Dynamische lichtinduzierte Proteinmuster an Modellmembranen
Summary
In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Erzeugung lichtregulierter und reversibler Proteinmuster mit hoher raumzeitlicher Präzision an künstlichen Lipidmembranen beschrieben. Die Methode besteht aus der lokalisierten Photoaktivierung des Proteins iLID (improved light-inducible dimer), das auf Modellmembranen immobilisiert ist und unter blauem Licht an sein Partnerprotein Nano (Wildtyp-SspB) bindet.
Abstract
Die präzise Lokalisierung und Aktivierung von Proteinen an der Zellmembran zu einem bestimmten Zeitpunkt führt zu vielen zellulären Prozessen, darunter die Polarisation, Migration und Teilung von Zellen. Daher sind Methoden zur Rekrutierung von Proteinen zur Modellierung von Membranen mit subzellulärer Auflösung und hoher zeitlicher Kontrolle unerlässlich, um solche Prozesse in synthetischen Zellen zu reproduzieren und zu kontrollieren. Hier wird ein Verfahren zur Herstellung lichtregulierter reversibler Proteinmuster an Lipidmembranen mit hoher raumzeitlicher Präzision beschrieben. Zu diesem Zweck immobilisieren wir das photoschaltbare Protein iLID (improved light-inducible dimer) auf gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs) und auf der äußeren Membran von riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs). Bei lokaler Blaulichtbeleuchtung bindet iLID an seinen Partner Nano (Wildtyp-SspB) und ermöglicht die Rekrutierung eines beliebigen mit Nano fusionierten Proteins (POI) von der Lösung in den beleuchteten Bereich auf der Membran. Diese Bindung ist im Dunkeln reversibel, was eine dynamische Bindung und Freigabe des POI ermöglicht. Insgesamt handelt es sich um eine flexible und vielseitige Methode, um die Lokalisierung von Proteinen mit hoher Präzision in Raum und Zeit mittels blauem Licht zu regulieren.
Introduction
Die Bildung von Proteinmustern auf Zellmembranen innerhalb subzellulärer Regionen führt zu zahlreichen biologischen Prozessen, einschließlich Migration, Teilung und lokalisierter Zell-zu-Zell-Kommunikation 1,2. Diese Proteinmuster sind räumlich und zeitlich reguliert und hochdynamisch. Die Replikation solcher Proteinmuster in synthetischen Zellen ist unerlässlich, um zelluläre Prozesse, die aus ihnen entstehen, nachzuahmen und um besser zu verstehen, wie eine solche Regulation auf molekularer Ebene funktioniert. Analog zu dem, was für Membranen in lebenden Zellen beobachtet wird, müssen Methoden zur Erzeugung von Proteinmustern auf künstlichen Membranen deren Dynamik erfassen und eine präzise raumzeitliche Kontrolle ermöglichen.
Unter den verschiedenen Reizen zeichnet sich das Licht durch die höchste raumzeitliche Kontrolle und mehrere zusätzliche Vorteile aus3. Durch die Regulierung mit Licht ist es einfach, einen gewünschten Bereich zu jeder gewünschten Zeit mit unübertroffener Präzision zu beleuchten. Darüber hinaus bietet das Licht eine hohe Abstimmbarkeit, da sowohl die Lichtintensität als auch die Impulsdauer eingestellt werden können. Darüber hinaus ist sichtbares Licht für Biomoleküle, einschließlich Proteine, ungefährlich, und es ist sogar möglich, mehrere Funktionalitäten mit unterschiedlichen Wellenlängen zu adressieren. Daher erweisen sich lichtempfindliche Ansätze, die auf sichtbarem Licht basieren, als vielversprechende Wege für die kontrollierte und biorthogonale Regulation von Proteinmustern in Raum und Zeit 4,5,6. Die Verwendung von photoschaltbaren Proteinpaaren aus der Optogenetik, die als lichtinduzierbare Dimerizer wirken, bietet eine einfache Methode zur Rekrutierung spezifischer Proteine für Membranen. Insbesondere wurden Proteinmuster auf künstlichen Membranen erfolgreich unter Verwendung der durch blaues Licht ausgelösten Wechselwirkung zwischen iLID (verbessertes lichtinduzierbares Dimer, basierend auf der photoschaltbaren LOV2-Domäne von Avena sativa) und Nano (Wildtyp-SspB)7,8, dem blaulichtinduzierbaren SpyTag-System (BLISS)9, dem grünlichtresponsiven Proteintetramer CarH10 und der rotlichtinduzierbaren Wechselwirkung zwischen PhyB und PIF611 gebildet.
