Live beeldvorming en karakterisering van de dynamiek van microglia in het zebravisembryo

Zebravissen werden onder standaardomstandigheden gehouden, volgens FELASA42 en institutionele (Université Libre de Bruxelles, Brussel, België; ULB) richtlijnen en reglementen. Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het Ethisch Comité voor Dierenwelzijn (CEBEA) van de ULB van de ULB. 1. Kweek van zebravissen en voorbereiding van embryo’s OPMERKING: De transgene lijn Tg(mpeg1:eGFP)gl22 van de zebravis die het fluorescerende eGFP-eiwit tot expressie brengt in macrofagen, waaronder microglia, werd gebruikt om de volggegevens te genereren die in dit protocol worden weergegeven. Andere macrofaag reporter lijnen zijn verkrijgbaar bij ZIRC en kunnen ook gebruikt worden. Bij het kiezen van de transgene lijn is het belangrijk om te bedenken dat een hoge signaalintensiteit de beeldacquisitie en celsegmentatie zal vergemakkelijken. Houd de zebravis (Danio rerio) op een temperatuur van 28 °C en beheer ze volgens de vastgestelde protocollen11. Stimuleer de paring door vrouwelijke en mannelijke vissen in de late namiddag voor de geboortedatum van de gewenste embryo’s samen in een kweekbak te plaatsen, met een gaasbodem en een scheider. Verwijder de separator de volgende ochtend om het paren van de vissen te timen. Verzamel de bevruchte eieren met behulp van een gaas en breng ze over naar een petrischaal van 100 mm met E3-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) met 0,01% methyleenblauw. Afhankelijk van de genetische achtergrond van de gebruikte transgene lijn van de zebravis, als de pigmentvorming moet worden geremd om beeldvorming te vergemakkelijken, voeg dan 0,003% N-fenylthiourea (PTU) toe aan de E3-buffer waarin embryo’s zich ontwikkelen, beginnend 6 uur na de bevruchting (hpf) en ververs de oplossing elke 2 dagen totdat het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt.OPMERKING: Om langdurige blootstelling aan PTU te voorkomen die de embryonale ontwikkeling zou kunnen beïnvloeden12, wordt aangeraden om, indien beschikbaar, een transgene lijn te gebruiken op een pigmentdeficiënte achtergrond, zoals Casperw2, die een heldere beeldvorming mogelijk maakt zonder de noodzaak om embryo’s gedurende een langere periode aan PTU bloot te stellen13. Als de af te beelden embryo’s jonger zijn dan 3 dagen na de bevruchting (dpf), dechorioneer ze dan bij 24 hpf. Gebruik een stereomicroscoop om te bevestigen dat alle embryo’s zijn gedechorioneerd en onbeschadigd zijn door de enzymatische behandeling (zie stap 1.4.2).In het geval van een beperkt aantal eieren, doe dit dan handmatig door met een fijne ontleedtang het chorion samen te knijpen en naar buiten te trekken, waarbij elk embryo voorzichtig uit zijn chorion wordt losgemaakt. In het geval van een groter aantal eieren, voer de dechorionatie enzymatisch uit door de eieren in bulk bij kamertemperatuur (RT) uit te broeden in een 1 mg/ml Pronase-oplossing in E3-medium gedurende een korte periode (meestal 5-10 minuten, totdat de chorionen openbreken onder zachtjes zwiepen). Vervolgens wordt de Pronase-oplossing weggegooid en worden de embryo’s 3x grondig gespoeld met verse E3 om eventueel achtergebleven chorion en resterend enzym te verwijderen. 2. Zebravis montage Bereid een agarose-oplossing met een laag smeltpercentage van 1% in E3-buffer. Koel de agarose af tot 37 °C in een tafelverwarmingsblok en voeg vers gemaakte Tricaïne-methaansulfonaatoplossing (160 mg/L) toe, waardoor de embryo’s tijdens de beeldvorming verdoofd blijven. Draai de oplossing om het grondig te homogeniseren. Verdoof de embryo’s door 160 mg/L Tricaïne methaansulfonaat toe te voegen aan de petrischaal met de embryo’s in E3-buffer. Controleer of de beweging is gestopt en selecteer de zebravisembryo’s met de gewenste fluorescentie. Controleer de gezondheid van het embryo door de hartslag te visualiseren met behulp van een helderveldstereomicroscoop. Gebruik een transferpipet met brede punt om één of maximaal drie van de geselecteerde embryo’s op te zuigen en over te brengen naar een glazen beeldvormingsplaat aan de onderkant. Gebruik onder een stereomicroscoop een pipet om zoveel mogelijk medium te verwijderen en zorg ervoor dat u de embryo’s niet aanraakt of