أنماط البروتين الديناميكية المستحثة بالضوء في الأغشية النموذجية
Summary
هنا ، يتم وصف بروتوكول لتوليد أنماط بروتين منظمة بالضوء وقابلة للانعكاس بدقة زمانية مكانية عالية في الأغشية الدهنية الاصطناعية. تتكون الطريقة من التنشيط الضوئي الموضعي للبروتين iLID (dimer المحسن المحرض للضوء) الذي يجمد على أغشية نموذجية ترتبط ، تحت الضوء الأزرق ، ببروتين شريكها Nano (SspB من النوع البري).
Abstract
يؤدي التوطين الدقيق وتنشيط البروتينات في غشاء الخلية في وقت معين إلى ظهور العديد من العمليات الخلوية ، بما في ذلك استقطاب الخلية والهجرة والانقسام. وبالتالي ، فإن طرق تجنيد البروتينات لنمذجة الأغشية ذات الدقة تحت الخلوية والتحكم الزمني العالي ضرورية عند إعادة إنتاج هذه العمليات والتحكم فيها في الخلايا الاصطناعية. هنا ، يتم وصف طريقة لتصنيع أنماط البروتين القابلة للانعكاس المنظمة بالضوء في الأغشية الدهنية بدقة مكانية زمانية عالية. لهذا الغرض ، نقوم بشل حركة البروتين القابل للتبديل الضوئي iLID (دايمر محسن مستحث للضوء) على طبقات الدهون المزدوجة المدعومة (SLBs) وعلى الغشاء الخارجي للحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs). عند إضاءة الضوء الأزرق المحلي ، يرتبط iLID بشريكه Nano (SspB من النوع البري) ويسمح بتوظيف أي بروتين مهم (POI) مدمج في Nano من المحلول إلى المنطقة المضيئة على الغشاء. هذا الربط قابل للعكس في الظلام ، مما يوفر ربطا ديناميكيا وإطلاق POI. بشكل عام ، هذه طريقة مرنة ومتعددة الاستخدامات لتنظيم توطين البروتينات بدقة عالية في المكان والزمان باستخدام الضوء الأزرق.
Introduction
يؤدي تكوين أنماط البروتين على أغشية الخلايا داخل المناطق دون الخلوية إلى العديد من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك الهجرة والانقسام والاتصال الموضعي من خلية إلى خلية 1,2. يتم تنظيم أنماط البروتين هذه في المكان والزمان ، وهي ديناميكية للغاية. يعد تكرار أنماط البروتين هذه في الخلايا الاصطناعية أمرا ضروريا لمحاكاة العمليات الخلوية التي تنشأ عنها ولاكتساب فهم أفضل لكيفية عمل هذا التنظيم على المستوى الجزيئي. على غرار ما لوحظ للأغشية في الخلايا الحية ، يجب أن تلتقط طرق توليد أنماط البروتين على الأغشية الاصطناعية ديناميكياتها وتوفر تحكما زمانيا مكانيا دقيقا.
من بين المحفزات المختلفة ، يبرز الضوء لتوفير أعلى تحكم زماني مكاني والعديد من المزايا الإضافية3. من خلال التنظيم بالضوء ، من السهل إضاءة المنطقة المرغوبة في أي وقت مرغوب فيه بدقة لا مثيل لها. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر الضوء قابلية ضبط عالية حيث يمكن تعديل كل من شدة الضوء وفترات النبض. علاوة على ذلك ، فإن الضوء المرئي غير ضار بالجزيئات الحيوية ، بما في ذلك البروتينات ، ومن الممكن حتى معالجة وظائف متعددة بأطوال موجية مختلفة. ومن ثم ، فإن الأساليب المستجيبة للضوء القائمة على الضوء المرئي تظهر كطرق واعدة للتنظيم الخاضع للرقابة والتعامد لأنماط البروتين في المكان والزمان4،5،6. يوفر استخدام أزواج البروتين القابلة للتبديل الضوئي من علم البصريات الوراثي ، والتي تعمل كثنائي مستحث للضوء ، طريقة مباشرة لتجنيد بروتينات معينة إلى الأغشية. على وجه الخصوص ، تم تشكيل أنماط البروتين بنجاح على الأغشية الاصطناعية باستخدام التفاعل الناجم عن الضوء الأزرق بين iLID (دايمر محسن مستحث للضوء ، استنادا إلى مجال LOV2 القابل للتبديل الضوئي من Avena sativa) و Nano (SspB من النوع البري) 7,8 ، ونظام SpyTag المستحث للضوء الأزرق (BLISS) 9 ، ورباعي البروتين المستجيب للضوء الأخضر CarH10 والتفاعل المستحث للضوء الأحمر بين PhyB و PIF611.
