Motifs protéiques dynamiques induits par la lumière au niveau de membranes modèles

1. Préparation expérimentale Exprimer et purifier le biotinylated-disiLID (b-disiLID) et le mOrange-Nano (voir le tableau des matériaux) en suivant les procédures précédemment rapportées 7,8. Préparez des mélanges de lipides dans des flacons en verre avec la composition et les concentrations de lipides sélectionnées. Tout d’abord, dissoudre les lipides dans le chloroforme pour obtenir une solution lipidique finale avec une concentration de 1 mg/mL.Mélanger les lipides afin d’obtenir une composition de 94,9 % molaire de sel sodique de 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), de 5 % molaire de sel de sodium 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamineN-(cap biotinyl) (DOPE-biotine) et de 0,1 % molaire de 1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindodicarbocyanine (DiD) (voir tableau des matériaux).REMARQUE : Le mélange lipidique peut être ajusté avec des rapports variables et une concentration DOPE-biotine et/ou différents colorants membranaires. La concentration recommandée de DOPE-biotine (5 % molaire) permet la formation d’une couche de streptavidine à haute densité (SAv) dans les étapes suivantes. Préparez de petites vésicules unilamellaires (SUV) en suivant les méthodes précédemment rapportées 7,8,12. Pour cette étape, il est recommandé de préparer des SUV d’un diamètre ≤100 nm. Pour cette étude, la méthode de sonication est utilisée. Tout d’abord, évaporez la solution de chloroforme dans le flacon en verre avec un flux d’azote tout en faisant tourner les flacons afin de former une fine pellicule lipidique. Ensuite, retirez le chloroforme résiduel pendant au moins 1 h sous vide.Réhydrater le film séché dans de l’eau ultrapure avec une concentration finale de 1 mg/mL de lipides par vortex. Enfin, sonicez la solution obtenue pendant 10 minutes jusqu’à ce que la solution opaque devienne claire.REMARQUE : Conservez le mélange de lipides dans un tube de microcentrifugation au réfrigérateur pendant un maximum de 2 semaines. Différentes méthodes de préparation des SUV (par exemple, la méthode d’extrusion) peuvent également être utilisées tant que la taille des SUV finaux est ≤ 100 nm. 2. Recrutement de mOrange-Nano pour les SLB fonctionnalisés disiLID Ajouter 150 μL de NaOH 2 M dans chaque puits de la chambre à fond de verre à 18 puits à μ-lames (voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, retirez le NaOH et lavez les puits 3 à 5 fois d’abord avec de l’eau ultrapure de 150 μL, puis 3 fois avec un tampon de 150 μL (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM de NaCl) contenant 10 mM de CaCl2. Ajouter 15 μL de SUV fraîchement préparés (concentration de stock de 1 mg/mL dans l’eau) dans les puits contenant 150 μL de tampon avec 10 mM de CaCl2 afin d’avoir environ un facteur 10 de dilution des SUV dans le tampon. Laissez les SUV incuber pendant 30 min à température ambiante. Après le temps d’incubation, des SLB-biotinylés se formeront. Lavez les SLB au moins 7 fois avec un tampon (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) sans CaCl2 en retirant d’abord la solution et en ajoutant ensuite un nouveau tampon à chaque étape. Il est recommandé d’utiliser 80 μL de tampon pour chaque étape de lavage.REMARQUE : Un lavage optimal des SLB est obtenu en pipetant la solution fraîche de haut en bas plusieurs fois sans toucher la surface. Le pipetage de la solution dans les puits contenant les SLB nouvellement formés doit être doux afin de réduire la formation de petites bulles d’air qui endommageraient les SLB formés. À partir de ce moment, les puits doivent contenir un volume suffisant de tampon afin d’éviter le dessèchement des SLB. Pour la fonctionnalisation ultérieure des SLB biotinylés avec SAv, ajouter une solution de SAv à une concentration finale de 250 nM et incuber pendant 30 min à température ambiante. Par la suite, éliminez l’excès de SAv en le lavant avec un tampon (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) au moins 5 fois. À partir de ce moment, conservez les échantillons sous une lumière rouge protectrice