beschadigt; Vervang vervolgens het medium door de eerder bereide 1% laagsmeltende agarose-oplossing. Gebruik vervolgens een plastic dunne, taps toelopende punt die aan het uiteinde van een plagernaald is bevestigd om elk embryo voorzichtig naar de bodem van de beeldvormingsplaat te duwen en het zo te oriënteren dat de dorsale zijde naar het glas is gericht om een goed zicht op het optische tectum en een minimale hoeveelheid agarose met een laag smeltpunt tussen het embryo en het glas te garanderen. Stel het gemonteerde embryo onmiddellijk in beeld met behulp van een omgekeerde confocale microscoop met een hoogwaardig Plan Apo-objectief (10x/0.45 Plan Apo of een 20x/0.75 Plan Apo die hier wordt gebruikt). Als de timelapse gedurende een langere periode (meer dan een uur) wordt uitgevoerd, voeg dan een of twee druppels E3-buffer met tricaïnemethaansulfonaat (160 mg/l) toe aan de onderste glazen beeldvormingsplaat om te voorkomen dat de agarose met een laag smeltpunt te veel uitdroogt.OPMERKING: Het is van cruciaal belang om te wachten tot de agarose volledig is gestold voordat u E3-buffer en tricaïne-methaansulfonaatmedia aan de beeldvormingsschijf toevoegt; Anders zou de vis langzaam lateraal en axiaal kunnen bewegen, waardoor een monsterdrift in de timelapse ontstaat. Ga verder met het instellen van de timelapse-acquisitie voor de gewenste tijd: stel de beeldresolutie in op 1.024 x 1.024, met een pixelgrootte van 0,49 μm. Verzamel optische plakjes in stappen van 2-3 μm om een acceptabele resolutie op de z-as te garanderen. In het zebravisembryo omsluit u het optische tectum in een z-stack van 100-150 μm, afhankelijk van het gebruikte ontwikkelingsstadium. Om een succesvolle celtracering te garanderen, houdt u het tijdsinterval tussen frames tussen 30 s en 60 s. 3. Tracking-analyse en gegevensexport Converteer het timelapse-bestand naar IMS-indeling met behulp van de Imaris-bestandsconversiesoftware (zie Materiaaltabel). Bij het starten van de software sleept u de bestanden naar het invoergebied of gebruikt u de knop Bestanden toevoegen… knop om ze handmatig te selecteren. Geef in het menu Uitvoer de locatie aan voor de geconverteerde bestanden, kies voor dezelfde map als de invoerbestanden of geef een bepaalde map op. Zorg ervoor dat de afmetingen van de weergegeven voxelgrootte correct zijn door op de knop Voxelgrootte instellen te klikken en zodra de voxelgrootte is geverifieerd, drukt u op de knop Alles starten om de bestandsconversie te starten (zie Aanvullend bestand 1 voor een stapsgewijze handleiding van alle gegevensanalyse).OPMERKING: Als de timelapse parallel op twee of meer embryo’s is uitgevoerd, wordt het bestand automatisch opgesplitst in enkele posities, waarbij elk embryo in verschillende bestanden wordt gescheiden. Het is mogelijk om de software in batchmodus te gebruiken en meerdere bestanden tegelijkertijd te uploaden en te converteren. IMS-bestanden worden gemaakt en opgeslagen in de geselecteerde doelmap of de map waarin de invoerbestanden zich bevinden. Eenmaal gestart, laat je de analysesoftware starten in de Arena; klik op Map observeren om het eerder geconverteerde bestand te openen. Zodra het bestand in de software is geladen, gebruikt u de Slice-weergave om door de z-stapel te scrollen, met behulp van de schuifregelaar in de Slice-werkbalk aan de linkerkant van het weergavegebied, en meet u enkele celdiameters door de diameter van de geselecteerde cellen te tekenen met de aanwijzer. Klik en sleep met de muis om een segment te tekenen dat de celkern overspant; let op de lengte van het segment dat is getekend in de werkbalk Meten, die zich rechts van het weergavegebied bevindt.OPMERKING: Met behulp van de beeldvormingsinstellingen in stap 2.5 kan worden verwacht dat de diameter van het cellichaam tussen 6 μm en 8 μm ligt. Als u de cellen automatisch wilt detecteren, gaat u terug naar de 3D-weergave en klikt u op het spotpictogram in de objectwerkbalk om een nieuw Spots-object toe te voegen aan de objectlijst en opent u de wizard voor het automatisch maken van Spots. Vink in de eerste stap van de wizard de optie aan om alleen een interessegebied te segmenteren. Schakel vervolgens de optie Hotspots volgen (in de loop van de tijd) in om de trackinggegevens te