Es wurde gezeigt, dass die photoschaltbare Wechselwirkung zwischen iLID und Nano5 genutzt werden kann, um Proteine auf Modellmembranen mit blauem Licht zu photostrukturieren7. Die iLID/Nano-Wechselwirkung ist im Dunkeln reversibel, hochspezifisch und funktioniert unter physiologischen Bedingungen. Die Verankerung von iLID an Lipidmembranmodellen, wie z. B. riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) oder gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs), ermöglicht eine lichtregulierte Rekrutierung von Nano an diese Membranen, die im Dunkeln reversibel ist. Insbesondere haben wir beobachtet, dass die Einführung einer ungeordneten Domäne in den N-Terminus von iLID (was zu einem Protein namens disiLID führt) als Bindung an eine Modelllipidmembran die Effizienz der Nanorekrutierung und die Reversionsdynamik verbessert8.
Unter Verwendung der disiLID/Nano-Wechselwirkung haben wir eine Methode entwickelt, mit der sich kontrastreiche Muster von Nano-fusionierten Proteinen (POI) auf SLBs und den externen Membranen von GUVs erzeugen lassen. Diese Methode ermöglicht die Erstellung von Proteinmustern mit bemerkenswerter räumlicher und zeitlicher Auflösung und hoher Reversibilität innerhalb von Minuten. Das detaillierte Protokoll beschreibt den Prozess der lokalen Rekrutierung von Proteinen auf künstlichen Membranen. Konkret wird dies durch die Immobilisierung einer biotinylierten Version von disiLID auf SLBs und GUVs durch die Biotin-Streptavidin (SAv)-Interaktion erreicht. Anschließend wird fluoreszenzmarkiertes Nano (mOrange-Nano) unter Blaulichtbeleuchtung an diese disiLID-funktionalisierten Membranen rekrutiert. Unser experimentelles Protokoll bietet einen unkomplizierten und anpassungsfähigen Ansatz, um eine lokalisierte Proteinrekrutierung an Membranen zu erreichen. Wichtig ist, dass diese Methodik nicht auf die berichteten SLB- und GUV-Grenzflächen oder mOrange-Nano beschränkt ist. Es kann auf andere disiLID-funktionalisierte Materialien und Proteine ausgeweitet werden, die mit Nano fusioniert sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben eine Methode zur lokalisierten Rekrutierung von mOrange-Nano-Proteinen auf Modellmembranen, wie z.B. gestützten Lipiddoppelschichten und riesigen unilamellären Vesikel, unter Verwendung des photoschaltbaren Proteins disiLID8 beschrieben. Aspekte, die zur Qualität des Musters beitragen, sind unter anderem die Qualität der Proteine sowie die gute Qualität der SLBs und GUVs.
Um eine gute Proteinqualität nach der Expression und Aufreinigung zu gewährleisten, ist es wichtig, zunächst die photoschaltbaren Eigenschaften von disiLID zu bewerten. Zu diesem Zweck muss die Absorption des FMN-Cofaktors im Dunkeln und nach Blaulichtbeleuchtung gemessen werden. Es wird erwartet, dass die UV-Vis-Spektren von disiLID den charakteristischen Triple-Peak des Cofaktors FMN im Dunkeln zeigen, der bei Blaulichtbeleuchtung deutlich abnimmt und sich im Dunkeln erholt13. Dieses photoschaltbare Verhalten ist entscheidend, um in den folgenden Schritten eine reproduzierbare und reversible Rekrutierung zu erhalten. Die Arbeit mit schützendem rotem Licht und die Exposition von disiLID mit minimaler externer Beleuchtung während der Probenvorbereitung erhöht die Leistung der Experimente.
