쥐에서 임상적으로 관련된 출혈성 쇼크 모델 개발
Summary
출혈성 쇼크는 매년 전 세계적으로 190만 명의 목숨을 앗아갑니다. 소동물은 출혈성 쇼크 모델로 자주 사용되지만 표준화, 재현성 및 임상적 중요성 문제와 관련이 있어 관련성이 제한적입니다. 이 논문은 쥐에서 임상적으로 유의미한 새로운 출혈성 쇼크 모델을 개발하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
최근 수십 년 동안 동물 모델의 개발을 통해 다양한 병리학을 더 잘 이해하고 새로운 치료법을 식별할 수 있었습니다. 출혈성 쇼크, 즉 많은 양의 혈액이 급격히 손실되어 장기 부전이 발생하는 것은 여러 경로를 포함하는 매우 복잡한 병태생리학과 관련이 있습니다. 출혈성 쇼크에 대한 기존의 수많은 동물 모델은 인간에서 일어나는 일을 복제하기 위해 노력하고 있지만 이러한 모델은 임상적 관련성, 재현성 또는 표준화 측면에서 한계가 있습니다. 이 연구의 목적은 이러한 모델을 개선하여 출혈성 쇼크의 새로운 모델을 개발하는 것입니다. 간단히 말해서, 출혈성 쇼크는 수컷 Wistar Han 쥐(11-13주령)에서 평균 동맥압의 강하를 담당하는 통제된 배출에 의해 유발되었습니다. 75분의 다음 단계는 출혈성 쇼크의 병태생리학적 경로를 유발하기 위해 32mmHg에서 38mmHg 사이의 낮은 평균 동맥 혈압을 유지하는 것이었습니다. 프로토콜의 마지막 단계는 혈압을 높이기 위해 정맥 주사액인 링거 젖산 용액을 투여하여 환자 치료를 모방했습니다. 젖산 및 행동 점수는 프로토콜 시작 후 16시간 후에 평가되었으며, 혈류역학 매개변수 및 혈장 마커는 부상 후 24시간 후에 평가되었습니다. 출혈성 쇼크 유도 후 24시간 후, 출혈성 쇼크 그룹에서 평균 동맥 및 이완기 혈압이 감소하였다(p < 0.05). 심박수와 수축기 혈압은 변하지 않았다. 출혈성 쇼크에 따라 모든 장기 손상 지표가 증가하였다(p < 0.05). 젖산혈증 및 행동 점수는 가짜 그룹에 비해 증가했다(p < 0.05). 결론적으로, 우리는 여기에 설명된 프로토콜이 후속 연구, 특히 새로운 분자의 치료 잠재력을 평가하기 위해 사용할 수 있는 출혈성 쇼크의 관련 모델임을 입증했습니다.
Introduction
출혈성 쇼크(HS)는 상당한 혈액량 손실을 특징으로 하는 쇼크 상태로, 이로 인해 조직 산소 결핍증이 발생합니다. HS는 혈역학적 및 대사적 변화와 함께 전염증 및 항염증 반응을 연관시키는 복잡한 병리학입니다. 매년 전 세계적으로 약 190만 명이 출혈과 그 결과로 사망합니다1. 현재 치료 지침에는 주로 정맥 수액 투여(혈관 활성 분자가 보충되거나 보충되지 않음)와 산소 요법이 포함됩니다. 그러나 이러한 치료법은 증상이 있고 효과가 없을 수 있기 때문에 HS 관련 사망률이 높게 유지되는 이유를 알 수 있습니다2. 이는 새로운 분자 및 세포 메커니즘을 규명하는 것의 중요성을 정당화하며, 따라서 사망률을 줄이기 위한 치료법을 규명합니다.
동물 모델을 통해 질병과 관련된 병태생리학적 메커니즘을 해독하고 새로운 치료 전략을 테스트할 수 있습니다. 출혈성 쇼크의 수많은 동물 모델이 문헌에 존재합니다. 이러한 모델은 사용되는 종뿐만 아니라 HS를 유도하는 수단(예: 고정 압력 대 고정 부피)에서도 다릅니다(표 1, 표 2)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . 또한, 프로토콜은 동일한 유형의 모델(예: 출혈 시간, 목표 평균 동맥압) 내에서 다양하다(표 3)14,15,16,17,18,19,20. 기존의 출혈성 쇼크 모델의 다양성과 임상 상황을 복제하는 복잡성을 고려할 때 이 병리학에 대한 전임상 연구는 여전히 제한적입니다. 재현 가능하고 표준화 가능하며 구현하기 쉬운 출혈성 쇼크 모델의 개발은 모든 사람의 관심사입니다. 이것은 다양한 연구 간의 비교를 용이하게 하고 출혈성 쇼크의 복잡한 병태생리학을 밝힐 것입니다. 이 프로토콜의 목적은 고정된 양의 출혈 단계와 고정된 저혈압 단계를 따르는 두 개의 연속적인 출혈 단계를 사용하여 쥐에서 출혈성 쇼크의 새로운 임상적으로 관련된 모델을 개발하는 것이었습니다.
