Dynamische door licht geïnduceerde eiwitpatronen bij modelmembranen

1. Experimentele voorbereiding Druk biotinylated-disiLID (b-disiLID) en mOrange-Nano (zie materiaaltabel) uit en zuiver ze door eerder gerapporteerde procedures 7,8 te volgen. Bereid lipidenmengsels in glazen injectieflacons met de geselecteerde lipidensamenstelling en -concentraties. Los eerst lipiden op in chloroform om een uiteindelijke lipidenoplossing te verkrijgen met een concentratie van 1 mg/ml.Meng lipiden om een samenstelling te verkrijgen van 94,9 mol% 2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC), 5 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamineN-(cap biotinyl) natriumzout (DOPE-biotine) en 0,1 mol% 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine (DiD) (zie materiaaltabel).OPMERKING: Het lipidenmengsel kan worden aangepast met verschillende verhoudingen en DOPE-biotineconcentratie en/of verschillende membraankleurstoffen. De aanbevolen DOPE-biotineconcentratie (5 mol%) maakt de vorming van een Streptavidin (SAv)-laag met hoge dichtheid mogelijk in de volgende stappen. Bereid kleine unilamellaire blaasjes (SUV’s) voor volgens eerder gerapporteerde methoden 7,8,12. Voor deze stap wordt aanbevolen om SUV’s met een diameter ≤100 nm voor te bereiden. Voor deze studie wordt de sonicatiemethode gebruikt. Verdamp eerst de chloroformoplossing in de glazen injectieflacon met een stikstofstroom terwijl u de injectieflacons draait om een dunne lipidenfilm te vormen. Verwijder vervolgens de resterende chloroform gedurende minimaal 1 uur onder vacuüm.Rehydrateer de gedroogde film in ultrapuur water met een eindconcentratie van 1 mg/ml lipiden door middel van vortexen. Sonificeer ten slotte de verkregen oplossing gedurende 10 minuten totdat de ondoorzichtige oplossing helder wordt.OPMERKING: Bewaar het lipidenmengsel maximaal 2 weken in een microcentrifugebuisje in de koelkast. Er kunnen ook verschillende SUV-bereidingsmethoden (bijv. extrusiemethode) worden gebruikt, zolang de grootte van de uiteindelijke SUV’s ≤ 100 nm is. 2. mOrange-Nano rekrutering om gefunctionaliseerde SLB’s te disiLID Voeg 150 μl 2 M NaOH toe aan elk putje van de μ-glaasje 18-wells glazen bodemkamer (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de NaOH en was de putjes 3-5 keer, eerst met 150 μL ultrapuur water en vervolgens 3 keer met 150 μL buffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) met 10 mM CaCl2. Voeg 15 μL vers bereide SUV’s (bouillonconcentratie 1 mg/ml in water) toe aan de putjes met een buffer van 150 μl met 10 mM CaCl2 om ongeveer een verdunning van SUV’s met factor 10 in de buffer te hebben. Laat de SUV’s 30 minuten op kamertemperatuur incuberen. Na de incubatietijd worden gebiotinyleerde SLB’s gevormd. Was de SLB’s minstens 7 keer met buffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) zonder CaCl2 door eerst de oplossing te verwijderen en vervolgens in elke stap verse buffer toe te voegen. Het wordt aanbevolen om 80 μL buffer te gebruiken voor elke wasstap.OPMERKING: Een optimale wassing van de SLB’s wordt verkregen door verse oplossing meerdere keren op en neer te pipetteren zonder het oppervlak aan te raken. Het pipetteren van de oplossing in de putjes met de nieuw gevormde SLB’s moet voorzichtig zijn om de vorming van kleine luchtbelletjes te verminderen die de gevormde SLB’s zouden beschadigen. Vanaf dit moment moeten putten voldoende buffer bevatten om te voorkomen dat de SLB’s uitdrogen. Voor de verdere functionalisering van de gebiotinyleerde SLB’s met SAv voegt u een oplossing van SAv toe tot een eindconcentratie van 250 nM en incubeert u gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het teveel aan SAv door het minstens 5 keer te wassen met een buffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl). Bewaar de monsters vanaf dit moment