Ein weiterer kritischer Schritt, und vielleicht der entscheidendste, ist die Bildung geeigneter SLBs. Defekte in den Membranen und/oder die Bildung inhomogener SLBs (d.h. das Vorhandensein von Multilayern oder gepatchten SLBs) beeinträchtigen die Qualität der Proteinstrukturierung. Daher wird unerfahrenen Anwendern empfohlen, das Protokoll zu reproduzieren, indem die SUVs mit einigen Membranfarbstoffen wie DiD und DiO markiert werden, um fluoreszenzmarkierte SLBs zu bilden. Auf diese Weise können die Eigenschaften und die Qualität von SLBs mit der Fluoreszenzmikroskopie gut charakterisiert werden. FRAP-Messungen stellen einen typischen Ansatz zur Beurteilung der Qualität eines SLB dar, indem die Fließfähigkeit der Membranen bewertet wird. Alternativ kann im Falle von biotinylierten SLBs, wie sie in diesem Protokoll beschrieben werden, fluoreszenzmarkiertes SAv (z. B. Atto 488-SAv) verwendet werden, um die Qualität von SLBs sichtbar zu machen und zu bewerten.
Der erste Teil des Protokolls beschreibt die Bildung von Mustern auf SLBs. Um ein optimales Ergebnis zu gewährleisten, ist es wichtig, mOrange-Nano auf die SLBs zu geben und die Probe 15 Minuten lang im Dunkeln inkubieren zu lassen. Bei der Photoaktivierung ist die Auswahl des ROI nicht auf eine bestimmte Größe beschränkt. Allerdings müssen die Laserintensität und die Belichtungszeit reguliert werden, um unerwünschtes Photobleaching der fluoreszierenden Proteine zu reduzieren.
Diese Methode ist nicht auf biotinylierte Proteine beschränkt, und andere Ansätze können verwendet werden, um disiLID an SLBs zu verankern. Zum Beispiel kann His-markiertes disiLID exprimiert und an Ni-NTA-haltigen SLBs verankert werden. Es ist jedoch entscheidend, Nano und disiLID mit unterschiedlichen Tags zu exprimieren, um einen Ersatz der Proteine auf den SLBs zu vermeiden. Diese Methode ermöglicht es auch, die Reihenfolge der Proteine umzukehren, wodurch SLBs mit Nano funktionalisiert und disiLID (oder disiLID-fusionierte Proteine) bei Blaulichtbeleuchtung rekrutiert werden.
Zur dynamischen Kontrolle der Proteinlokalisation sollte die reversible Lokalisierung des Proteins in die ausgewählte Region wiederholt möglich sein. Um dies zu erreichen, ist die Konzentration von Nano (200 nM) in der Lösung ein kritischer Parameter, um eine hohe Reversibilität zu erreichen.
Ein weiteres Problem ist die Rekrutierung von Nano auf der disiLID-funktionalisierten GUV-Oberfläche. Wie im Fall der Proteinstrukturierung auf SLBs kann diese Methode auf verschiedene Membranfunktionalisierungsstrategien erweitert werden. In diesem Protokoll wurde das gesamte GUV mit blauem Licht beleuchtet, um mOrange-Nano auf der gesamten GUV-Oberfläche zu rekrutieren. Die Selektion kleiner ROIs, die auf der GUV-Membran lokalisiert sind, sollte jedoch zu einer präzisen Lokalisierung von Proteinen in einem engeren Bereich führen.
Diese Methode stellt nur eine Einschränkung dar, die mit der Wahl des Fluorophors zusammenhängt, das für die Abbildung der Nanorekrutierung an der Membran der SUVs oder GUVs verwendet wird. Insbesondere müssen Fluorophore mit einem Anregungsspektrum im Blaulichtbereich vermieden werden, da ihre Verwendung die Photoaktivierung von (dis)iLID stört. Daher wird für diese Art von Experimenten die Wahl von Fluorophoren im Grün- oder Rotlichtbereich (z. B. mOrange oder Cy5) empfohlen.
Das disiLID-Design bietet eine einfache und anpassungsfähige Möglichkeit, die lokale Proteinrekrutierung an Membranen zu verbessern und erweitert den Dynamikbereich von iLID und Nano aus der Optogenetik4. Diese Methoden konzentrieren sich auf die Rekrutierung von Nano auf mimische Membranen wie Lipiddoppelschichten und GUVs. Dennoch ist dieser Ansatz auf die zahlreichen optogenetischen Werkzeuge in Zellen erweiterbar, bei denen (dis)iLID oder Nano an eine Membran gebunden sind.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde gefördert durch den Europäischen Forschungsrat ERC Starting Grant ARTIST (# 757593 S.V.W.). Das DDI dankt der Alexander von Humboldt-Stiftung für ein Postdoc-Stipendium.