afin d’éviter la photoactivation indésirable de protéines photocommutables. Ajouter b-disiILD (voir tableau des matériaux) à une concentration finale de 1 μM dans le puits. Après 30 minutes d’incubation à température ambiante, éliminez l’excès de protéines en les lavant au moins 5 fois avec un tampon. Ajouter mOrange-Nano (voir tableau des matériaux) à une concentration finale de 200 nM et maintenir l’échantillon dans l’obscurité en le recouvrant d’une feuille d’aluminium. Placez la lame μ sous le microscope à fluorescence et ajustez les paramètres d’imagerie. Réglez le laser 552 nm pour l’excitation de mOrange-Nano. Ajustez la plage d’émission pour optimiser le signal mOrange. La photoactivation de disiLID est réalisée à l’aide d’un laser de 488 nm, à l’aide d’impulsions lumineuses espacées de 2,58 s. 3. Préparation des GUV Préparer une solution à 5 % (p/v) d’alcool polyvinylique (PVA, voir tableau des matières) (MW : 145 000 g/mol) avec 100 mM de saccharose dans de l’eau ultrapure, en mélangeant pendant une nuit à 80 °C à 400 tr/min. Préparer une solution lipidique dans du chloroforme avec la composition souhaitée (concentration finale 10 mg/mL). Pour cette méthode, il est recommandé d’utiliser une composition composée de 10 mg/mL de POPC, de 10 % molaires de 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1′-rac-glycérol) (POPG), de 2 % molaires de DOPE-biotine et de 1 % molaire de DiD (voir le tableau des matériaux). Préparez les GUV avec la technique d’hydratation 7,8. Tout d’abord, étalez 40 μL de la solution de PVA préparée sous la forme d’une couche mince homogène sur une lame de verre de 60 mm x 24 mm, de préférence à l’aide d’une pointe de pipette. Ensuite, séchez la fine couche à 50 °C pendant 30 min. Étaler 5 μL de la solution lipidique à l’aide d’une aiguille sur la couche de PVA et laisser sécher à 30 °C pendant 1 h. Assemblez une chambre sur la lame de verre fonctionnalisée à l’aide d’une entretoise (~40 mm × 24 mm × 2 mm, voir tableau des matériaux) et d’une seconde lame de verre. Ajouter 1 mL de tampon de réhydratation (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) dans la chambre pendant 1 h à température ambiante pour former des GUV. Après 1 h, retournez la chambre et tapotez doucement sur les surfaces en verre avec une pointe de pipette. Retirez délicatement la lame de verre d’un côté pour ouvrir la chambre construite et récoltez les GUV à l’aide d’une pipette. Placez la solution dans un tube en plastique et laissez les GUVs se déstabiliser pendant 2 h. 4. Recrutement de mOrange-Nano pour les GUVs fonctionnalisés disiLID Ajoutez une solution de SAv aux GUVs fraîchement récoltés et laissez reposer pendant 30 min à température ambiante.REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées avec une lumière rouge de protection afin d’éviter la photoactivation du disiLID. Ajouter 1 μM de b-disiLID à la solution de GUVs et placer l’échantillon pendant 30 min dans l’obscurité, en le recouvrant d’une feuille d’aluminium. Prétraiter une chambre à fond en verre de 18 puits à μ lames avec une solution BSA de 150 μL (3 % p/v dans l’eau) pendant 10 min. Ensuite, retirez la solution BSA et lavez les puits avec de l’eau ultrapure de 150 μL 3 fois. Ajouter 145 μL de tampon 200 nM mOrange-Nano (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) dans le puits. Ensuite, ajoutez 5 μL de GUVs décorés de b-disiLID à la solution et attendez ~15 min pour que les GUVs se déposent. Placez la lame μ sous le microscope confocal. Excité l’échantillon à 552 nm pour visualiser la fluorescence mOrange (λex = 557 nm ; λem = 576 nm) et à 638 nm pour visualiser DiD (λex = 644 nm ; λem = 665 nm) dans les membranes GUV. Le recrutement mOrange-Nano est déclenché par des impulsions de lumière bleue (488 nm, intensité 1%) toutes les 5,3 s afin de minimiser les effets indésirables de photoblanchiment.REMARQUE : Les longueurs d’onde d’excitation peuvent être adaptées en fonction du type de microscope utilisé. D’autres longueurs d’onde d’excitation courantes disponibles pour les microscopes sont également les lasers de 532 nm ou 561 nm et de 633 nm, 647 nm, 639 nm ou 640 nm.