Model Membranlarda Dinamik Işık Kaynaklı Protein Modelleri

1. Deneysel hazırlık Biyotinile disiLID (b-disiLID) ve mOrange-Nano’yu (Malzeme Tablosuna bakınız) daha önce bildirilen prosedürleri izleyerek eksprese edin ve saflaştırın 7,8. Seçilen lipit bileşimi ve konsantrasyonları ile cam şişelerde lipit karışımları hazırlayın. İlk olarak, 1 mg / mL konsantrasyonlu nihai bir lipit çözeltisi elde etmek için lipitleri kloroformda çözün.94.9 mol% 2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC), 5 mol% 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolaminN- (kap biyotinil) sodyum tuzu (DOPE-biotin) ve 0.1 mol% 1,1′-Dioktadesil-3,3,3 ‘, 3′-Tetrametilindodikarbosiyanin (DiD) (Malzeme Tablosuna bakınız).NOT: Lipid karışımı, değişen oranlarda ve DOPE-biotin konsantrasyonu ve / veya farklı membran boyaları ile ayarlanabilir. Önerilen DOPE-biyotin konsantrasyonu (% 5 mol), aşağıdaki adımlarda yüksek yoğunluklu bir Streptavidin (SAv) tabakasının oluşumuna izin verir. Daha önce bildirilen yöntemleri izleyerek küçük unilamellar veziküller (SUV’lar) hazırlayın 7,8,12. Bu adım için ≤100 nm çapında SUV’ların hazırlanması tavsiye edilir. Bu çalışma için sonikasyon yöntemi kullanılmıştır. İlk olarak, ince bir lipit filmi oluşturmak için şişeleri döndürürken cam şişedeki kloroform çözeltisini bir nitrojen akışı ile buharlaştırın. Daha sonra, kalan kloroformu vakum altında en az 1 saat çıkarın.Kurutulmuş filmi, girdaplama yoluyla 1 mg / mL lipit nihai konsantrasyonu ile ultra saf suda rehidre edin. Son olarak, opak çözelti berraklaşana kadar elde edilen çözeltiyi 10 dakika boyunca sonikleştirin.NOT: Lipid karışımını buzdolabında bir mikrosantrifüj tüpünde en fazla 2 hafta saklayın. Nihai SUV’ların boyutu ≤ 100 nm olduğu sürece farklı SUV hazırlama yöntemleri (örneğin ekstrüzyon yöntemi) de kullanılabilir. 2. disiLID işlevselleştirilmiş SLB’lere mOrange-Nano alımı μ kızaklı 18 kuyulu cam tabanlı haznenin her bir oyuğuna 150 μL 2 M NaOH ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Daha sonra, NaOH’yi çıkarın ve kuyuları önce 150 μL ultra saf su ile 3-5 kez ve daha sonra 10 mM CaCl2 içeren 150 μL tampon (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) ile 3 kez yıkayın. Tamponda SUV’ların yaklaşık 10 faktör seyreltilmesine sahip olmak için 10 mM CaCl2 ile 150 μL tampon içeren kuyucuklara 15 μL taze hazırlanmış SUV (su içinde stok konsantrasyonu 1 mg/mL) ekleyin. SUV’ların oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Kuluçka süresinden sonra, biyotinillenmiş SLB’ler oluşacaktır. SLB’leri CaCl2 olmadan tamponla (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) en az 7 kez önce çözeltiyi çıkararak ve ardından her adımda taze tampon ekleyerek yıkayın. Her yıkama adımı için 80 μL tampon kullanılması tavsiye edilir.NOT: SLB’lerin optimum şekilde yıkanması, taze çözeltinin yüzeye temas etmeden birkaç kez yukarı ve aşağı pipetlenmesiyle elde edilir. Oluşan SLB’lere zarar verebilecek küçük hava kabarcıklarının oluşumunu azaltmak için çözeltinin yeni oluşturulan SLB’leri içeren kuyucuklarda pipetlenmesi nazik olmalıdır. Bu andan itibaren, SLB’lerin kurumasını önlemek için kuyular yeterli miktarda tampon içermelidir. Biyotinile SLB’lerin SAv ile daha fazla işlevselleştirilmesi için, 250 nM’lik bir nihai konsantrasyona kadar bir SAv çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, SAv fazlalığını en az 5 kez bir tampon (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) ile yıkayarak çıkarın. Bu andan itibaren, foto-değiştirilebilir proteinlerin istenmeyen fotoaktivasyonunu önlemek için numuneleri koruyucu bir kırmızı ışık altında tutun. Kuyuda 1 μM’lik bir nihai konsantrasyona b-disiILD ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Oda sıcaklığında 30 dakika inkübasyondan sonra, en az 5 kez tampon ile yıkayarak fazla proteini çıkarın. 