הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

דגי הזברה הוחזקו בתנאים סטנדרטיים, על פי FELASA42 ומוסדיים (Université Libre de Bruxelles, בריסל, בלגיה; ULB) הנחיות ותקנות. כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה האתית לרווחת בעלי חיים של ULB (CEBEA) מה- ULB. 1. גידול דגי זברה והכנת עוברים הערה: הקו המהונדס של דג הזברה Tg(mpeg1:eGFP)gl22 המבטא את חלבון ה-eGFP הפלואורסצנטי במקרופאגים, כולל מיקרוגליה, שימש ליצירת נתוני המעקב המוצגים בפרוטוקול זה. קווי כתב מקרופאגים אחרים זמינים מ- ZIRC וניתן להשתמש בהם גם. בבחירת הקו המהונדס, חשוב לקחת בחשבון כי עוצמת אות גבוהה תקל על רכישת תמונה ופילוח תאים. לשמור על דגי זברה (Danio rerio) בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס ולנהל אותם בהתאם לפרוטוקולים שנקבעו11. עוררו הזדווגות על ידי הנחת נקבות וזכרים יחד במיכל רבייה, עם תחתית רשת ומפריד, בשעות אחר הצהריים המאוחרות לפני תאריך הלידה של העוברים הרצויים. הסירו את המפריד למחרת בבוקר כדי לתזמן את הזדווגות הדגים. אספו את הביציות המופרות באמצעות רשת והעבירו אותן לצלחת פטרי 100 מ”מ המכילה E3 בינוני (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) עם 0.01% מתילן כחול. בהתאם לרקע הגנטי של הקו המהונדס של דג הזברה בו נעשה שימוש, אם יש לעכב היווצרות פיגמנט כדי להקל על ההדמיה, הוסף 0.003% של N-phenylthiourea (PTU) למאגר E3 שבו מתפתחים עוברים, החל מ -6 שעות לאחר ההפריה (HPF) ורענן את התמיסה כל יומיים עד שמגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי.הערה: כדי להימנע מחשיפה ארוכה ל-PTU שעלולה להשפיע על התפתחות העובר12, מומלץ להשתמש, אם קיים, בקו מהונדס על רקע חסר פיגמנט, כגון Casperw2, המאפשר הדמיה ברורה ללא צורך לחשוף עוברים ל-PTU למשך פרק זמן ממושך13. אם העוברים שיש לצלם הם מתחת ל -3 ימים לאחר ההפריה (dpf), dechorionate אותם ב 24 hpf. השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי לאשר שכל העוברים עברו דה-כוריוניזציה ואינם ניזוקו מהטיפול האנזימטי (ראה שלב 1.4.2).במקרה של מספר מוגבל של ביציות, עשו זאת באופן ידני על ידי שימוש במלקחיים מנתחים עדינים כדי לצבוט את הכוריון ולמשוך החוצה, תוך שחרור זהיר של כל עובר מהכוריון שלו. במקרה של מספר גבוה יותר של ביציות, בצע את הדכוריונציה באופן אנזימטי על ידי דגירה על הביצים בתפזורת בטמפרטורת החדר (RT) בתמיסת פרונאז 1 מ”ג/מ”ל בתווך E3 לתקופה קצרה (בדרך כלל 5-10 דקות, עד שהכוריון נפתח תחת שטיפה עדינה). לאחר מכן, תמיסת Pronase מושלכת, והעוברים נשטפים ביסודיות 3x עם E3 טרי, כדי להסיר את כל הכוריון שנותר ואנזים שיורי. 