Динамические световые паттерны белков на модельных мембранах
Summary
Здесь описан протокол генерации светорегулируемых и обратимых белковых паттернов с высокой пространственно-временной точностью на искусственных липидных мембранах. Метод заключается в локализованной фотоактивации иммобилизованного на модельных мембранах белка iLID (улучшенного светоиндуцируемого димера), который под действием синего света связывается со своим партнерским белком Nano (дикий тип SspB).
Abstract
Точная локализация и активация белков на клеточной мембране в определенное время приводит к возникновению многих клеточных процессов, включая поляризацию клеток, миграцию и деление. Таким образом, методы рекрутирования белков для моделирования мембран с субклеточным разрешением и высоким временным контролем имеют важное значение при воспроизведении и контроле таких процессов в синтетических клетках. В данной работе описан способ получения светорегулируемых обратимых белковых паттернов на липидных мембранах с высокой пространственно-временной точностью. С этой целью мы иммобилизуем фотопереключаемый белок iLID (улучшенный димер, индуцируемый светом) на поддерживаемых липидных бислоях (SLB) и на внешней мембране гигантских униламеллярных везикул (GUV). При локальном освещении синим светом iLID связывается со своим партнером Nano (SspB дикого типа) и позволяет рекрутировать любой представляющий интерес белок (POI), слитый с Nano, из раствора в освещенную область мембраны. Эта привязка является обратимой в темноте, что обеспечивает динамическую привязку и освобождение POI. В целом, это гибкий и универсальный метод регулирования локализации белков с высокой точностью в пространстве и времени с помощью синего света.
Introduction
Формирование белковых узоров на клеточных мембранах в субклеточных областях приводит к многочисленным биологическим процессам, включая миграцию, деление и локализованную межклеточную коммуникацию 1,2. Эти белковые паттерны регулируются в пространстве и времени и очень динамичны. Репликация таких белковых паттернов в синтетических клетках имеет важное значение для имитации клеточных процессов, которые возникают из них, и для лучшего понимания того, как такая регуляция работает на молекулярном уровне. Аналогично тому, что наблюдается в отношении мембран в живых клетках, методы генерации белковых узоров на искусственных мембранах должны отражать их динамику и обеспечивать точный пространственно-временной контроль.
Среди различных стимулов свет выделяется тем, что обеспечивает наивысший пространственно-временной контроль и имеет ряд дополнительных преимуществ3. Благодаря регулированию с помощью света можно легко осветить нужную область в любое желаемое время с непревзойденной точностью. Кроме того, свет обеспечивает высокую настраиваемость, так как можно регулировать как интенсивность света, так и продолжительность импульсов. Кроме того, видимый свет безвреден для биомолекул, в том числе белков, и можно даже обращаться к нескольким функциям с разными длинами волн. Следовательно, светочувствительные подходы, основанные на видимом свете, становятся многообещающими направлениями контролируемой и биортогональной регуляции белковых паттернов в пространстве и времени 4,5,6. Использование фотопереключаемых белковых пар из оптогенетики, действующих как светоиндуцируемые димеризаторы, обеспечивает простой метод привлечения специфических белков к мембранам. В частности, белковые узоры были успешно сформированы на искусственных мембранах с использованием инертного взаимодействия между iLID (улучшенный димер, индуцируемый светом, основанный на фотопереключаемом домене LOV2 из Avena sativa) и Nano (SspB дикого типа)7,8, индуцируемой синим светом системой SpyTag (BLISS)9, чувствительным к зеленому свету белком тетрамером CarH10 и индуцируемым красным светом взаимодействием между PhyB и PIF611.
Было продемонстрировано, что фотопереключаемое взаимодействие между iLID и Nano5 может быть использовано для фотомоделирования белков на мембранах модели с использованием синего света7. Взаимодействие iLID/Nano обратимо в темноте, высокоспецифично и действует в физиологических условиях. Закрепление iLID на моделях липидных мембран, таких как гигантские униламеллярные везикулы (GUV) или поддерживаемые липидные бислои (SLB), обеспечивает регулируемое светом привлечение Nano к этим мембранам, что является обратимым в темноте. В частности, мы заметили, что введение неупорядоченного домена на N-конец iLID (в результате чего получается белок под названием disiLID) в качестве троса к модельной липидной мембране повышает эффективность Nano рекрутингаи динамику реверсии.
