モデルメンブレンにおける動的光誘起タンパク質パターン

1. 実験の準備 ビオチン化ジシリド(b-disiLID)およびmOrange-Nano(材料表を参照)を、以前に報告された手順7,8に従って発現および精製します。 選択した脂質組成と濃度のガラスバイアルに脂質混合物を調製します。まず、脂質をクロロホルムに溶解して、1 mg/mL 濃度の最終脂質溶液を得ます。脂質を混合して、94.9 mol% 2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、5 mol% 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンN-(キャップビオチニル)ナトリウム塩(DOPE-ビオチン)、0.1 mol% 1,1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3′-テトラメチルインドジカルボシアニン(DiD)の組成を得ます( 材料の表を参照)。注:脂質混合物は、さまざまな比率、DOPE-ビオチン濃度、および/または異なる膜染料で調整できます。推奨されるDOPE-ビオチン濃度(5 mol%)により、次のステップで高密度ストレプトアビジン(SAv)層を形成できます。 以前に報告された方法7,8,12に従って、小さな単層小胞(SUV)を調製します。このステップでは、直径≤100nmのSUVを準備することをお勧めします。 この研究では、超音波処理法が採用されています。まず、ガラスバイアル内のクロロホルム溶液を窒素流で蒸発させながらバイアルを回転させ、薄い脂質膜を形成します。次に、真空下で少なくとも1時間残留クロロホルムを除去します。乾燥フィルムを超純水で最終濃度1 mg/mLの脂質にボルテックスして再水和します。最後に、不透明な溶液が透明になるまで、得られた溶液を10分間超音波処理します。注:脂質混合物は、冷蔵庫の微量遠心チューブに最大2週間保管してください。最終的なSUVのサイズが100nm≤限り、さまざまなSUV調製方法(押出法など)も使用できます。 2. mOrange-Nanoによる機能化SLBの分散へのリクルートメント μスライド式18ウェルガラスボトムチャンバー( 材料表を参照)の各ウェルに2 M NaOHを150 μL加え、室温で1時間インキュベートします。続いて、NaOHを除去し、ウェルを最初に150μLの超純水で3〜5回洗浄し、次に10 mM CaCl2を含む150 μLのバッファー(10 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl)で3回洗浄します。 調製したばかりの 15 μL の SUV (水にストック濃度 1 mg/mL) を 150 μL のバッファーと 10 mM CaCl2 のウェルに加えると、バッファー中の SUV が約 10 倍に希釈されます。SUVを室温で30分間インキュベートします。インキュベーション時間後、ビオチン化SLBが形成されます。 最初に溶液を除去し、その後各ステップで新しいバッファーを添加することにより、CaCl2 を含まないバッファー(10 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl)でSLBを少なくとも7回洗浄します。各洗浄ステップに80μLのバッファーを使用することをお勧めします。注:SLBの最適な洗浄は、表面に触れずに新鮮な溶液を数回上下にピペッティングすることで得られます。新たに形成されたSLBを含むウェル内の溶液のピペッティングは、形成されたSLBを損傷する小さな気泡の形成を減らすために穏やかに行う必要があります。この瞬間から、SLBが乾燥するのを防ぐために、ウェルには十分な量のバッファーが含まれている必要があります。 ビオチン化SLBをSAvでさらに官能基化するためには、SAv溶液を最終濃度250 nMまで添加し、室温で30分間インキュベートします。その後、バッファー(10 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl)で少なくとも5回洗浄することにより、余分なSAvを除去します。 この瞬間から、光スイッチングタンパク質の望ましくない光活性化を避けるために、サンプルを保護赤色光の下に保管してください。b-disiILD( 材料表参照)をウェル中の最終濃度1 μMまで添加します。室温で30分間インキュベートした後、バッファーで少なくとも5回洗浄して余分なタンパク質を除去します。 mOrange-Nano( 材料表参照)を最終濃度200 nMまで添加し、サンプルをアルミホイルで覆って暗所に保ちます。 μスライドを蛍光顕微鏡の下に置き、イメージング設定を調整します。mOrange-Nanoの励起用に552nmレーザーをセットします。mOrange信号を最適化するために放出範囲を調整します。disiLIDの光活性化は、2.58秒間隔の光パルスを使用して、488nmレーザーで達成されます。 3. GUVの準備 ポリビニルアルコール(PVA、 材料表を参照)の5%(w/v)溶液(MW:145,000 g/mol)と100 mMのスクロースを超純水に調製し、80°C、400 rpmで一晩混合します。 クロロホルムで目的の組成(最終濃度10 mg/mL)の脂質溶液を調製します。この分析法では、10 mg/mL POPC、10 mol% 1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1′-rac-グリセロール)(POPG)、2 mol% DOPE-ビオチン、1 mol% DiDからなる組成物を推奨します( 材料の表を参照)。 ハイドレーションテクニック7,8でGUVを準備します。まず、調製したPVA溶液40μLを均質な薄層として、60 mm x 24 mmのスライドガラスの上に、できればピペットチップで広げます。次に、薄層を50°Cで30分間乾燥させます。 脂質溶液5μLを針でPVA層に広げ、30°Cで1時間乾燥させます。 スペーサー(~40 mm ×24 mm × 2 mm、 材料表を参照)と 2 枚目のスライドガラスを使用して、機能化されたスライドガラス上にチャンバーを組み立てます。 1 mLの再水和バッファー(10 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl)をチャンバーに室温で1時間加え、GUVを形成。1時間後、チャンバーを反転させ、ピペットチップでガラス面を軽くたたきます。 片側のスライドガラスを慎重に取り外して、構築されたチャンバーを開き、ピペットでGUVを回収します。 溶液をプラスチックチューブに入れ、GUVを2時間沈殿させます。 4. mOrange-Nanoの官能基化GUVへのリクルートメント 収穫したばかりのGUVにSAvの溶液を加え、室温で30分間放置します。注意: 次の手順は、disiLIDの光活性化を避けるために、保護赤色光で実行する必要があります。 GUVs溶液に1 μMのb-disiLIDを加え、サンプルを暗所に30分間置き、アルミホイルで覆います。 スライドμ式18ウェルガラスボトムチャンバーを150 μL BSA溶液(3% w/v水溶液)で10分間前処理します。次に、BSA溶液を取り出し、ウェルを150μLの超純水で3回洗浄します。 145 μL の 200 nM mOrange-Nano バッファー (10 mM Tris pH 7.4、100 mM NaCl) をウェルに加えます。 次に、b-disiLIDで装飾したGUVを5 μL溶液に加え、GUVが沈殿するまで~15分待ちます。 μスライドを共焦点顕微鏡の下に置きます。サンプルを552 nmで励起してmOrange(λex = 557 nm; λem = 576 nm)蛍光を可視化し、638 nmでサンプルを励起してGUV膜のDiD(λex = 644 nm; λem = 665 nm)を可視化します。mOrange-Nanoの動員は、望ましくない光退色の影響を最小限に抑えるために、5.3秒ごとに青色光パルス(488 nm、強度1%)でトリガーされます。注:励起波長は、使用する顕微鏡の種類に基づいて調整できます。顕微鏡で使用できる他の一般的な励起波長も、532 nmまたは561 nm、および633 nm、647 nm、639 nm、または640 nmのレーザーです。