica su uno sfondo carente di pigmento, come Casperw2, che consenta un imaging chiaro senza la necessità di esporre gli embrioni alla PTU per un lungo periodo di tempo13. Se gli embrioni da sottoporre a imaging sono più giovani di 3 giorni dopo la fecondazione (dpf), decorionarli a 24 hpf. Utilizzare uno stereomicroscopio per confermare che tutti gli embrioni sono stati dechorionati e non sono stati danneggiati dal trattamento enzimatico (vedere passaggio 1.4.2).In caso di un numero limitato di ovuli, farlo manualmente utilizzando una pinza da dissezione fine per pizzicare il corion e tirarlo verso l’esterno, rilasciando con cura ogni embrione dal suo chorion. In caso di un numero maggiore di uova, eseguire la decorionazione enzimaticamente incubando le uova alla rinfusa a temperatura ambiente (RT) in una soluzione di pronasi da 1 mg/mL in terreno E3 per un breve periodo (tipicamente 5-10 minuti, fino a quando i corioni non si aprono sotto un leggero fruscio). Successivamente, la soluzione di pronasi viene scartata e gli embrioni vengono sciacquati accuratamente 3 volte con E3 fresco, per rimuovere il corion rimanente e l’enzima residuo. 2. Montaggio del pesce zebra Preparare una soluzione di agarosio a basso punto di fusione all’1% in tampone E3. Raffreddare l’agarosio a 37 °C in un blocco riscaldante da banco e aggiungere una soluzione di tricaina metansolfonato appena preparata (160 mg/L), che aiuterà a mantenere gli embrioni anestetizzati durante l’imaging. Agitare la soluzione per omogeneizzarla completamente. Anestetizzare gli embrioni aggiungendo 160 mg/L di tricaina metansolfonato alla piastra di Petri contenente gli embrioni nel tampone E3. Verificare che il movimento si sia fermato e selezionare gli embrioni di zebrafish con la fluorescenza desiderata. Controlla la salute dell’embrione visualizzando il suo battito cardiaco utilizzando uno stereomicroscopio a campo chiaro. Utilizzando una pipetta di trasferimento a punta larga, prelevare uno o fino a tre degli embrioni selezionati e trasferirli su una piastra di imaging in vetro inferiore. Sotto uno stereomicroscopio, utilizzare una pipetta per rimuovere quanto più terreno possibile, facendo attenzione a non toccare o danneggiare gli embrioni; Quindi, sostituire il terreno con la soluzione di agarosio a basso punto di fusione all’1% precedentemente preparata. Quindi, utilizzare una punta di plastica sottile e affusolata fissata all’estremità di un ago per stuzzicare per spingere delicatamente ogni embrione sul fondo della piastra di imaging, orientandolo in modo che il suo lato dorsale sia rivolto verso il vetro per garantire una buona visione del tectum ottico e una quantità minima di agarosio a basso punto di fusione tra l’embrione e il vetro. Fotografare prontamente l’embrione montato utilizzando un microscopio confocale invertito dotato di un obiettivo Plan Apo di alta qualità (10x/0,45 Plan Apo o 20x/0,75 Plan Apo utilizzato qui). Se il timelapse durerà per un periodo prolungato (più di un’ora), aggiungere una o due gocce di tampone E3 con tricaina metansolfonato (160 mg/L) alla piastra di imaging in vetro inferiore per evitare che l’agarosio a basso punto di fusione si asciughi eccessivamente.NOTA: È fondamentale attendere che l’agarosio si solidifichi completamente prima di aggiungere il tampone E3 e il terreno di tricaina metansolfonato al disco di imaging; In caso contrario, il pesce potrebbe muoversi lentamente lateralmente e assialmente, causando così una deriva del campione nel timelapse. Procedere con l’impostazione dell’acquisizione timelapse per il tempo desiderato: impostare la risoluzione dell’immagine su 1.024 x 1.024, con una dimensione dei pixel di 0,49 μm. Raccogli le fette ottiche con incrementi di 2-3 μm per garantire una risoluzione accettabile sull’asse z. Nell’embrione di zebrafish, racchiudere il tectum ottico in uno z-stack di 100-150 μm, a seconda dello stadio di sviluppo utilizzato. Per garantire il corretto tracciamento delle celle, mantenere l’intervallo di tempo tra i fotogrammi tra 30 s e 60 s. 3. Analisi del tracciamento ed esportazione dei dati Converti il file timelapse in formato IMS utilizzando il software di conversione file Imaris (vedi Tabella dei materiali). All’avvio del software, trascinare e rilasciare i file nell’area di input o utilizzare il pulsante Aggiungi file… per selezionarli manualmente. Nel menu Output , specificare la posizione per i file convertiti, scegliendo la stessa cartella dei file di input o specificando una cartella specifica. Assicurati che le dimensioni della dimensione del voxel visualizzata siano corrette facendo clic sul pulsante Imposta dimensione voxel e, una volta verificata la dimensione del voxel, premi il pulsante Avvia tutto per avviare la conversione del file (vedi File supplementare 1 per una guida passo passo di tutta l’analisi dei dati).NOTA: Se il timelapse è stato eseguito su due o più embrioni in parallelo, il file verrà automaticamente diviso in singole posizioni, separando ogni embrione in file diversi. È possibile utilizzare il software in modalità batch e