2. הרכבה של דגי זברה הכינו תמיסת אגרוז בהתכה נמוכה של 1% במאגר E3. מצננים את האגרוז ל-37°C בבלוק חימום ומוסיפים תמיסת טריקאין מתאן-סולפונט טרייה (160 מ”ג/ליטר), שתסייע לשמור על העוברים מורדמים במהלך ההדמיה. מערבולת את הפתרון כדי הומוגניזציה יסודית זה. הרדימו את העוברים על ידי הוספת 160 מ”ג/ליטר של טריקאין מתאן-סולפונט לצלחת הפטרי המכילה את העוברים במאגר E3. בדוק כדי לוודא שהתנועה נעצרה ובחר את עוברי דגי הזברה עם הפלואורסצנטיות הרצויה. בדוק את בריאות העובר על ידי הדמיה של פעימות הלב שלו באמצעות מיקרוסקופ סטריאו בהיר. באמצעות פיפטת העברה רחבת קצוות ציירו אחד, או עד שלושה, מהעוברים שנבחרו והעבירו אותם לצלחת הדמיה מזכוכית תחתונה. תחת מיקרוסקופ סטריאו, להשתמש פיפטה כדי להסיר מדיום רב ככל האפשר, נזהר לא לגעת או לפגוע בעוברים; לאחר מכן, החלף את המדיום בתמיסת אגרוז נמסה נמוכה שהוכנה בעבר 1%. לאחר מכן, השתמש בקצה פלסטיק דק ומחודד המקובע לקצה מחט מתגרה כדי לדחוף בעדינות כל עובר לתחתית צלחת ההדמיה, לכוון אותו כך שהצד הגבי שלו פונה לזכוכית כדי להבטיח תצוגה טובה של הטקטום האופטי וכמות מינימלית של אגרוז נמס נמוך בין העובר לזכוכית. דמיינו את העובר הרכוב מיד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך הכולל יעד Plan Apo באיכות גבוהה (10x/0.45 Plan Apo או 20x/0.75 Plan Apo המשמש כאן). אם חלוף הזמן יפעל במשך פרק זמן ממושך (מעל שעה), הוסיפו טיפה אחת או שתיים של חיץ E3 עם טריקאין מתאן-סולפונט (160 מ”ג/ליטר) לצלחת ההדמיה התחתונה של הזכוכית כדי למנוע מהאגרוז הנמס נמוך להתייבש יתר על המידה.הערה: חיוני להמתין עד שהאגרוז יתמצק לחלוטין לפני הוספת חיץ E3 ומדיה טריקאין מתאן-סולפונט לדיסק ההדמיה; אחרת, הדג יכול לנוע לאט לרוחב ובאופן אקסיאלי, ובכך לגרום להיסחפות דגימה בחלוף הזמן. המשך כדי להגדיר את רכישת קיטועי הזמן לזמן הרצוי: הגדר את רזולוציית התמונה ל- 1,024 x 1,024, עם גודל פיקסל של 0.49 מיקרומטר. אספו פרוסות אופטיות בדרגות של 2-3 מיקרומטר כדי להבטיח רזולוציה מקובלת על ציר z. בעובר דג הזברה, הקיפו את הטקטום האופטי במחסנית Z של 100-150 מיקרומטר, בהתאם לשלב ההתפתחותי בו נעשה שימוש. כדי להבטיח מעקב מוצלח אחר תאים, שמור על מרווח הזמן בין מסגרות בין 30 שניות ל- 60 שניות. 3. מעקב אחר ניתוח וייצוא נתונים המר את קובץ קיטועי הזמן לתבנית IMS באמצעות תוכנת ממיר הקבצים Imaris (ראה טבלת חומרים). עם הפעלת התוכנה, גרור ושחרר את הקבצים לאזור הקלט או השתמש ב- הוסף קבצים… כדי לבחור אותם ידנית. בתפריט פלט , הקצה את המיקום לקבצים שהומרו, ובחר באותה תיקייה כמו קבצי הקלט או ציין תיקייה מסוימת. ודא שהממדים של גודל הווקסל המוצג נכונים על ידי לחיצה על הגדר גודל ווקסל כפתור ולאחר אימות גודל הווקסל, לחץ על התחל הכל כפתור כדי להתחיל את המרת הקובץ (ראה קובץ משלים 1 למדריך שלב אחר שלב של כל ניתוח הנתונים).