berekenen, evenals de Object-objectstatistieken om vergelijking tussen spots mogelijk te maken en het bereik van gegevens uit te breiden die later in de analyse beschikbaar zullen zijn. Ga ten slotte verder in de wizard door op de knop Volgende rechtsonder in het wizardvenster te klikken. Ga in de tweede stap verder met het specificeren van een interessegebied (ROI) dat het optische tectum van het embryo omsluit. Wijzig de grootte van de ROI door op de kleine witte pijlen op elke zijde ervan te klikken en deze te slepen. Zodra de ROI-grootte is gedefinieerd, breidt u deze uit naar alle opgenomen frames door het tijdsinterval aan te passen. Selecteer vervolgens als bronkanaal het kanaal dat wordt gebruikt om de cellen te detecteren en stel de celdiametermeting, eerder verkregen in stap 3.2, in als de geschatte XY-diameter. Schakel de optie Achtergrond aftrekken in en klik op Volgende. Op dit punt in de wizard voor het maken van spots bevat de software een kwaliteitsfilterstap waarin spots worden gefilterd op basis van de signaalintensiteit die in het midden van elke spot wordt gemeten; in het kanaal waar de vlekken zijn gedetecteerd. Pas de intensiteitsdrempel aan door de waarde rechtstreeks in het gegevensveld voor de onderste en bovenste drempelvakken in te voeren of door de corresponderende gekleurde lijnen in het histogram te slepen dat onder aan de creatiewizard wordt weergegeven, zodat alle cellen worden gedetecteerd, inclusief de cellen die dieper in het weefsel zijn gelokaliseerd en die meestal een lagere signaalintensiteit vertonen. Al deze wijzigingen zijn tegelijkertijd zichtbaar in het weergavegebied.OPMERKING: Het is mogelijk om op dit punt meerdere vlekken te observeren die een enkele cel labelen, maar dit kan later in de analyse worden gecorrigeerd.Als er bij langere time-lapses wat fotobleking wordt gezien, controleert u het weergavegebied van meerdere frames voordat u de drempel instelt om er zeker van te zijn dat alle cellen ook worden gedetecteerd in de meest recente en dus zwakkere frames. Als u tevreden bent, klikt u op Volgende om de geselecteerde kwaliteitsdrempel te valideren. Alle spots die voldoen aan de parameter voor kwaliteitsdrempels en een diameter hebben die overeenkomt met de geschatte XY-diameter, worden gelabeld als een spot. Visualiseer dit als een voorbeeld in het weergavegebied, waar plekken die aan deze twee parameters voldoen, over het bronkanaal worden gelegd. Selecteer in de volgende stap de Autoregressieve beweging als het volgalgoritme om cellen te volgen die een min of meer continue beweging hebben. Beoordeel de langste afstand die een cel tussen twee tijdstippen aflegt door de beweging van de vlekken tussen twee frames zorgvuldig te observeren en een geschat getal in te voeren in het veld Maximale afstand . Dit is de afstand die een plek mag afwijken van de voorspelde toekomstige positie. Stel de maximale tussenruimtegrootte in op het minste aantal tijdstippen waarop de plek mag verdwijnen zonder de baan te onderbreken. Als het interval tussen de frames minder dan 60 s is, gebruik dan een maat van 3. Als het tijdsinterval tussen de frames langer is, vergroot dan de maximaal toegestane tussenruimte om spoorfragmentatie te verminderen. Schakel de optie Gaten opvullen met alle gedetecteerde objecten in om de detectiedrempel te verlagen tot dicht bij de verwachte positie die wordt voorspeld door het volgalgoritme en om sporen te verbinden die worden onderbroken door een storing in de spotdetectie. Klik ten slotte op Volgende en laat de software automatisch tracks genereren voor alle eerder gegenereerde spots. Als de verkregen sporen te talrijk of gefragmenteerd lijken te zijn, ga dan terug in de creatiewizard, door op de knop Vorige te klikken, en pas de eerder gedefinieerde maximale afstand aan, waarbij u het aantal verhoogt of verlaagt totdat de meeste van de verkregen sporen representatief zijn voor de celbewegingen.OPMERKING: Het aantal sporen moet ongeveer overeenkomen met het aantal microgliacellen, dus tussen 30 en 50, afhankelijk van de leeftijd van het embryo. Vóór voltooiing van de analyse wordt echter een hoger aantal verwacht als gevolg van foutieve sporen. Zodra de tracks zijn berekend, bevat de software een filterstap om alle zeer