全球每年有 190 万人死于失血性休克。小动物经常被用作出血性休克模型,但与标准化、可重复性和临床意义问题有关,因此限制了它们的相关性。本文介绍了在大鼠中开发一种新的临床相关的出血性休克模型。
近几十年来,动物模型的发展使我们能够更好地了解各种病理并确定新的治疗方法。失血性休克,即由于大量血液快速丢失而导致的器官衰竭,与涉及多个通路的高度复杂的病理生理学有关。许多现有的出血性休克动物模型都试图复制人类身上发生的情况,但这些模型在临床相关性、可重复性或标准化方面存在局限性。本研究的目的是改进这些模型以开发一种新的失血性休克模型。简而言之,在雄性 Wistar Han 大鼠 (11-13 周龄) 中,通过受控放血诱导出血性休克,导致平均动脉压下降。下一阶段 75 min 是维持较低的平均动脉血压,在 32 mmHg 和 38 mmHg 之间,以触发失血性休克的病理生理途径。该方案的最后阶段通过静脉输液乳酸林格液来模拟患者护理,以升高血压。方案开始后 16 小时评估乳酸和行为评分,受伤后 24 小时评估血流动力学参数和血浆标志物。出血性休克诱导后 24 小时,出血性休克组的平均动脉压和舒张压降低 (p < 0.05)。心率和收缩压保持不变。所有器官损伤标志物均随着出血性休克而增加 (p < 0.05)。与假手术组相比,乳酸血症和行为评分增加 (p < 0.05)。总之,我们证明此处描述的方案是失血性休克的相关模型,可用于后续研究,特别是用于评估新分子的治疗潜力。
失血性休克 (HS) 是一种休克状态,其特征是血容量显著流失,导致组织缺氧。HS 是一种复杂的病理学,将血流动力学和代谢变化与促炎和抗炎反应相关联。全世界每年约有 190 万人死于出血及其后果1。目前的护理指南主要涉及静脉输液(补充或不补充血管活性分子)和氧疗。然而,这些治疗是对症的,可能无效,这解释了为什么 HS 相关死亡率仍然很高2。这证明了确定新的分子和细胞机制的重要性,从而证明降低死亡率的治疗方法的重要性。
动物模型允许破译疾病所涉及的病理生理机制并测试新的治疗策略。文献中存在许多出血性休克的动物模型。这些模型不仅在所使用的物种上有所不同,而且在诱导 HS 的方式上也不同(例如,固定压力与固定体积)(表 1、表 2)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 .此外,同一类型的模型(例如,出血时间、目标平均动脉压)中的方案也有所不同(表 3)14、15、16、17、18、19、20。考虑到现有出血性休克模型的种类繁多和复制临床情况的复杂性,这种病理学的临床前研究仍然有限。开发可重复、标准化且易于实施的出血性休克模型符合每个人的利益。这将有助于各种研究之间的比较,从而揭示出血性休克的复杂病理生理学。该方案的目的是开发一种新的临床相关的大鼠出血休克模型,使用两个连续的出血阶段,固定体积,然后是固定的低血压阶段。
表 1:用作出血性休克模型的物种 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。请点击此处下载此表格。
表 2:失血性休克的不同类型13. 请点击此处下载此表格。
表 3:固定压力方案诱导的大鼠失血性休克实验模型的多样性示例。 出血性休克不同实验模型的参数总结。红色显示的血管是动脉,蓝色显示的血管是静脉。对于复苏,以采血量作为参考(血液:复苏量与休克期间采血量相同;x2:复苏量为休克期间采血量的两倍;x4:复苏量为休克期间采血量的四倍)。MAP: 平均动脉压;RL: 乳酸林格 14,15,16,17,18,19,20。请点击此处下载此表格。
在本文中,我们首次描述了基于固定压力和固定体积模型混合的代表性大鼠失血性休克模型。我们证明,电击诱导后 24 小时,我们的模型与血流动力学参数和代谢的改变有关。
由于其复杂的病理生理学,出血性休克的研究需要利用综合动物模型。事实上,体外方法无法模拟这种疾病所涉及的所有途径。在出血性休克方案后唤醒动物是确保更好地复制临床情况的一个步骤。由于唤醒动物的难度,很少有研究包括这个阶段。唤醒动物的罕见研究在短时间内(2 小时或 6 小时)牺牲了它们,这并不能完全反映患者16、18、23、24 的情况。尽管开发了出血性休克模型,但只有少数研究评估了电击诱导后 24 小时的参数(炎症、细胞凋亡、器官功能障碍),从而突出了这种方案的难度 25,26,27。计算机和数学模型的发展彻底改变了研究。已经开发了许多失血性休克的数学模型,但这些模型中的大多数都没有考虑到失血性休克期间体液交换的全部范围,在潜在的临床适用性之前需要改进28。迄今为止,主要挑战之一是开发一种尽可能接近人类病理的动物模型。