لقد ثبت أن التفاعل الضوئي بين iLID و Nano5 يمكن استخدامه لبروتينات النمط الضوئي على الأغشية النموذجية باستخدام الضوءالأزرق 7. تفاعل iLID / Nano قابل للعكس في الظلام ، ومحدد للغاية ، ويعمل في ظل ظروف فسيولوجية. يتيح تثبيت iLID على نماذج الأغشية الدهنية ، مثل الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) أو طبقات الدهون المزدوجة المدعومة (SLBs) ، تجنيد النانو المنظم بالضوء لهذه الأغشية ، والذي يمكن عكسه في الظلام. والجدير بالذكر أننا لاحظنا أن إدخال مجال مضطرب إلى N-terminus من iLID (مما ينتج عنه بروتين يسمى disiLID) كحبل لغشاء دهني نموذجي يعزز كفاءة توظيف النانو وديناميكيات الارتداد8.
من خلال استخدام تفاعل disiLID / Nano ، قمنا بتطوير طريقة لتوليد أنماط عالية التباين من البروتينات ذات الأهمية النانوية (POI) على SLBs والأغشية الخارجية ل GUVs. تسمح هذه الطريقة بإنشاء أنماط بروتين بدقة مكانية وزمانية ملحوظة وقابلية انعكاس عالية في غضون دقائق. يحدد البروتوكول التفصيلي عملية تجنيد البروتينات محليا على الأغشية الاصطناعية. على وجه التحديد ، يتم تحقيق ذلك عن طريق تجميد نسخة بيوتينيل من disiLID على SLBs و GUVs من خلال تفاعل البيوتين والستربتافيدين (SAv). بعد ذلك ، يتم تجنيد نانو المسمى بالفلورسنت (mOrange-Nano) لهذه الأغشية الوظيفية disiLID تحت إضاءة الضوء الأزرق. يقدم بروتوكولنا التجريبي نهجا مباشرا وقابلا للتكيف لتحقيق توظيف البروتين الموضعي في الأغشية. والأهم من ذلك أن هذه المنهجية لا تقتصر على السطوح البينية SLB و GUV المبلغ عنها أو mOrange-Nano. يمكن أن يمتد إلى مواد وبروتينات أخرى تعمل بنظام disiLID تنصهر في Nano.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد وصفنا طريقة للتجنيد الموضعي لبروتينات mOrange-Nano على الأغشية النموذجية ، مثل طبقة الدهون المزدوجة المدعومة والحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة باستخدام البروتين القابل للتبديل الضوئي disiLID8. تشمل الجوانب التي تساهم في جودة النمط جودة البروتينات بالإضافة إلى الجودة الجيدة ل SLBs و GUVs.
لضمان جودة بروتين جيدة بعد التعبير والتنقية ، من المهم أولا تقييم الخصائص القابلة للتبديل الضوئي ل disiLID. لهذا الغرض ، يجب قياس امتصاص العامل المساعد FMN في الظلام وبعد إضاءة الضوء الأزرق. من المتوقع أن تظهر أطياف الأشعة المرئية وفوق البنفسجية ل disiLID الذروة الثلاثية المميزة للعامل المساعد FMN في الظلام ، والتي تنخفض بشكل كبير عند إضاءة الضوء الأزرق وتتعافى في الظلام13. يعد هذا السلوك القابل للتبديل الضوئي أمرا بالغ الأهمية للحصول على توظيف قابل للتكرار وقابل للعكس في الخطوات التالية. العمل مع الضوء الأحمر الواقي وتعريض disiLID للحد الأدنى من الإضاءة الخارجية أثناء تحضير العينات يزيد من أداء التجارب.