표 1: 출혈성 쇼크 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13의 모델로 사용된 종. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 출혈성 쇼크의 다양한 유형13. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 고정 압력 프로토콜에 의해 유도된 쥐의 출혈성 쇼크에 대한 다양한 실험 모델의 예. 출혈성 쇼크의 다양한 실험 모델에 대한 매개변수 요약. 빨간색으로 표시된 혈관은 동맥이고 파란색으로 표시된 혈관은 정맥입니다. 소생술의 경우 채취한 혈액의 부피를 기준으로 사용합니다(혈액: 쇼크 시 샘플링된 혈액과 동일한 부피의 소생술, x2: 쇼크 시 샘플링된 혈액의 2배에 달하는 소생술, x4: 쇼크 시 샘플링된 혈액의 4배에 달하는 소생). MAP: 평균 동맥압; RL : 링거 젖산 14,15,16,17,18,19,20. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에서 우리는 처음으로 고정 압력 모델과 고정 부피 모델 간의 혼합을 기반으로 한 출혈성 쇼크의 대표적인 쥐 모델을 설명했습니다. 우리는 충격 유도 후 24시간 후에 우리의 모델이 혈류역학적 매개변수 및 신진대사의 변화와 관련이 있음을 입증했습니다.
복잡한 병태생리학으로 인해 출혈성 쇼크 연구는 통합 동물 모델의 활용을 필요로 합니다. 실제로, 체외 접근법은 이 질병과 관련된 모든 경로를 모방할 수 없습니다. 출혈성 쇼크 프로토콜 후 동물을 깨우는 것은 임상 상황을 더 잘 재현하기 위한 단계입니다. 동물을 깨우는 것이 어렵기 때문에 이 단계를 포함한 연구는 거의 없습니다. 동물을 깨우는 희귀한 연구는 짧은 시간(2시간 또는 6시간)에 동물을 희생시키는데, 이는 환자에게 무슨 일이 일어나고 있는지 완전히 반영하지 못한다 16,18,23,24. 출혈성 쇼크 모델의 개발에도 불구하고, 쇼크 유도 후 24시간 동안 매개변수(염증, 세포사멸, 장기 기능 장애)를 평가한 연구는 소수에 불과하며, 따라서 이러한 종류의 프로토콜의 어려움이 강조되고있다 25,26,27. 컴퓨터 및 수학적 모델의 개발은 연구에 혁명을 일으켰습니다. 출혈성 쇼크에 대한 수많은 수학적 모델이 개발되었지만, 이러한 모델의 대부분은 출혈성 쇼크 중 체액 교환의 전체 범위를 고려하지 않았으며 잠재적인 임상적 적용에 앞서 개선이 필요하다28. 현재까지 주요 과제 중 하나는 인간의 병리학을 가능한 한 가깝게 모방하는 동물 모델을 개발하는 것입니다.
많은 수의 출혈성 쇼크 모델이 문헌에 기술되어 있으며, 혈관 접근법, 채혈된 혈액의 양 또는 목표 압력(targeted pressure13)에 따라 다르다. 보다 일반적으로, 출혈성 쇼크 모델은 고정 부피 출혈, 고정 압력 출혈 및 조절되지 않는 출혈의 3 그룹으로 분류 할 수 있습니다. 고정형 출혈에 대한 표준화 및 재현성은 어렵고 쥐의 체중에 따라 선형적으로 감소하는 혈액량/체중 비율로 설명됩니다. 고정 압력 출혈은 널리 사용되며, 따라서 설정(목표 압력, 충격 지속 시간)이 연구마다 매우 다양하여 한 모델에서 다른 모델로 결과를 전환하기가 어렵다는 것을 설명합니다. 또한 출혈성 쇼크의 병태생리학에서 중추적인 역할을 하는 혈역학적 손상이 체계적으로 평가되지 않아 연구 간 결과의 불일치가 증가할 수 있다는 점을 지적하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 통제되지 않는 출혈 모델은 임상적으로 관련성이 있지만 재현 가능성과 윤리에 대한 질문을 제기합니다. 임상적 타당성, 표준화 및 재현성을 최대한 조화시키기 위해 우리는 고정 부피 단계와 고정 압력 단계를 모두 가진 혼합 모델을 개발했습니다.