Materials
| µ-Slide 18 Well | Ibidi | 81817 | For SLB preparation |
| 25 µL Microliter Syringe | Hamilton | Model 702 N | For the preparation of lipid mixture and spreading the lipid solution on the PVA layer |
| Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C | For SUVs preparation |
| CaCl2 (Calcium chloride) | Sigma-Aldrich | C5670 | For SLB formation |
| Cover Slips 24 mm x 60 mm | Engelbrecht | K12460 | For GUVs formation |
| DiD (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'- Tetramethylindodicarbocyanine) |
Thermo Fisher Scientific | D7757 | Membrane dye |
| disiLID | Sequence: MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA IAALGGGGAGPPVGGGGGRGDA GPGSGAASGTVVAAAAGGPGPG AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSGA GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVIT DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK TAFQIAEAANDENYF |
||
| DOPC (1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375P | For SUVs lipid composition |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes |
Merk | EP0030108116-100EA | For collecting freshly made GUVs |
| mOrange-Nano | Sequence: MRGSHHHHHHGSKIEEGKLVI WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP PKTWEEIPALDKELKAKGKSALM FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSA GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA LKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGI EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE GEGEGRPYEGFQTAKLKVTKGG PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYK VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG WEASSERMYPEDGALKGEIKMR LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE QYERAEGRHSTGGMDELYKGG SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA RENGDGVMFEPEEIYDELNIG |
||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | For buffer |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma-Aldrich | 1064980500 | For surface activation in SLB formation |
| POPC (1-Palmitoyl-2- oleoylphosphatidylcholine) |
Avanti Polar Lipids | 850457C | For GUVs lipid composition |
| POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-racglycerol)) | Avanti Polar Lipids | 840457C | For GUVs lipid composition |
| PVA (Polyvinyl alcohol) fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | 8148940101 | For GUVs formation |
| SP8 confocal laser scanning microscope | Leica | ||
| Streptavidin | TermoFisher | 434301 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | For GUVs formation |
| Tris hydrochloride | Sigma-Aldrich | 10812846001 | For buffer |
References
- Kretschmer, S., Schwille, P. Pattern formation on membranes and its role in bacterial cell division. Curr Opin Cell Biol. 38, 52-59 (2016).
- Yang, H. W., Collins, S. R., Meyer, T. Locally excitable Cdc42 signals steer cells during chemotaxis. Nat Cell Biol. 18 (2), 191-201 (2016).
- Caldwell, R. M., et al. Optochemical control of protein localization and activity within cell-like compartments. Biochem. 57 (18), 2590-2596 (2018).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci. 112 (1), 112-117 (2015).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Bartelt, S. M., et al. Dynamic blue light-switchable protein patterns on giant unilamellar vesicles. Chem Commun. 54 (8), 948-951 (2018).
- Di Iorio, D., Bergmann, J., Higashi, S. L., Hoffmann, A., Wegner, S. V. A disordered tether to iLID improves photoswitchable protein patterning on model membranes. Chem. Commun. 59 (29), 4380-4383 (2023).
- Hartzell, E. J., Terr, J., Chen, W. Engineering a blue light inducible Spytag system (BLISS). J Am Chem Soc. 143 (23), 8572-8577 (2021).
- Xu, D., Bartelt, S. M., Rasoulinejad, S., Chen, F., Wegner, S. V. Green light lithography: a general strategy to create active protein and cell micropatterns. Mater Horiz. 6 (6), 1222-1229 (2019).
- Jia, H., et al. Light-induced printing of protein structures on membranes in vitro. Nano Lett. 18 (11), 7133-7140 (2018).
- Di Iorio, D., Verheijden, M. L., vander Vries, E., Jonkheijm, P., Huskens, J. Weak Multivalent Binding of influenza hemagglutinin nanoparticles at a sialoglycan-functionalized supported lipid bilayer. ACS Nano. 13 (3), 3413-3423 (2019).
- Kasahara, M., Torii, M., Fujita, A., Tainaka, K. FMN binding and photochemical properties of plant putative photoreceptors containing two LOV domains, LOV/LOV proteins. J Biol Chem. 285 (45), 34765-34772 (2010).
