תבניות דינמיות של חלבונים המושרים על ידי אור בממברנות המודל
Summary
כאן, מתואר פרוטוקול ליצירת תבניות חלבון מווסתות אור והפיכות עם דיוק מרחבי-זמני גבוה בקרומי שומנים מלאכותיים. השיטה מורכבת מפוטואקטיבציה מקומית של החלבון iLID (דימר משופר המושרה באור) המשותק על קרומי המודל אשר, תחת אור כחול, נקשר לחלבון השותף שלו ננו (SspB מסוג פראי).
Abstract
הלוקליזציה והשפעול המדויקים של חלבונים בקרום התא בזמן מסוים מעוררים תהליכים תאיים רבים, כולל קיטוב התא, נדידה וחלוקה. לפיכך, שיטות לגייס חלבונים למדל ממברנות עם רזולוציה תת-תאית ובקרת זמן גבוהה חיוניות בעת שכפול ובקרה של תהליכים כאלה בתאים סינתטיים. כאן מתוארת שיטה לייצור תבניות חלבון הפיכות מווסתות אור בקרומי שומנים בדיוק מרחבי-זמני גבוה. למטרה זו, אנו משתקים את החלבון iLID (דימר משופר המושרה באור) על דו-שכבות שומנים נתמכות (SLBs) ועל הממברנה החיצונית של שלפוחיות חד-לאומיות ענקיות (GUV). עם הדלקת אור כחול מקומית, iLID נקשר לשותפו ננו (SspB מסוג פרא) ומאפשר גיוס של כל חלבון מעניין (POI) המאוחה לננו מהתמיסה לאזור המואר על הממברנה. כריכה זו הפיכה בחושך, המספקת קשירה ושחרור דינמיים של נקודת העניין. בסך הכל, זוהי שיטה גמישה ורב-תכליתית לוויסות לוקליזציה של חלבונים בדיוק גבוה במרחב ובזמן באמצעות אור כחול.
Introduction
היווצרות תבניות חלבונים על קרום התא באזורים תת-תאיים מולידה תהליכים ביולוגיים רבים, כולל נדידה, חלוקה ותקשורת מקומית בין תאים 1,2. תבניות חלבונים אלה מווסתות במרחב ובזמן, והן דינמיות מאוד. שכפול תבניות חלבונים כאלה בתאים סינתטיים חיוני לחיקוי תהליכים תאיים הנובעים מהם ולהבנה טובה יותר של האופן שבו ויסות כזה פועל ברמה המולקולרית. בדומה למה שנצפה עבור ממברנות בתאים חיים, שיטות ליצירת תבניות חלבונים על ממברנות מלאכותיות חייבות ללכוד את הדינמיקה שלהם ולספק שליטה מרחבית-זמנית מדויקת.
בין הגירויים השונים, האור בולט במתן השליטה המרחבית-זמנית הגבוהה ביותר ומספר יתרונות נוספים3. באמצעות ויסות עם אור, קל להאיר אזור רצוי בכל זמן רצוי בדיוק שאין שני לו. בנוסף, האור מספק יכולת כוונון גבוהה מכיוון שניתן לכוונן הן את עוצמת האור והן את משך הדופק. יתר על כן, האור הנראה אינו מזיק לביומולקולות, כולל חלבונים, וניתן אפילו לטפל בפונקציות מרובות באורכי גל שונים. לפיכך, גישות תגובתיות לאור המבוססות על האור הנראה מתגלות כדרכים מבטיחות לוויסות מבוקר ודו-אורתוגונלי של תבניות חלבונים במרחב ובזמן 4,5,6. שימוש בזוגות חלבונים פוטו-סוויג’יים מאופטוגנטיקה, הפועלים כדימריזרים מעוררי אור, מספק שיטה פשוטה לגיוס חלבונים ספציפיים לממברנות. בפרט, תבניות חלבונים נוצרו בהצלחה על ממברנות מלאכותיות באמצעות אינטראקציה המופעלת על ידי אור כחול בין iLID (דימר משופר המושרה לאור, המבוסס על תחום LOV2 הניתן למיתוג מ– Avena sativa) ו- Nano (SspB מסוג פראי) 7,8, מערכת SpyTag המושרה לאור כחול (BLISS)9, טטרמר החלבון המגיב לאור ירוק CarH10 והאינטראקציה המושרה לאור אדום בין PhyB ו- PIF611.