خطوة أخرى حاسمة ، وربما الأكثر أهمية ، هي تشكيل SLBs المناسبة. ستؤثر العيوب في الأغشية و / أو تكوين SLBs غير المتجانسة (أي وجود SLBs متعددة الطبقات أو SLBs المصححة) على جودة نمط البروتين. لذلك ، بالنسبة للمستخدمين عديمي الخبرة ، يوصى بإعادة إنتاج البروتوكول عن طريق تسمية سيارات الدفع الرباعي ببعض أصباغ الغشاء ، مثل DiD و DiO ، من أجل تشكيل SLBs ذات العلامات الفلورية. بهذه الطريقة ، يمكن تمييز خصائص وجودة SLBs بشكل جيد باستخدام الفحص المجهري الفلوري. تمثل قياسات FRAP نهجا نموذجيا لتقييم جودة SLB من خلال تقييم سيولة الأغشية. بدلا من ذلك ، في حالة SLBs البيوتينيلية مثل تلك الموصوفة في هذا البروتوكول ، يمكن استخدام SAv المسمى بالفلورسنت (على سبيل المثال ، Atto 488-SAv) لتصور وتقييم جودة SLBs.
يصف الجزء الأول من البروتوكول تكوين الأنماط على SLBs. لضمان الحصول على أفضل نتيجة ، من المهم إضافة mOrange-Nano إلى SLBs وترك العينة تحضن في الظلام لمدة 15 دقيقة. أثناء التنشيط الضوئي ، لا يقتصر اختيار عائد الاستثمار على حجم معين. ومع ذلك ، يجب تنظيم كثافة الليزر ووقت التعرض من أجل تقليل التبييض الضوئي غير المرغوب فيه للبروتينات الفلورية.
لا تقتصر هذه الطريقة على البروتينات البيوتينيلية ، ويمكن استخدام طرق أخرى لترسيخ disiLID إلى SLBs. على سبيل المثال ، يمكن التعبير عن disiLID الموسوم به وتثبيته على SLBs المحتوية على Ni- NTA. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان التعبير عن Nano و disiLID بعلامات مختلفة لتجنب استبدال البروتينات الموجودة على SLBs. تسمح هذه الطريقة أيضا بإمكانية عكس ترتيب البروتينات ، وبالتالي تشغيل SLBs مع Nano وتجنيد disiLID (أو البروتينات المنصهرة disiLID) عند إضاءة الضوء الأزرق.
للتحكم الديناميكي في توطين البروتين ، يجب أن يكون التوطين العكسي للبروتين في المنطقة المحددة ممكنا بشكل متكرر. لتحقيق ذلك ، يعد تركيز النانو (200 نانومتر) في المحلول معلمة حرجة للحصول على قابلية انعكاس عالية.
مصدر قلق آخر هو تجنيد نانو على سطح GUV الذي يعمل ب disiLID. كما هو الحال في نمط البروتين على SLBs ، يمكن توسيع هذه الطريقة لتشمل استراتيجيات وظيفية مختلفة للأغشية. في هذا البروتوكول ، تمت إضاءة GUV بالكامل بالضوء الأزرق لتجنيد mOrange-Nano على سطح GUV بأكمله. ومع ذلك ، يجب أن يؤدي اختيار عائد الاستثمار الصغير الموضعي على غشاء GUV إلى التوطين الدقيق للبروتينات في منطقة أكثر تقييدا.
لا تقدم هذه الطريقة سوى قيد يتعلق باختيار الفلوروفور المستخدم لتصوير توظيف النانو في غشاء سيارات الدفع الرباعي أو GUVs. على وجه الخصوص ، يجب تجنب الفلوروفورات ذات طيف الإثارة في نطاق الضوء الأزرق ، لأن استخدامها سيتداخل مع التنشيط الضوئي ل (dis) iLID. لذلك ، يوصى باختيار الفلوروفورات في نطاق الضوء الأخضر أو الأحمر (على سبيل المثال ، mOrange أو Cy5) لهذا النوع من التجارب.
يوفر تصميم disiLID طريقة بسيطة وقابلة للتكيف لتحسين توظيف البروتين المحلي للأغشية ويوسع النطاق الديناميكي ل iLID و Nano من علم البصرياتالوراثي 4. تركز هذه الطرق على توظيف النانو على الأغشية المقلدة مثل طبقات الدهون الثنائية و GUVs. ومع ذلك ، فإن هذا النهج قابل للتمديد ليشمل العديد من الأدوات الوراثية البصرية في الخلايا حيث ترتبط (dis) iLID أو Nano بغشاء.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأوروبي ERC بدء منحة الفنان (# 757593 SVW.). يشكر معهد دسمان للسكري مؤسسة ألكسندر فون هومبولت على زمالة ما بعد الدكتوراه.