הערה: אם חלוף הזמן בוצע על שני עוברים או יותר במקביל, הקובץ יפוצל אוטומטית למיקומים בודדים, תוך הפרדת כל עובר לקבצים שונים. ניתן להשתמש בתוכנה במצב אצווה ולהעלות ולהמיר מספר קבצים בו זמנית. קבצי IMS ייווצרו ויישמרו בתיקיית היעד שנבחרה או בתיקייה שבה ממוקמים קבצי הקלט. לאחר ההשקה, תן לתוכנת הניתוח להתחיל בזירה; לחץ על Observe Folder כדי לפתוח את הקובץ שהומר בעבר. לאחר טעינת הקובץ לתוכנה, השתמש בתצוגת פרוסה כדי לגלול בערימת z, באמצעות המחוון בסרגל הכלים פרוסה הממוקם משמאל לאזור התצוגה, ולמדוד כמה קטרים של תאים על-ידי ציור קוטר התאים שנבחרו באמצעות המצביע. לחץ וגרור את העכבר כדי לצייר מקטע המשתרע על ליבת התא; שימו לב לאורך המקטע שצויר בסרגל הכלים ‘מדידה’, הממוקם מימין לאזור התצוגה.הערה: באמצעות הגדרות ההדמיה בשלב 2.5, ניתן לצפות שקוטר גוף התא יהיה בין 6 מיקרומטר ל-8 מיקרומטר. כדי לזהות את התאים באופן אוטומטי, חזור לתצוגת התלת-ממד ולחץ על סמל הספוט בסרגל הכלים של האובייקטים כדי להוסיף אובייקט ספוט חדש לרשימת האובייקטים ולפתוח את אשף יצירת הספוטים האוטומטי. בשלב הראשון של האשף, סמן את האפשרות לפלח רק אזור עניין. לאחר מכן, הפעל את האפשרות עקוב אחר נקודות (לאורך זמן) כדי לחשב את נתוני המעקב, וכן את סטטיסטיקת אובייקט-אובייקט כדי לאפשר השוואה בין נקודות ולהרחיב את טווח הנתונים שיהיו זמינים בהמשך הניתוח. לבסוף, המשך באשף על-ידי לחיצה על הלחצן הבא בפינה השמאלית התחתונה של חלון האשף. בשלב השני, המשך לציין אזור עניין (ROI) התוחם את הטקטום האופטי של העובר. שנה את גודל החזר ההשקעה על-ידי לחיצה וגרירה של החצים הלבנים הקטנים הקיימים בכל פאה שלו. לאחר הגדרת גודל החזר ההשקעה, הרחב אותו לכל המסגרות המוקלטות על ידי התאמת מרווח הזמן. לאחר מכן, בחר כערוץ מקור את הערוץ ששימש לזיהוי התאים והגדר את מדידת קוטר התא, שהתקבלה קודם לכן בשלב 3.2, כקוטר XY משוער. הפעל את האפשרות חיסור רקע ולחץ על הבא. בשלב זה באשף יצירת הספוטים, התוכנה משלבת שלב סינון איכותי שבו נקודות מסוננות לפי עוצמת האות הנמדדת במרכז כל נקודה; בערוץ שבו התגלו הכתמים. התאם את סף העוצמה על-ידי הזנת הערך ישירות בשדה הנתונים עבור תיבות סף תחתונות ועליונות או על-ידי גרירת הקווים הצבעוניים המתאימים בהיסטוגרמה המוצגת בתחתית אשף היצירה, כך שכל התאים יזוהו, כולל אלה הממוקמים עמוק יותר ברקמה, המציגים בדרך כלל עוצמת אות נמוכה יותר. כל השינויים הללו גלויים בו-זמנית באזור התצוגה.