文献中描述了大量的出血性休克模型,它们在血管入路、抽血量或目标压力 方面 有所不同13。更一般地说,出血性休克模型可分为 3 组:固定体积出血、固定压力出血和不受控制的出血。固定体积出血的标准化和可重复性是困难的,可以用血容量/体重比来解释,血容量/体重比随大鼠的体重线性降低。固定压力出血被广泛使用,从而解释了设置(目标压力、休克持续时间)因研究而异,因此很难将结果从一个模型转移到另一个模型。同样重要的是要指出,血流动力学损害在出血性休克的病理生理学中起着关键作用,但尚未进行系统评估,这可能会增加研究之间结果的差异。最后,不受控制的出血模型虽然具有临床相关性,但引发了可重复性和伦理问题。为了尽可能协调临床相关性、标准化和可重复性,我们开发了一种具有固定体积和固定压力阶段的混合模型。
在此处描述的模型中,手术后 24 小时温度和呼吸频率不会改变。这可以通过以下事实来解释:手术是在无菌条件下进行的,从而限制了促炎反应。失血性休克被定义为由于与血压下降相关的失血引起的急性循环衰竭。与人类一样,这种出血性休克模型导致平均动脉压降低,主要是由于舒张压降低。有趣的是,如前所述,在这种出血性休克模型中,复苏阶段后的心率保持不变 29,30,31。平均动脉压的下降可能与器官灌注减少有关,导致多脏器功能障碍,这可以通过我们模型中各种血浆标志物(肌酐血症、心肌肌钙蛋白 T、ASAT 和 ALAT)的增加来说明。氧气供应的中断导致厌氧代谢,从而导致乳酸血症增加32。如前所述,这种出血性休克模型导致血乳酸水平升高30。这种增加可能与股动脉水平引起的缺血有关。然而,考虑到假手术组中的动物患有生理性乳酸血症并接受了与出血性休克组相同的外科手术,这种增加似乎与出血性休克方案有关。综上所述,所有这些数据都证实了本研究中描述的方案允许开发一种新的大鼠相关出血性休克模型。
该模型的局限性是使用肝素,肝素对于减少血液与塑料材料(如插管)接触时的自然凝固至关重要。然而,肝素的使用会影响与创伤性失血性休克相关的凝血病33。这项研究涉及 11-13 周龄的健康雄性动物。考虑到性别、年龄和合并症(高血压、糖尿病等)会影响结果,在我们的模型中评估它们的影响是相关的。在该方案中,复苏步骤是通过注射乳酸林格氏液进行的,乳酸林格液是一种可促进凝血病和组织水肿的晶体液34。尽管血液制品的使用是最佳的,但这些血液制品是稀缺且易腐烂的,并且可能很难为整个方案提供足够的大鼠血液库存。血液制品和基于晶体液/胶体的复苏失血性休克模型是两种互补的方法。
该模型的优势是 1) 其高重现性(由结果的低可变性说明),2) 它易于应用(大多数仪器是经典的,血管入路是已知的)和 3) 它的临床相关性,特别是由于动物觉醒和多内脏功能障碍。根据 补充文件 1 中描述的行为评分,设置了限制点。根据附表,如果达到 9 分以上的分数,将讨论牺牲。如果达到 11 分,动物将被系统地实施安乐死。在这项研究中,没有一只动物的分数高于 8,因此,没有一只动物被排除在研究之外。这可以解释为什么此处描述的模型与死亡率比另一项 24 小时研究低 3 倍(16% 对 47%)相关25。
该模型的关键步骤是出血性休克阶段。遵守 32-38 mmHg 的压力范围很重要。事实上,我们观察到,将平均动脉压保持在 32 mmHg 以下会导致动脉压快速突然下降。相反,将压力保持在 38 mmHg 以上并不能提供足够接近临床现实的模型。这些观察结果与其他模型13 中针对的平均动脉压的间隔一致。
总之,我们证明了本研究中详述的大鼠失血性休克模型具有临床相关性,并且可用于通过识别新的生物学参与者/途径来理解病理生理机制,以及通过测试不同的候选分子来确定新的治疗策略。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了“Société Française d’Anesthésie et de Réanimation”(法国巴黎)、“Fondation d’entreprises Genavie”(法国南特)、“Fédération française de cardiologie”(法国)、“Agence nationale de la recherche”(20-ASTC-0032-01-hErOiSmE)(法国巴黎)和“Direction Générale de l’Armement”(法国巴黎)的支持。Thomas Dupas 在攻读博士学位期间得到了法国 Direction Générale de l’Armement (DGA) 和 Région des Pays de la Loire 的资助。Antoine Persello 在攻读博士学位期间得到了法国 InFlectis BioScience 的资助。我们感谢 “Agence Nationale de la Recherche” (法国巴黎)、“Direction Générale de l’Armement” (法国巴黎) 和 “Sauve ton coeur” 协会(法国)支持这项工作。我们感谢 UTE IRS-UN 核心设施(SFR Bonamy,南特大学,法国南特)和 IBISA 核心设施 Therassay(法国南特)的协助和技术支持。
1 mL syringe | TERUMO | MDSS01SE | |
2.5 mL syringe | TERUMO | SS*02SE1 | |