Materials
| µ-Slide 18 Well | Ibidi | 81817 | For SLB preparation |
| 25 µL Microliter Syringe | Hamilton | Model 702 N | For the preparation of lipid mixture and spreading the lipid solution on the PVA layer |
| Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C | For SUVs preparation |
| CaCl2 (Calcium chloride) | Sigma-Aldrich | C5670 | For SLB formation |
| Cover Slips 24 mm x 60 mm | Engelbrecht | K12460 | For GUVs formation |
| DiD (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'- Tetramethylindodicarbocyanine) |
Thermo Fisher Scientific | D7757 | Membrane dye |
| disiLID | Sequence: MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA IAALGGGGAGPPVGGGGGRGDA GPGSGAASGTVVAAAAGGPGPG AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSGA GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVIT DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK TAFQIAEAANDENYF |
||
| DOPC (1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375P | For SUVs lipid composition |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes |
Merk | EP0030108116-100EA | For collecting freshly made GUVs |
| mOrange-Nano | Sequence: MRGSHHHHHHGSKIEEGKLVI WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP PKTWEEIPALDKELKAKGKSALM FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSA GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA LKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGI EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE GEGEGRPYEGFQTAKLKVTKGG PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYK VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG WEASSERMYPEDGALKGEIKMR LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE QYERAEGRHSTGGMDELYKGG SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA RENGDGVMFEPEEIYDELNIG |
||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | For buffer |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma-Aldrich | 1064980500 | For surface activation in SLB formation |
| POPC (1-Palmitoyl-2- oleoylphosphatidylcholine) |
Avanti Polar Lipids | 850457C | For GUVs lipid composition |
| POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-racglycerol)) | Avanti Polar Lipids | 840457C | For GUVs lipid composition |
| PVA (Polyvinyl alcohol) fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | 8148940101 | For GUVs formation |
| SP8 confocal laser scanning microscope | Leica | ||
| Streptavidin | TermoFisher | 434301 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | For GUVs formation |
| Tris hydrochloride | Sigma-Aldrich | 10812846001 | For buffer |
References
- Kretschmer, S., Schwille, P. Pattern formation on membranes and its role in bacterial cell division. Curr Opin Cell Biol. 38, 52-59 (2016).
- Yang, H. W., Collins, S. R., Meyer, T. Locally excitable Cdc42 signals steer cells during chemotaxis. Nat Cell Biol. 18 (2), 191-201 (2016).
- Caldwell, R. M., et al. Optochemical control of protein localization and activity within cell-like compartments. Biochem. 57 (18), 2590-2596 (2018).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci. 112 (1), 112-117 (2015).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Bartelt, S. M., et al. Dynamic blue light-switchable protein patterns on giant unilamellar vesicles. Chem Commun. 54 (8), 948-951 (2018).
- Di Iorio, D., Bergmann, J., Higashi, S. L., Hoffmann, A., Wegner, S. V. A disordered tether to iLID improves photoswitchable protein patterning on model membranes. Chem. Commun. 59 (29), 4380-4383 (2023).
- Hartzell, E. J., Terr, J., Chen, W. Engineering a blue light inducible Spytag system (BLISS). J Am Chem Soc. 143 (23), 8572-8577 (2021).
- Xu, D., Bartelt, S. M., Rasoulinejad, S., Chen, F., Wegner, S. V. Green light lithography: a general strategy to create active protein and cell micropatterns. Mater Horiz. 6 (6), 1222-1229 (2019).
- Jia, H., et al. Light-induced printing of protein structures on membranes in vitro. Nano Lett. 18 (11), 7133-7140 (2018).
- Di Iorio, D., Verheijden, M. L., vander Vries, E., Jonkheijm, P., Huskens, J. Weak Multivalent Binding of influenza hemagglutinin nanoparticles at a sialoglycan-functionalized supported lipid bilayer. ACS Nano. 13 (3), 3413-3423 (2019).
- Kasahara, M., Torii, M., Fujita, A., Tainaka, K. FMN binding and photochemical properties of plant putative photoreceptors containing two LOV domains, LOV/LOV proteins. J Biol Chem. 285 (45), 34765-34772 (2010).