200 nM’lik bir nihai konsantrasyona mOrange-Nano ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve numuneyi alüminyum folyo ile kaplayarak karanlıkta tutun. μ slaytı floresan mikroskobunun altına yerleştirin ve görüntüleme ayarlarını yapın. 552 nm lazeri mOrange-Nano’nun uyarılması için ayarlayın. mOrange sinyalini optimize etmek için emisyon aralığını ayarlayın. disiLID’in fotoaktivasyonu, 2.58 s aralıklarla ışık darbeleri kullanılarak 488 nm’lik bir lazerle elde edilir. 3. GUV’ların Hazırlanması Ultra saf suda 100 mM sükroz ile %5 (a/h) polivinil alkol (PVA, Malzeme Tablosuna bakınız) (MW: 145 000 g/mol) çözeltisi hazırlayın, gece boyunca 80 °C’de 400 rpm’de karıştırın. İstenilen bir bileşime sahip kloroformda bir lipit çözeltisi hazırlayın (nihai konsantrasyon 10 mg / mL). Bu yöntem için 10 mg/mL POPC, 10 mol %1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-(1’-rac-gliserol) (POPG), %2 mol DOPE-biotin ve %1 mol DiD’den oluşan bir bileşim önerilir (bkz. GUV’leri hidrasyon tekniği ile hazırlayın 7,8. İlk olarak, hazırlanan PVA çözeltisinin 40 μL’sini 60 mm x 24 mm’lik bir cam slaytın üzerine, tercihen bir pipet ucu ile homojen ince bir tabaka halinde yayın. Daha sonra ince tabakayı 50 °C’de 30 dakika kurutun. PVA tabakasına bir iğne ile 5 μL lipit çözeltisi yayın ve 30 ° C’de 1 saat kurumaya bırakın. Bir ara parça (~40 mm × 24 mm × 2 mm, Malzeme Tablosuna bakın) ve ikinci bir cam slayt kullanarak işlevselleştirilmiş cam slayt üzerine bir oda monte edin. GUV’ler oluşturmak için oda sıcaklığında 1 saat boyunca hazneye 1 mL rehidrasyon tamponu (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) ekleyin. 1 saat sonra, hazneyi ters çevirin ve bir pipet ucuyla cam yüzeylere hafifçe vurun. İnşa edilmiş hazneyi açmak için bir taraftaki cam sürgüyü dikkatlice çıkarın ve GUV’leri bir pipetle hasat edin. Solüsyonu plastik bir tüpe yerleştirin ve GUV’lerin 2 saat oturmasına izin verin. 4. disiLID işlevselleştirilmiş GUV’lere mOrange-Nano İşe Alım Taze hasat edilmiş GUV’lara bir SAv çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.NOT: disiLID’in fotoaktivasyonunu önlemek için aşağıdaki adımlar koruyucu kırmızı ışıkla gerçekleştirilmelidir. GUVs solüsyonuna 1 μM b-disiLID ekleyin ve numuneyi alüminyum folyo ile kaplayarak 30 dakika karanlıkta bekletin. μ slaytlı 18 oyuklu cam alt hazneyi 150 μL BSA çözeltisi (suda %3 a/h) ile 10 dakika boyunca ön işlemden geçirin. Daha sonra, BSA çözeltisini çıkarın ve kuyuları 3 kez 150 μL ultra saf su ile yıkayın. Kuyuya 145 μL 200 nM mOrange-Nano tampon içinde (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) ekleyin. Daha sonra, çözeltiye b-disiLID ile süslenmiş 5 μL GUV ekleyin ve GUV’lerin çökmesi için ~ 15 dakika bekleyin. μ slaytı konfokal mikroskobun altına yerleştirin. mOrange (λex = 557 nm; λem = 576 nm) floresansını görselleştirmek için numuneyi 552 nm’de ve GUV membranlarında DiD’yi (λex = 644 nm; λem = 665 nm) görselleştirmek için 638 nm’de uyarın. mOrange-Nano alımı, istenmeyen foto ağartma etkilerini en aza indirmek için her 5,3 saniyede bir mavi ışık darbeleri (488 nm, yoğunluk %1) ile tetiklenir.NOT: Uyarma dalga boyları, kullanılan mikroskop tipine göre uyarlanabilir. Mikroskoplar için mevcut olan diğer yaygın uyarma dalga boyları da 532 nm veya 561 nm ve 633 nm, 647 nm, 639 nm veya 640 nm lazerlerdir.