20 mL syringe | TERUMO | MDSS20ESE | |
Anesthesia induction chamber | TEMSEGA | HUBBIV4 | |
BD Microlance 3 23 G needle | Becton Dickinson | 300800 | |
BD Microlance 3 26 G needle | Becton Dickinson | 304300 | |
Blood pressure transducer | emka TECHNOLOGIES | BP_T | |
Buprecare | Axience | N/A | 1 mL vial, buprenorphine 0.3 mg/mL |
DE BAKEY, Atraumatic Vascular Forceps | ALLGAIER instrumente medical | 09-543-150 | |
Dermal Betadine 10% | Mylan | N/A | 125 mL bottle |
Fine Forceps – Curved / Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
GraphPad Prism 8 | GraphPad by Dotmatics | – | |
Heating mats | TEMSEGA | OPT/THERM_MATELASSTEREORATS | |
Heparin sodium | PANPHARMA | N/A | 5 mL bottle, 5,000 UI/mL |
IOX2 software | emka TECHNOLOGIES | IOX_BASE_4c + IOX_FULLCARDIO_4a | |
Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
Lidocaine | Fresenius | N/A | 10 mL bootle, 8.11 mg, lidocaine hydrochloride |
MiniHub-V3.2 | TEMSEGA | PF006 | |
Moria 201/A Vessel Clamp – Straight | Fine Science Tools | 18320-11 | |
Non sterile compresses | Raffin | 70189 | |
Non sterile drape | Dutscher | 30786 | |
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
Polyethylene tubing PE10 | PHYMEP | BTPE-10 | |
Polyethylene tubing PE50 | PHYMEP | BTPE-50 | |
Rats | Charles Rivers | – | Male WISTAR HAN (10 weeks) |
Rectal probe | TEMSEGA | SONDE_TEMP_RATS | |
Ringer Lactates | Fresenius Kabi | 964175 | |
Scrub Betadine 4% | Mylan | N/A | 125 mL bottle |
Sevoflurane | Abbott | N/A | 250 mL bottle, gas 100% |
Sevoflurane Vaporizer | TEMSEGA | SEVOTEC3NSELEC | |
StatStrip lactate test strips | Nova Biomedical | 47486 | |
StatStrip Xpress lactate Meter | Nova Biomedical | 47486 | |
Sterile compresses | Laboratoire SYLAMED | 211S05-50 | |
Sterile drape | Mölnlycke | 800330 | |
Steriles gloves | MEDLINE | MSG7275 | |
Suture | Optilene | 3097141 | |
Suture for vessels | SMI | 8150046 | |
Syringe pump | Vial médical | 16010 | |
usbAMP | emka TECHNOLOGIES | – | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Vaseline | Cooper | N/A | 10 mL vial |
Vitamin A Dulcis (ALLERGAN) | Allergan | N/A | 10 g tube, Retinol |