caricare e convertire più file contemporaneamente. I file IMS verranno creati e salvati nella cartella di destinazione selezionata o nella cartella in cui si trovano i file di input. Una volta avviato, lascia che il software di analisi si avvii nell’Arena; fare clic su Osserva cartella per aprire il file precedentemente convertito. Una volta caricato il file nel software, utilizzare la vista Slice per scorrere lo z-stack, utilizzando il cursore nella barra degli strumenti Slice situato a sinistra dell’area di visualizzazione, e misurare alcuni diametri delle celle disegnando il diametro delle celle selezionate utilizzando il puntatore. Fare clic e trascinare il mouse per disegnare un segmento che attraversa il nucleo della cella; osservare la lunghezza del segmento disegnato nella barra degli strumenti Misura, situata a destra dell’area di visualizzazione.NOTA: Utilizzando le impostazioni di imaging al punto 2.5, il diametro del corpo cellulare può essere compreso tra 6 μm e 8 μm. Per rilevare automaticamente le celle, torna alla vista 3D e fai clic sull’icona spot nella barra degli strumenti degli oggetti per aggiungere un nuovo oggetto Spots nell’elenco degli oggetti e aprire la procedura guidata di creazione automatica delle Spot. Nel primo passaggio della procedura guidata, selezionare l’opzione per segmentare solo una regione di interesse. Quindi, abilita l’opzione Traccia punti (nel tempo) per calcolare i dati di tracciamento, nonché le statistiche oggetto-oggetto per consentire il confronto tra i punti e ampliare la gamma di dati che saranno disponibili più avanti nell’analisi. Infine, procedi nella procedura guidata facendo clic sul pulsante Avanti in basso a destra nella finestra della procedura guidata. Nella seconda fase, procedere alla specifica di un’area della regione di interesse (ROI) che racchiude il tectum ottico dell’embrione. Modifica la dimensione del ROI facendo clic e trascinando le piccole frecce bianche presenti su ciascuna faccia di esso. Una volta definita la dimensione del ROI, estendila a tutti i fotogrammi registrati regolando l’intervallo di tempo. Quindi, selezionare come Canale sorgente il canale utilizzato per rilevare le celle, e impostare la misura del diametro della cella, precedentemente ottenuta nel passaggio 3.2, come Diametro XY stimato. Abilita l’opzione Sottrazione sfondo e fai clic su Avanti. A questo punto della procedura guidata di creazione degli spot, il software incorpora un passaggio di filtraggio di qualità in cui gli spot vengono filtrati in base all’intensità del segnale misurata al centro di ogni spot; nel canale in cui sono state rilevate le macchie. Regolare la soglia di intensità inserendo il valore direttamente nel campo dati per le caselle di soglia inferiore e superiore o trascinando le linee colorate corrispondenti nell’istogramma mostrato nella parte inferiore della procedura guidata di creazione, in modo che vengano rilevate tutte le cellule, comprese quelle localizzate più in profondità nel tessuto, che di solito mostrano un’intensità del segnale inferiore. Tutte queste modifiche sono visibili contemporaneamente nell’Area di visualizzazione.NOTA: A questo punto è possibile osservare più punti che etichettano una singola cella, ma questo può essere corretto in seguito nell’analisi.Nei timelapse più lunghi, se si nota un po’ di fotosbiancamento, controllare l’area di visualizzazione di più fotogrammi prima di impostare la soglia per assicurarsi che tutte le celle vengano rilevate anche nei fotogrammi più recenti e quindi più deboli. Una volta soddisfatto, fare clic su Avanti per convalidare la soglia di qualità selezionata. Tutti gli spot che soddisfano il parametro di soglia di qualità e che hanno un diametro corrispondente al diametro XY stimato verranno etichettati come spot. Visualizzatela come un’anteprima nell’Area di Visualizzazione, dove gli spot che soddisfano questi due parametri saranno sovrapposti al Canale Sorgente. Nel passaggio successivo, selezionare il Movimento autoregressivo come algoritmo di tracciamento per tracciare le celle che hanno un movimento più o meno continuo. Valuta la distanza massima che una cella percorre tra due punti temporali osservando attentamente il movimento dei punti tra due fotogrammi e inserisci un numero stimato nel campo Distanza massima . Questa è la distanza alla quale un punto può deviare dalla posizione futura prevista. Impostare la dimensione massima dello spazio sul numero minimo di punti temporali in cui il punto può scomparire senza interrompere la traccia. Se l’intervallo tra i fotogrammi è inferiore a 60 s, utilizzare una dimensione di 3. Se l’intervallo di tempo tra i fotogrammi è più lungo, aumentate la dimensione massima consentita per ridurre la frammentazione della traccia. Abilitare l’opzione Riempi gli spazi vuoti con tutti gli oggetti rilevati per abbassare la soglia di rilevamento vicino alla posizione prevista dall’algoritmo di tracciamento e collegare le tracce interrotte da un errore del rilevamento spot. Infine, fai clic su Avanti e lascia che il software generi automaticamente