הערה: ניתן לצפות במספר כתמים המסמנים תא בודד בשלב זה, אך ניתן לתקן זאת בהמשך הניתוח.בהפסקות זמן ארוכות יותר, אם רואים הלבנה מסוימת, בדוק את אזור התצוגה של מסגרות מרובות לפני קביעת הסף כדי לוודא שכל התאים מזוהים גם במסגרות האחרונות ולכן חיוורות יותר. לאחר שביעות רצון, לחץ על הבא כדי לאמת את סף האיכות שנבחר. כל הכתמים העונים על פרמטר סף האיכות ובעלי קוטר תואם לקוטר XY המשוער יסומנו כנקודה. הצג זאת באופן חזותי כתצוגה מקדימה באזור התצוגה, שבו כתמים העונים על שני פרמטרים אלה יוצבו על גבי ערוץ המקור. בשלב הבא, בחר את התנועה האוטורגרסיבית כאלגוריתם המעקב כדי לעקוב אחר תאים בעלי תנועה רציפה פחות או יותר. שפטו את המרחק הארוך ביותר שתא נע בין שתי נקודות זמן על ידי התבוננות מדוקדקת בתנועת הכתמים בין שתי מסגרות והזינו מספר משוער בשדה המרחק המרבי . זהו המרחק שבו מותר לכתם לסטות מהמיקום העתידי החזוי. הגדר את גודל המרווח המרבי למספר הנמוך ביותר של נקודות זמן שבהן הנקודה עשויה להיעלם מבלי להפריע למסלול. אם מרווח הזמן בין מסגרות נמוך מ- 60 שניות, השתמש בגודל 3. אם מרווח הזמן בין מסגרות ארוך יותר, הגדל את גודל המרווח המרבי המותר כדי להפחית את פיצול הרצועה. אפשר לפערי המילוי עם כל האובייקטים שזוהו לשחרר את סף הזיהוי קרוב למיקום הצפוי שנחזה על-ידי אלגוריתם המעקב ולחבר רצועות שנקטעו עקב כשל בזיהוי הנקודה. לבסוף, לחץ על הבא ותן לתוכנה ליצור באופן אוטומטי רצועות עבור כל המקומות שנוצרו בעבר. אם הרצועות המתקבלות נראות רבות מדי או מקוטעות, חזור אחורה באשף היצירה, על ידי לחיצה על הלחצן הקודם , והתאם את המרחק המרבי שהוגדר קודם לכן, או להגדיל או להקטין את המספר עד שרוב הרצועות המתקבלות מייצגות את תנועות התא.הערה: מספר המסלולים צריך להתאים בערך למספר תאי מיקרוגליה, ולכן, נע בין 30 ל -50, בהתאם לגיל העובר. עם זאת, לפני השלמת הניתוח צפוי מספר גבוה יותר בשל מסלולים שגויים. לאחר חישוב המסלולים, התוכנה משלבת שלב סינון כדי לסנן את כל הרצועות הקצרות מאוד מכיוון שהן לעתים קרובות לא מדויקות או לא אינפורמטיביות. אל תכלול רצועות קצרות מ- 3-8 דקות (דקות) על-ידי הזנת הערך ישירות בשדה הנתונים עבור הגבול התחתון של מסנן משך המסלול, או על-ידי גרירת הקווים הצבעוניים המתאימים בהיסטוגרמה המוצגת בתחתית אשף היצירה. לחץ על הבא כדי לאמת את המסנן ולהמשיך הלאה באשף היצירה.