Используя взаимодействие disiLID/Nano, мы разработали метод генерации высококонтрастных паттернов нано-слитых белков интереса (POI) на SLB и внешних мембранах GUV. Этот метод позволяет создавать белковые паттерны с замечательным пространственным и временным разрешением и высокой обратимостью в течение нескольких минут. В подробном протоколе описан процесс локального рекрутирования белков на искусственных мембранах. В частности, это достигается путем иммобилизации биотинилированной версии disiLID на SLB и GUVs посредством взаимодействия биотин-стрептавидина (SAv). Затем флуоресцентно меченный Nano (mOrange-Nano) рекрутируется на эти функционализированные мембраны disiLID под действием синего света. Наш экспериментальный протокол предлагает простой и адаптируемый подход к достижению локализованного набора белка в мембраны. Важно отметить, что эта методология не ограничивается заявленными интерфейсами SLB и GUV или mOrange-Nano; он может быть расширен на другие материалы, функционализированные disiLID, и белки, слитые с Nano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описали метод локализованного рекрутирования белков mOrange-Nano на модельных мембранах, таких как поддерживаемый липидный бислой и гигантские униламеллярные везикулы, с использованием фотопереключаемого белка disiLID8. Аспекты, влияющие на качество рисунка, включают качество белков, а также хорошее качество SLB и GUV.
Чтобы обеспечить хорошее качество белка после сцеживания и очистки, важно сначала оценить фотопереключаемые свойства disiLID. Для этого необходимо измерить поглощение кофактора ФМН в темноте и после синего освещения. Ожидается, что УФ-ВИД спектры disiLID покажут характерный тройной пик кофактора FMN в темноте, который значительно уменьшается при освещении синим светом и восстанавливается втемноте 13. Это фотопереключаемое поведение имеет решающее значение для получения воспроизводимого и обратимого рекрутинга на следующих этапах. Работа с защитным красным светом и воздействие на disiLID минимального внешнего освещения во время подготовки образцов повышает производительность экспериментов.
Еще одним важным этапом и, возможно, самым важным является формирование правильных SLB. Дефекты в мембранах и/или образование неоднородных SLB (т.е. наличие многослойных или заплатенных SLB) повлияют на качество структуры белка. Поэтому неопытным пользователям рекомендуется воспроизвести протокол, пометив внедорожники некоторыми мембранными красителями, такими как DiD и DiO, чтобы сформировать флуоресцентно меченные SLB. Таким образом, свойства и качество SLB можно хорошо охарактеризовать с помощью флуоресцентной микроскопии. Измерения FRAP представляют собой типичный подход к оценке качества SLB путем оценки текучести мембран. В качестве альтернативы, в случае биотинилированных SLB, подобных описанным в настоящем протоколе, для визуализации и оценки качества SLB можно использовать флуоресцентно меченые SAv (например, Atto 488-SAv).
В первой части протокола описывается формирование паттернов на SLB. Чтобы обеспечить оптимальный результат, важно добавить mOrange-Nano в SLB и дать образцу инкубироваться в темноте в течение 15 минут. Во время фотоактивации выбор ROI не ограничивается конкретным размером. Тем не менее, интенсивность лазера и время воздействия необходимо регулировать, чтобы уменьшить нежелательное фотообесцвечивание флуоресцентных белков.
Этот метод не ограничивается биотинилированными белками, и для привязки disiLID к SLB могут быть использованы другие подходы. Например, disiLID, помеченный His, может быть экспрессирован и закреплен на Ni-NTA-содержащих SLB. Тем не менее, крайне важно экспрессировать Nano и disiLID с разными метками, чтобы избежать замены белков на SLB. Этот метод также позволяет инвертировать порядок белков, тем самым функционализируя SLB с Nano и рекрутируя disiLID (или белки, слитые с disiLID) при освещении синим светом.
Для динамического контроля локализации белка должна быть возможна многократная обратимая локализация белка в выбранной области. Для достижения этой цели концентрация Nano (200 нМ) в растворе является критическим параметром для получения высокой обратимости.
Еще одной проблемой является привлечение Nano к дисиLID-функционализированной поверхности GUV. Как и в случае структурирования белков на SLB, этот метод может быть распространен на различные стратегии функционализации мембран. В этом протоколе весь GUV освещался синим светом для привлечения mOrange-Nano на всей поверхности GUV. Тем не менее, выбор небольших ROI, локализованных на мембране GUV, должен привести к точной локализации белков в более ограниченной области.
Этот метод имеет только ограничение, связанное с выбором флуорофора, используемого для визуализации набора Nano на мембране внедорожников или GUV. В частности, следует избегать флуорофоров со спектром возбуждения в диапазоне синего света, так как их использование будет препятствовать фотоактивации (dis)iLID. Таким образом, для этого типа экспериментов рекомендуется выбирать флуорофоры в зеленом или красном диапазоне света (например, mOrange или Cy5).