le tracce per tutti gli spot generati in precedenza. Se le tracce ottenute appaiono troppo numerose o frammentate, tornare indietro nella procedura guidata di creazione, cliccando sul pulsante Precedente , e regolare la distanza massima precedentemente definita, aumentando o diminuendo il numero fino a quando la maggior parte delle tracce ottenute non sono rappresentative dei movimenti della cella.NOTA: Il numero di tracce dovrebbe corrispondere all’incirca al numero di cellule della microglia, quindi variare tra 30 e 50, a seconda dell’età dell’embrione. Tuttavia, prima del completamento dell’analisi, si prevede un numero più elevato a causa di tracce errate. Una volta calcolate le tracce, il software incorpora un passaggio di filtraggio per filtrare tutte le tracce molto brevi in quanto spesso imprecise o non informative. Escludere le tracce di durata inferiore a 3-8 minuti (min) inserendo il valore direttamente nel campo dati per il limite inferiore del filtro di durata della traccia o trascinando le linee colorate corrispondenti nell’istogramma visualizzato nella parte inferiore della procedura guidata di creazione. Fare clic su Avanti per convalidare il filtro e procedere con la procedura guidata di creazione.NOTA: Come accennato in precedenza, modificando la soglia di durata massima (max) e minima (min) della traccia, è possibile visualizzare in anteprima le tracce che verranno filtrate ed escluse dall’analisi. Le tracce filtrate possono quindi essere duplicate in un nuovo oggetto per ulteriori analisi. La soglia di tempo esatta per il filtro può variare in base ai risultati del passaggio precedente della procedura guidata di creazione . Si consiglia di ottimizzare queste impostazioni del filtro esaminando l’anteprima nell’area di visualizzazione per ottenere risultati ottimali. Poiché la linea transgenica Tg(mpeg1:eGFP) marcasce tutti i fagociti mononucleati, i macrofagi cutanei oltre alla microglia saranno rilevati anche nei filmati timelapse. Rimuovere manualmente le tracce generate dai macrofagi cutanei dall’analisi per concentrarsi sulla microglia parenchimale cerebrale (Figura 3). Correggi manualmente altri potenziali errori nelle tracce nell’editor delle tracce, in cui ogni punto dati viene visualizzato come un oggetto nella traccia. Attiva il pulsante circolare di selezione della modalità a destra dell’area di visualizzazione ed evidenzia le tracce che richiedono modifiche o regolazioni. Una volta selezionata la traccia problematica, utilizzando i pulsanti di connessione e disconnessione , modificarla per rappresentare correttamente i movimenti della cella. Utilizzare l’editor di tracce per selezionare ed eliminare anche singoli punti duplicati o piccoli frammenti di traccia che rappresentano erroneamente la stessa cella, selezionandoli con la modalità di selezione del cerchio e premendo Canc o Canc per eliminarli.NOTA: Se le impostazioni del tracciamento sono corrette, questo passaggio dovrebbe essere necessario solo per una piccola percentuale delle celle tracciate. Se la linea reporter della microglia viene utilizzata in combinazione con transgenici fluorescenti che marcano altri tipi di cellule nel parenchima, eseguire la segmentazione come un nuovo oggetto di superficie o un oggetto spot per visualizzarli. Per fare ciò, ripetere i passaggi precedenti (dai passaggi 3.2 a 3.14), modificando l’input del canale sorgente nel passaggio 3.5, in modo che sia quello utilizzato per visualizzare la seconda popolazione cellulare, e avendo cura di adattare i parametri descrittivi specifici delle celle di interesse come il diametro XY stimato (passaggio 3.5), la distanza massima (passaggio 3.8) alla nuova popolazione cellulare. Altri passaggi possono essere ripetuti senza modifiche.NOTA: Nel caso di una nuova creazione di superficie, il diametro XY stimato viene sostituito da un’opzione di soglia basata sulla sottrazione dello sfondo, in cui l’input da fornire è il diametro della sfera più grande che si adatta all’oggetto. Questo valore può essere stimato dalla vista Sezione utilizzando la barra degli strumenti Misura , come illustrato nel passaggio 3.2. Una volta soddisfatti delle tracce ottenute, estrai le statistiche di tracciamento desiderate dalla scheda Statistica . Cliccando sul pulsante delle impostazioni , selezionare quali statistiche verranno calcolate per ogni oggetto punto o oggetto superficie precedentemente creato. Nel caso in cui siano stati creati più oggetti nella stessa analisi, due oggetti punto o un oggetto punto e un oggetto superficie, saranno disponibili per l’esportazione anche le statistiche che descrivono la posizione relativa di un oggetto rispetto all’altro, come la distanza più breve tra i due.NOTA: Tutti i valori desiderati possono essere valori specifici o medi e tutti i dati grezzi sono scaricabili come file CSV (Comma Separated Values) utilizzando i pulsanti nella parte inferiore della scheda Statistiche . A condizione che l’analisi includa anche altri tipi di celle, saranno disponibili anche ulteriori statistiche sulla distanza relativa di un oggetto dall’altro.