korte tracks uit te filteren, omdat ze vaak onnauwkeurig of niet informatief zijn. Sluit tracks korter dan 3-8 minuten (min) uit door de waarde rechtstreeks in het gegevensveld in te voeren voor de ondergrens van het trackduurfilter, of door de corresponderende gekleurde lijnen te slepen in het histogram dat onder aan de creatiewizard wordt weergegeven. Klik op Volgende om het filter te valideren en verder te gaan in de aanmaakwizard.OPMERKING: Zoals eerder vermeld, is het mogelijk om door het wijzigen van de maximale (max) en minimale (min) drempel voor de trackduur een voorbeeld te bekijken van de tracks die worden gefilterd en uitgesloten van de analyse. De gefilterde tracks kunnen vervolgens worden gedupliceerd in een nieuw object voor verdere analyse. De exacte tijdsdrempel voor het filteren kan variëren, afhankelijk van de resultaten van de vorige stap van de wizard voor het maken van gegevens. We raden u aan deze filterinstellingen te verfijnen door het voorbeeld in het weergavegebied te bekijken voor optimale resultaten. Aangezien de Tg (mpeg1:eGFP) transgene lijn alle mononucleaire fagocyten labelt, zullen huidmacrofagen naast microglia ook worden gedetecteerd in timelapse-films. Verwijder handmatig de sporen die zijn gegenereerd door huidmacrofagen uit de analyse om u te concentreren op parenchymale microglia in de hersenen (Figuur 3). Corrigeer handmatig andere mogelijke fouten in de tracks in de trackeditor, waarbij elk gegevenspunt wordt weergegeven als een object in de track. Activeer de knop voor de cirkelselectiemodus aan de rechterkant van het weergavegebied en markeer tracks die moeten worden gewijzigd of aangepast. Zodra het problematische nummer is geselecteerd, bewerkt u het met behulp van de knoppen voor verbinden en verbreken om de celbewegingen correct weer te geven. Gebruik de trackeditor om ook dubbele afzonderlijke spots of kleine trackfragmenten te selecteren en te verwijderen die ten onrechte dezelfde cel vertegenwoordigen door ze te selecteren met de cirkelselectiemodus en op Canc of Delete te drukken om ze te verwijderen.OPMERKING: Als de instellingen van de tracking correct zijn, zou deze stap slechts voor een klein percentage van de gevolgde cellen nodig moeten zijn. Als de microglia-reporterlijn wordt gebruikt in combinatie met fluorescerende transgenen die andere celtypen in het parenchym labelen, voer dan segmentatie uit als een nieuw oppervlakteobject of spotobject om ze te visualiseren. Om dit te doen, herhaalt u de bovenstaande stappen (van stap 3.2 tot 3.14), wijzigt u de invoer van het bronkanaal in stap 3.5, zodat dit degene is die wordt gebruikt om de tweede celpopulatie af te beelden, en zorgt u ervoor dat de beschrijvende parameters die specifiek zijn voor de cellen van belang, zoals geschatte XY-diameter (stap 3.5), maximale afstand (stap 3.8) aan de nieuwe celpopulatie worden aangepast. Andere stappen kunnen zonder wijzigingen worden herhaald.OPMERKING: In het geval van een nieuwe oppervlaktecreatie wordt de geschatte XY-diameter vervangen door een drempeloptie op basis van achtergrondaftrekking, waarbij de te geven invoer de diameter is van de grootste bol die in het object past. Deze waarde kan worden geschat vanuit de Segment-weergave met behulp van de werkbalk Meten , zoals uitgelegd in stap 3.2. Als u tevreden bent met de verkregen tracks, extraheert u de gewenste trackingstatistieken van het tabblad Statistiek . Klik op de instellingenknop en selecteer welke statistieken worden berekend voor elk eerder gemaakt spotobject of oppervlakteobject. Als er meer objecten zijn gemaakt in dezelfde analyse, twee spotobjecten of een spot- en een oppervlakteobject, zijn statistieken die de relatieve positie van het ene object ten opzichte van het andere weergeven, zoals de kortste afstand tussen de twee, ook beschikbaar om te exporteren.OPMERKING: Alle gewenste waarden kunnen specifieke of gemiddelde waarden zijn, en alle onbewerkte gegevens kunnen worden gedownload als een CSV-bestand (Comma Separated Values) met behulp van de knoppen onder aan het tabblad Statistieken . Op voorwaarde dat de analyse ook andere celtypen omvat, zullen ook aanvullende statistieken over de relatieve afstand van het ene object tot het andere beschikbaar komen.