여기에 설명된 모델에서 온도와 호흡수는 수술 후 24시간 동안 수정되지 않습니다. 이는 수술이 무균 상태에서 수행되어 전염증 반응을 제한한다는 사실로 설명할 수 있습니다. 출혈성 쇼크는 혈압 강하와 관련된 출혈로 인한 급성 순환 부전으로 정의됩니다. 인간에서와 마찬가지로 이 출혈성 쇼크 모델은 평균 동맥압의 감소를 유발하며, 특히 이완기 혈압의 감소로 인해 발생합니다. 흥미롭게도, 그리고 앞서 설명한 바와 같이, 이 출혈성 쇼크 모델에서 심박수는 소생 단계 후에도 변하지 않는다 29,30,31. 평균 동맥압의 하락은 아마도 장기 관류 감소와 관련이 있을 수 있으며, 이는 우리 모델에서 다양한 플라즈마 마커(크레아티닌혈증, 심장 트로포닌 T, ASAT 및 ALAT)의 증가로 설명할 수 있습니다. 산소 공급의 중단은 혐기성 대사로 이어져 젖산혈증을 증가시킨다32. 앞서 설명한 바와 같이, 이 출혈성 쇼크 모델은 혈중 젖산 수치30의 증가를 초래한다. 이러한 증가는 대퇴 동맥 수준에서 발생하는 허혈과 관련이 있을 수 있습니다. 그러나 가짜 그룹의 동물이 생리적 젖산혈증을 앓고 있고 출혈성 쇼크 그룹과 동일한 수술을 받은 것을 고려하면 이러한 증가는 출혈성 쇼크 프로토콜과 관련이 있는 것으로 보입니다. 종합하면, 이러한 모든 데이터는 이 연구에서 설명된 프로토콜이 쥐에서 출혈성 쇼크의 새로운 관련 모델을 개발할 수 있음을 확인합니다.
이 모델의 한계는 헤파린을 사용한다는 것인데, 이는 캐뉼라와 같은 플라스틱 재료와 접촉할 때 혈액의 자연적인 응고를 줄이는 데 필수적입니다. 그러나, 헤파린의 사용은 외상성 출혈성 쇼크와 관련된 응고 장애에 영향을 미칠 수 있다33. 이 연구는 생후 11-13주 된 건강한 수컷 동물을 대상으로 합니다. 성별, 연령 및 동반 질환(고혈압, 당뇨병 등)이 결과에 영향을 미칠 수 있다는 점을 고려할 때 모델에서 그 영향을 평가하는 것이 적절할 것입니다. 프로토콜에서 소생술 단계는 응고 장애와 조직 부종을 촉진할 수 있는 결정체인 링거 젖산(Ringer Lactate)의 주입을 통해 수행됩니다34. 혈액 제제를 사용하는 것이 최적이기는 하지만, 혈액 제제는 부족하고 부패하기 쉬우며, 전체 프로토콜에 대해 충분한 양의 쥐 혈액을 비축하기 어려울 수 있습니다. 혈액 제제와 결정질/콜로이드 기반 소생술 출혈성 쇼크 모델은 두 가지 상호 보완적인 접근 방식입니다.
이 모델의 강점은 1) 높은 재현성(결과의 낮은 변동성으로 설명됨), 2) 적용 용이성(대부분의 기구는 고전적 및 혈관 접근법으로 알려져 있음), 3) 특히 동물 각성 및 다중 내장 기능 장애로 인한 임상적 관련성입니다. 보충 파일 1에 설명된 행동 점수에 따라 한계 포인트가 설정되었습니다. 첨부된 표에 따라 9점 이상의 점수에 도달하면 희생에 대해 논의할 것입니다. 점수가 11점이면 해당 동물은 체계적으로 안락사됩니다. 이 연구에서 어떤 동물도 8점 이상의 점수에 도달하지 않았으므로 연구에서 제외된 동물은 없습니다. 이는 여기에 설명된 모델이 다른 24시간 연구보다 3배 낮은 사망률(16% 대 47%)과 관련이 있는 이유를 설명할 수 있습니다25.
이 모델의 중요한 단계는 출혈성 쇼크 단계입니다. 32-38mmHg의 압력 범위를 준수하는 것이 중요합니다. 실제로 평균 동맥압을 32mmHg 미만으로 유지하면 동맥압이 빠르고 갑작스럽게 떨어지는 것을 관찰했습니다. 반대로, 압력을 38mmHg 이상으로 유지하는 것은 임상 현실에 충분히 가까운 모델을 제공하지 않습니다. 이러한 관찰은 다른 모델(13)에서 목표로 하는 평균 동맥압의 간격에 따른 것이다.