הערה: כפי שצוין קודם לכן, על ידי שינוי סף משך המסלול המרבי (מקסימום) והמינימלי (מינימום), ניתן להציג תצוגה מקדימה של המסלולים שיסוננו ולא ייכללו בניתוח. לאחר מכן ניתן לשכפל את הרצועות המסוננות באובייקט חדש לצורך ניתוח נוסף. סף הזמן המדויק לסינון עשוי להשתנות בהתאם לתוצאות השלב הקודם של אשף היצירה . מומלץ לכוונן הגדרות מסנן אלה על-ידי סקירת התצוגה המקדימה באזור התצוגה לקבלת תוצאות מיטביות. מכיוון שהקו המהונדס Tg (mpeg1:eGFP) מסמן את כל הפאגוציטים החד-גרעיניים, מקרופאגים של העור בנוסף למיקרוגליה יזוהו גם בסרטי קיטועי זמן. הסירו ידנית את העקבות שנוצרו ממקרופאגים בעור מהניתוח כדי להתמקד במיקרוגליה פרנכימלית במוח (איור 3). תקן ידנית טעויות פוטנציאליות אחרות ברצועות בעורך המסלול, שבו כל נקודת נתונים מוצגת כאובייקט במסלול. הפעילו את לחצן בחירת מצב העיגול מימין לאזור התצוגה וסמנו רצועות הדורשות שינויים או התאמות. לאחר בחירת הרצועה הבעייתית, באמצעות לחצני החיבור והניתוק, ערוך אותה כך שתייצג נכונה את תנועות התא. השתמש בעורך הרצועות גם כדי לבחור ולמחוק נקודות בודדות משוכפלות או קטעי רצועה קטנים המייצגים בטעות את אותו תא על-ידי בחירתם במצב בחירת העיגול והקשה על Canc או Delete כדי לחסל אותם.הערה: אם הגדרות המעקב נכונות, שלב זה אמור להידרש עבור אחוז קטן בלבד של התאים המסומנים. אם קו כתב מיקרוגליה משמש בשילוב עם טרנסגניות פלואורסצנטיות המסמנות סוגי תאים אחרים בפרנכימה, בצע סגמנטציה כאובייקט משטח חדש או אובייקט ספוט כדי להמחיש אותם. לשם כך, חזור על השלבים לעיל (משלבים 3.2 עד 3.14), שנה את קלט ערוץ המקור בשלב 3.5, כך שהוא יהיה זה המשמש להדמיה של אוכלוסיית התא השני, ודאג להתאים את הפרמטרים התיאוריים הספציפיים לתאים המעניינים כגון קוטר XY משוער (שלב 3.5), מרחק מרבי (שלב 3.8) לאוכלוסיית התאים החדשה. ניתן לחזור על שלבים אחרים ללא שינויים.הערה: במקרה של יצירת משטח חדש, קוטר XY משוער מוחלף באפשרות סף המבוססת על חיסור רקע, כאשר הקלט שיש לתת הוא הקוטר של הכדור הגדול ביותר שמתאים לאובייקט. ניתן להעריך ערך זה מתצוגת פרוסה באמצעות סרגל הכלים מדידה , כפי שמוסבר בשלב 3.2. לאחר שתהיו מרוצים מהמסלולים שהתקבלו, חלצו את סטטיסטיקת המעקב הרצויה מהכרטיסייה סטטיסטיקה . לחיצה על כפתור ההגדרות , בחר אילו נתונים סטטיסטיים יחושבו עבור כל אובייקט ספוט או אובייקט משטח שנוצר בעבר. במקרה שנוצרו עצמים נוספים באותו ניתוח, שני עצמים נקודתיים או עצם ספוט ופני שטח, סטטיסטיקה המתארת את המיקום היחסי של אובייקט אחד למשנהו, כגון המרחק הקצר ביותר בין השניים, תהיה זמינה גם לייצוא.הערה: כל הערכים הרצויים יכולים להיות ערכים ספציפיים או ממוצעים, וכל הנתונים הגולמיים ניתנים להורדה כקובץ ערכים מופרדים באמצעות פסיקים (CSV) באמצעות הלחצנים בתחתית הכרטיסיה סטטיסטיקה . בתנאי שהניתוח כולל גם סוגי תאים אחרים, נתונים סטטיסטיים נוספים על המרחק היחסי של אובייקט אחד למשנהו יהיו זמינים גם כן.