onder een beschermend rood licht om ongewenste fotoactivering van fotoschakelbare eiwitten te voorkomen. Voeg b-disiILD (zie materiaaltabel) toe tot een eindconcentratie van 1 μM in de put. Verwijder na 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur het overtollige eiwit door minimaal 5 keer met buffer te wassen. Voeg mOrange-Nano (zie Materiaaltabel) toe tot een eindconcentratie van 200 nM en houd het monster in het donker door het af te dekken met aluminiumfolie. Plaats het μ-glaasje onder de fluorescentiemicroscoop en pas de beeldvormingsinstellingen aan. Stel de 552 nm laser in voor excitatie van mOrange-Nano. Pas het zendbereik aan om het mOrange-signaal te optimaliseren. De fotoactivering van disiLID wordt bereikt met een laser van 488 nm, met behulp van lichtpulsen met intervallen van 2,58 s. 3. Voorbereiding van GUV’s Bereid een 5% (m/v) oplossing van polyvinylalcohol (PVA, zie materiaaltabel) (MW: 145 000 g/mol) met 100 mM sucrose in ultrapuur water en meng deze gedurende een nacht bij 80 °C bij 400 omw/min. Bereid een lipideoplossing in chloroform met de gewenste samenstelling (eindconcentratie 10 mg/ml). Voor deze methode wordt een samenstelling aanbevolen die bestaat uit 10 mg/ml POPC, 10 mol% 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-(1′-rac-glycerol) (POPG), 2 mol% DOPE-biotine en 1 mol% DiD (zie materiaaltabel). Bereid GUV’s voor met de hydratatietechniek 7,8. Verdeel eerst 40 μL van de bereide PVA-oplossing als een homogene dunne laag op een glasplaatje van 60 mm x 24 mm, bij voorkeur met een pipetpunt. Droog vervolgens de dunne laag 30 minuten bij 50 °C. Smeer 5 μL van de lipidenoplossing met een naald op de PVA-laag en laat 1 uur drogen bij 30 °C. Monteer een kamer op de gefunctionaliseerde glasplaat met behulp van een afstandhouder (~40 mm × 24 mm × 2 mm, zie Materiaaltabel) en een tweede glasplaatje. Voeg 1 ml rehydratatiebuffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) toe aan de kamer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om GUV’s te vormen. Keer na 1 uur de kamer om en tik zachtjes met een pipetpunt op de glasoppervlakken. Verwijder voorzichtig het glasplaatje aan één kant om de gebouwde kamer te openen en oogst de GUV’s met een pipet. Doe de oplossing in een plastic buisje en laat de GUV’s 2 uur bezinken. 4. mOrange-Nano Recruitment om gefunctionaliseerde GUV’s te onderscheiden Voeg een oplossing van SAv toe aan de vers geoogste GUV’s en laat 30 minuten op kamertemperatuur staan.OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met beschermend rood licht om fotoactivering van disiLID te voorkomen. Voeg 1 μM b-disiLID toe aan de GUV-oplossing en plaats het monster 30 minuten in het donker en dek het af met aluminiumfolie. Behandel een glazen bodemkamer met 18 putjes μ glaasjes gedurende 10 minuten met 150 μL BSA-oplossing (3% m/v in water). Verwijder vervolgens de BSA-oplossing en was de putjes 3 keer met 150 μL ultrapuur water. Voeg 145 μL 200 nM mOrange-Nano in buffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) toe aan het putje. Voeg vervolgens 5 μL GUV’s versierd met b-disiLID toe aan de oplossing en wacht ~15 minuten totdat de GUV’s zijn bezonken. Plaats het μ-glaasje onder de confocale microscoop. Prikkel het monster bij 552 nm om mOrange (λex = 557 nm; λem = 576 nm) fluorescentie te visualiseren en bij 638 nm om DiD (λex = 644 nm; λem = 665 nm) in de GUV-membranen te visualiseren. De mOrange-Nano-rekrutering wordt elke 5,3 s geactiveerd met blauwlichtpulsen (488 nm, intensiteit 1%) om ongewenste fotobleekeffecten te minimaliseren.OPMERKING: De excitatiegolflengten kunnen worden aangepast op basis van het type microscoop dat wordt gebruikt. Andere veel voorkomende excitatiegolflengten die beschikbaar zijn voor microscopen zijn ook 532 nm of 561 nm en 633 nm, 647 nm, 639 nm of 640 nm lasers.