결론적으로, 우리는 이 연구에서 자세히 설명한 쥐 출혈성 쇼크 모델이 임상적으로 관련성이 있으며 새로운 생물학적 행위자/경로를 식별하여 병태생리학적 메커니즘을 이해하고 다양한 후보 분자를 테스트하여 새로운 치료 전략을 식별하는 데 유용할 수 있음을 입증했습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 “Société Française d’Anesthésie et de Réanimation”(파리, 프랑스), “Fondation d’entreprises Genavie”(낭트, 프랑스), “Fédération française de cardiologie”(프랑스), “Agence nationale de la recherche”(20-ASTC-0032-01-hErOiSmE)(파리, 프랑스) 및 “Direction Générale de l’Armement”(파리, 프랑스)의 지원을 받았습니다. 토마스 뒤파스(Thomas Dupas)는 박사 과정 동안 프랑스 DGA(Direction Générale de l’Armement)와 루아르 대학(Région des Pays de la Loire)의 장학금을 지원받았으며, 앙투안 페르셀로(Antoine Persello)는 박사 과정 동안 프랑스의 InFlectis BioScience에서 장학금을 받았습니다. 이 작업을 지원해 준 “Agence Nationale de la Recherche”(파리, 프랑스), “Direction Générale de l’Armement”(파리, 프랑스) 및 “Sauve ton coeur” 협회(프랑스)에 감사드립니다. UTE IRS-UN 핵심 시설(SFR Bonamy, Nantes Université, Nantes, France)과 IBISA 핵심 시설 Therassay(Nantes, France)의 도움과 기술 지원에 감사드립니다.
Materials
| 1 mL syringe | TERUMO | MDSS01SE | |
| 2.5 mL syringe | TERUMO | SS*02SE1 | |
| 20 mL syringe | TERUMO | MDSS20ESE | |
| Anesthesia induction chamber | TEMSEGA | HUBBIV4 | |
| BD Microlance 3 23 G needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| BD Microlance 3 26 G needle | Becton Dickinson | 304300 | |
| Blood pressure transducer | emka TECHNOLOGIES | BP_T | |
| Buprecare | Axience | N/A | 1 mL vial, buprenorphine 0.3 mg/mL |
| DE BAKEY, Atraumatic Vascular Forceps | ALLGAIER instrumente medical | 09-543-150 | |
| Dermal Betadine 10% | Mylan | N/A | 125 mL bottle |
| Fine Forceps – Curved / Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad by Dotmatics | – | |
| Heating mats | TEMSEGA | OPT/THERM_MATELASSTEREORATS | |
| Heparin sodium | PANPHARMA | N/A | 5 mL bottle, 5,000 UI/mL |
| IOX2 software | emka TECHNOLOGIES | IOX_BASE_4c + IOX_FULLCARDIO_4a | |
| Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Lidocaine | Fresenius | N/A | 10 mL bootle, 8.11 mg, lidocaine hydrochloride |
| MiniHub-V3.2 | TEMSEGA | PF006 | |
| Moria 201/A Vessel Clamp – Straight | Fine Science Tools | 18320-11 | |
| Non sterile compresses | Raffin | 70189 | |
| Non sterile drape | Dutscher | 30786 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Polyethylene tubing PE10 | PHYMEP | BTPE-10 | |
| Polyethylene tubing PE50 | PHYMEP | BTPE-50 | |
| Rats | Charles Rivers | – | Male WISTAR HAN (10 weeks) |
| Rectal probe | TEMSEGA | SONDE_TEMP_RATS | |
| Ringer Lactates | Fresenius Kabi | 964175 | |
| Scrub Betadine 4% | Mylan | N/A | 125 mL bottle |
| Sevoflurane | Abbott | N/A | 250 mL bottle, gas 100% |
| Sevoflurane Vaporizer | TEMSEGA | SEVOTEC3NSELEC | |
| StatStrip lactate test strips | Nova Biomedical | 47486 | |
| StatStrip Xpress lactate Meter | Nova Biomedical | 47486 | |
| Sterile compresses | Laboratoire SYLAMED | 211S05-50 | |
| Sterile drape | Mölnlycke | 800330 | |
| Steriles gloves | MEDLINE | MSG7275 | |
| Suture | Optilene | 3097141 | |
| Suture for vessels | SMI | 8150046 | |
| Syringe pump | Vial médical | 16010 | |
| usbAMP | emka TECHNOLOGIES | – | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vaseline | Cooper | N/A | 10 mL vial |
| Vitamin A Dulcis (ALLERGAN) | Allergan | N/A | 10 g tube, Retinol |
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