Конструкция disiLID предлагает простой и адаптируемый способ улучшения рекрутирования локальных белков в мембранах и расширяет динамический диапазон iLID и Nano из оптогенетики4. Эти методы сосредоточены на привлечении Nano на мимические мембраны, такие как липидные бислои и GUV. Тем не менее, этот подход может быть распространен на многочисленные оптогенетические инструменты в клетках, где (dis)iLID или Nano связаны с мембраной.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована Европейским исследовательским советом ERC Starting Grant ARTIST (# 757593 S.V.W.). DDI благодарит Фонд Александра фон Гумбольдта за стипендию для постдокторантуры.
Materials
| µ-Slide 18 Well | Ibidi | 81817 | For SLB preparation |
| 25 µL Microliter Syringe | Hamilton | Model 702 N | For the preparation of lipid mixture and spreading the lipid solution on the PVA layer |
| Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C | For SUVs preparation |
| CaCl2 (Calcium chloride) | Sigma-Aldrich | C5670 | For SLB formation |
| Cover Slips 24 mm x 60 mm | Engelbrecht | K12460 | For GUVs formation |
| DiD (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'- Tetramethylindodicarbocyanine) |
Thermo Fisher Scientific | D7757 | Membrane dye |
| disiLID | Sequence: MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA IAALGGGGAGPPVGGGGGRGDA GPGSGAASGTVVAAAAGGPGPG AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSGA GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVIT DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK TAFQIAEAANDENYF |
||
| DOPC (1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375P | For SUVs lipid composition |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes |
Merk | EP0030108116-100EA | For collecting freshly made GUVs |
| mOrange-Nano | Sequence: MRGSHHHHHHGSKIEEGKLVI WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP PKTWEEIPALDKELKAKGKSALM FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSA GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA LKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGI EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE GEGEGRPYEGFQTAKLKVTKGG PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYK VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG WEASSERMYPEDGALKGEIKMR LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE QYERAEGRHSTGGMDELYKGG SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA RENGDGVMFEPEEIYDELNIG |
||
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | For buffer |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma-Aldrich | 1064980500 | For surface activation in SLB formation |
| POPC (1-Palmitoyl-2- oleoylphosphatidylcholine) |
Avanti Polar Lipids | 850457C | For GUVs lipid composition |
| POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-racglycerol)) | Avanti Polar Lipids | 840457C | For GUVs lipid composition |
| PVA (Polyvinyl alcohol) fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | 8148940101 | For GUVs formation |
| SP8 confocal laser scanning microscope | Leica | ||
| Streptavidin | TermoFisher | 434301 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | For GUVs formation |
| Tris hydrochloride | Sigma-Aldrich | 10812846001 | For buffer |
References
- Kretschmer, S., Schwille, P. Pattern formation on membranes and its role in bacterial cell division. Curr Opin Cell Biol. 38, 52-59 (2016).
- Yang, H. W., Collins, S. R., Meyer, T. Locally excitable Cdc42 signals steer cells during chemotaxis. Nat Cell Biol. 18 (2), 191-201 (2016).
- Caldwell, R. M., et al. Optochemical control of protein localization and activity within cell-like compartments. Biochem. 57 (18), 2590-2596 (2018).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci. 112 (1), 112-117 (2015).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Bartelt, S. M., et al. Dynamic blue light-switchable protein patterns on giant unilamellar vesicles. Chem Commun. 54 (8), 948-951 (2018).
- Di Iorio, D., Bergmann, J., Higashi, S. L., Hoffmann, A., Wegner, S. V. A disordered tether to iLID improves photoswitchable protein patterning on model membranes. Chem. Commun. 59 (29), 4380-4383 (2023).
- Hartzell, E. J., Terr, J., Chen, W. Engineering a blue light inducible Spytag system (BLISS). J Am Chem Soc. 143 (23), 8572-8577 (2021).
- Xu, D., Bartelt, S. M., Rasoulinejad, S., Chen, F., Wegner, S. V. Green light lithography: a general strategy to create active protein and cell micropatterns. Mater Horiz. 6 (6), 1222-1229 (2019).
- Jia, H., et al. Light-induced printing of protein structures on membranes in vitro. Nano Lett. 18 (11), 7133-7140 (2018).
- Di Iorio, D., Verheijden, M. L., vander Vries, E., Jonkheijm, P., Huskens, J. Weak Multivalent Binding of influenza hemagglutinin nanoparticles at a sialoglycan-functionalized supported lipid bilayer. ACS Nano. 13 (3), 3413-3423 (2019).
- Kasahara, M., Torii, M., Fujita, A., Tainaka, K. FMN binding and photochemical properties of plant putative photoreceptors containing two LOV domains, LOV/LOV proteins. J Biol Chem. 285 (45), 34765-34772 (2010).