הוכח כי ניתן להשתמש באינטראקציה הניתנת להחלפה בין iLID ו- Nano5 להחלפת חלבונים בתבנית צילום על קרומי מודל באמצעות אור כחול7. האינטראקציה iLID/Nano הפיכה בחושך, ספציפית מאוד, ופועלת בתנאים פיזיולוגיים. עיגון iLID למודלים של ממברנות ליפידים, כגון שלפוחיות חד-למלריות ענקיות (GUVs) או דו-שכבות ליפידים נתמכות (SLBs), מאפשר גיוס מווסת אור של ננו לממברנות אלה, דבר הפיך בחושך. יש לציין כי ראינו כי החדרת תחום לא מסודר ל-N-terminus של iLID (וכתוצאה מכך חלבון בשם disiLID) כקשירה לממברנת שומנים מודל משפרת את יעילות הגיוס של Nano ואת דינמיקת ההמרה8.
על ידי שימוש באינטראקציית disiLID/Nano, פיתחנו שיטה ליצירת תבניות ניגודיות גבוהה של חלבוני עניין (POI) המותחים ננו על SLB ועל הממברנות החיצוניות של GUVs. שיטה זו מאפשרת יצירת תבניות חלבון ברזולוציה מרחבית וזמנית יוצאת דופן והפיכות גבוהה תוך דקות. הפרוטוקול המפורט מתאר את תהליך הגיוס המקומי של חלבונים על גבי ממברנות מלאכותיות. באופן ספציפי, זה מושג על ידי השתקת גרסה biotinylated של disiLID על SLBs ו- GUV באמצעות אינטראקציה ביוטין-סטרפטאבידין (SAv). לאחר מכן, ננו (mOrange-Nano) המסומן באופן פלואורסצנטי מגויס לממברנות מתפקדות אלה תחת תאורת אור כחול. פרוטוקול הניסוי שלנו מציע גישה פשוטה וניתנת להתאמה להשגת גיוס חלבון מקומי לממברנות. חשוב לציין, מתודולוגיה זו אינה מוגבלת לממשקי SLB ו- GUV המדווחים או mOrange-Nano; ניתן להרחיב אותו לחומרים אחרים הפונקציונליים של disiLID ולחלבונים המאוחים לנאנו.
Protocol
Representative Results
Discussion
תיארנו שיטה לגיוס מקומי של חלבוני mOrange-Nano על ממברנות מודל, כגון דו-שכבתית ליפידית נתמכת ובועיות חד-למלריות ענקיות באמצעות החלבון disiLID8 הניתן לפוטו-החלפה. היבטים התורמים לאיכות התבנית כוללים את איכות החלבונים, כמו גם את האיכות הטובה של SLBs ו- GUVs.
כדי להבטיח איכות חלבון טובה לאחר ביטוי וטיהור, חשוב להעריך תחילה את התכונות הניתנות למיתוג של disiLID. לשם כך, יש למדוד את ספיגת הקו-פקטור FMN בחושך ולאחר הדלקת אור כחול. ספקטרום UV-Vis של disiLID צפוי להראות את השיא המשולש האופייני של הקו-פקטור FMN בחושך, אשר יורד משמעותית עם תאורת האור הכחול ומתאושש בחושך13. התנהגות פוטו-סוויץ’ זו חיונית להשגת גיוס ניתן לשחזור והפיך בשלבים הבאים. עבודה עם אור אדום מגן וחשיפת disiLID לתאורה חיצונית מינימלית במהלך הכנת הדגימות מגדילה את ביצועי הניסויים.
צעד קריטי נוסף, ואולי החשוב ביותר, הוא היווצרות SLBs תקינים. פגמים בקרומים ו/או היווצרות SLBs לא הומוגניים (כלומר, נוכחות של SLB רב-שכבתי או טלאי) ישפיעו על איכות תבנית החלבון. לכן, למשתמשים חסרי ניסיון, מומלץ לשחזר את הפרוטוקול על ידי תיוג רכבי השטח עם כמה צבעי ממברנה, כגון DiD ו- DiO, על מנת ליצור SLB מסומן פלואורסצנטית. בדרך זו, המאפיינים והאיכות של SLBs יכול להיות מאופיין היטב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מדידות FRAP מייצגות גישה טיפוסית להערכת האיכות של SLB על ידי הערכת נזילות הממברנות. לחלופין, במקרה של SLB ביוטינילציה כמו אלה המתוארים בפרוטוקול זה, ניתן להשתמש ב- SAv המסומן באופן פלואורסצנטי (למשל, Atto 488-SAv) כדי להמחיש ולהעריך את האיכות של SLBs.
החלק הראשון של הפרוטוקול מתאר את היווצרות הדפוסים על SLBs. כדי להבטיח תוצאה אופטימלית, חשוב להוסיף mOrange-Nano על SLBs ולתת לדגימה לדגור בחושך במשך 15 דקות. במהלך הפוטואקטיבציה, בחירת החזר ההשקעה אינה מוגבלת לגודל מסוים. עם זאת, יש לווסת את עוצמת הלייזר ואת זמן החשיפה על מנת להפחית הלבנה לא רצויה של החלבונים הפלואורסצנטיים.
שיטה זו אינה מוגבלת לחלבונים ביוטינילטים, וניתן להשתמש בגישות אחרות כדי לעגן disiLID ל-SLBs. לדוגמה, ניתן לבטא את disiLID המתויג שלו ולעגן אותו על SLB המכיל Ni- NTA. עם זאת, חשוב לבטא Nano ו- disiLID עם תגים שונים על מנת למנוע החלפה של החלבונים על SLBs. שיטה זו מאפשרת גם את האפשרות להפוך את סדר החלבונים, ובכך לתפקד SLBs עם ננו ולגייס disiLID (או חלבונים המותכים disiLID) על הארת אור כחול.
לבקרה דינמית של לוקליזציה של חלבונים, לוקליזציה הפיכה של החלבון לאזור שנבחר צריכה להיות אפשרית שוב ושוב. כדי להשיג זאת, ריכוז ננו (200 ננומטר) בתמיסה הוא פרמטר קריטי להשגת הפיכות גבוהה.
חשש נוסף הוא הגיוס של ננו למשטח ה-GUV המתפקד ב-disiLID. כמו במקרה של דפוס חלבונים על SLBs, שיטה זו יכולה להיות מורחבת לאסטרטגיות פונקציונליות ממברנה שונות. בפרוטוקול זה, ה-GUV כולו הואר באור כחול כדי לגייס mOrange-Nano על כל משטח ה-GUV. עם זאת, הבחירה של ROI קטן הממוקם על קרום GUV צריך להוביל לוקליזציה מדויקת של חלבונים באזור מוגבל יותר.
שיטה זו מציגה רק מגבלה הקשורה לבחירת הפלואורופור המשמש להדמיית גיוס הנאנו בקרום רכבי השטח או ה-GUV. בפרט, יש להימנע מפלואורופורים עם ספקטרום עירור בטווח האור הכחול, מכיוון שהשימוש בהם יפריע לפוטואקטיבציה של (dis)iLID. לכן, הבחירה של פלואורופורים בתחום האור הירוק או האדום (למשל, mOrange או Cy5) מומלצת עבור סוג זה של ניסוי.
עיצוב disiLID מציע דרך פשוטה וניתנת להתאמה לשיפור גיוס החלבונים המקומי לממברנות ומרחיב את הטווח הדינמי של iLID ו- Nano מאופטוגנטיקה4. שיטות אלה מתמקדות בגיוס ננו לחקות ממברנות כגון דו-שכבות שומנים ו-GUV. עם זאת, גישה זו ניתנת להרחבה לכלים אופטוגנטיים רבים בתאים שבהם (dis)iLID או Nano קשורים לממברנה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר האירופית ERC Starting Grant ARTIST (# 757593 S.V.W). DDI מודה לקרן אלכסנדר פון הומבולדט על מלגת פוסט-דוקטורט.
Materials
| µ-Slide 18 Well | Ibidi | 81817 | For SLB preparation |
| 25 µL Microliter Syringe | Hamilton | Model 702 N | For the preparation of lipid mixture and spreading the lipid solution on the PVA layer |
| Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C | For SUVs preparation |
| CaCl2 (Calcium chloride) | Sigma-Aldrich | C5670 | For SLB formation |
| Cover Slips 24 mm x 60 mm | Engelbrecht | K12460 | For GUVs formation |
| DiD (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'- Tetramethylindodicarbocyanine) |
Thermo Fisher Scientific | D7757 | Membrane dye |
| disiLID | Sequence: MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA IAALGGGGAGPPVGGGGGRGDA GPGSGAASGTVVAAAAGGPGPG AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSGA GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVIT DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK TAFQIAEAANDENYF |
||
| DOPC (1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375P | For SUVs lipid composition |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes |
Merk | EP0030108116-100EA | For collecting freshly made GUVs |
| mOrange-Nano | Sequence: MRGSHHHHHHGSKIEEGKLVI WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP PKTWEEIPALDKELKAKGKSALM FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSA GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA LKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGI EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE GEGEGRPYEGFQTAKLKVTKGG PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYK VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG WEASSERMYPEDGALKGEIKMR LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE QYERAEGRHSTGGMDELYKGG SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA RENGDGVMFEPEEIYDELNIG |
||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | For buffer |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma-Aldrich | 1064980500 | For surface activation in SLB formation |
| POPC (1-Palmitoyl-2- oleoylphosphatidylcholine) |
Avanti Polar Lipids | 850457C | For GUVs lipid composition |
| POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-racglycerol)) | Avanti Polar Lipids | 840457C | For GUVs lipid composition |
| PVA (Polyvinyl alcohol) fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | 8148940101 | For GUVs formation |
| SP8 confocal laser scanning microscope | Leica | ||
| Streptavidin | TermoFisher | 434301 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | For GUVs formation |
| Tris hydrochloride | Sigma-Aldrich | 10812846001 | For buffer |
References
- Kretschmer, S., Schwille, P. Pattern formation on membranes and its role in bacterial cell division. Curr Opin Cell Biol. 38, 52-59 (2016).
- Yang, H. W., Collins, S. R., Meyer, T. Locally excitable Cdc42 signals steer cells during chemotaxis. Nat Cell Biol. 18 (2), 191-201 (2016).
- Caldwell, R. M., et al. Optochemical control of protein localization and activity within cell-like compartments. Biochem. 57 (18), 2590-2596 (2018).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci. 112 (1), 112-117 (2015).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Bartelt, S. M., et al. Dynamic blue light-switchable protein patterns on giant unilamellar vesicles. Chem Commun. 54 (8), 948-951 (2018).
- Di Iorio, D., Bergmann, J., Higashi, S. L., Hoffmann, A., Wegner, S. V. A disordered tether to iLID improves photoswitchable protein patterning on model membranes. Chem. Commun. 59 (29), 4380-4383 (2023).
- Hartzell, E. J., Terr, J., Chen, W. Engineering a blue light inducible Spytag system (BLISS). J Am Chem Soc. 143 (23), 8572-8577 (2021).
- Xu, D., Bartelt, S. M., Rasoulinejad, S., Chen, F., Wegner, S. V. Green light lithography: a general strategy to create active protein and cell micropatterns. Mater Horiz. 6 (6), 1222-1229 (2019).
- Jia, H., et al. Light-induced printing of protein structures on membranes in vitro. Nano Lett. 18 (11), 7133-7140 (2018).
- Di Iorio, D., Verheijden, M. L., vander Vries, E., Jonkheijm, P., Huskens, J. Weak Multivalent Binding of influenza hemagglutinin nanoparticles at a sialoglycan-functionalized supported lipid bilayer. ACS Nano. 13 (3), 3413-3423 (2019).
- Kasahara, M., Torii, M., Fujita, A., Tainaka, K. FMN binding and photochemical properties of plant putative photoreceptors containing two LOV domains, LOV/LOV proteins. J Biol Chem. 285 (45), 34765-34772 (2010).
