ラットにおける臨床的に関連性のある出血性ショックモデルの開発
Summary
出血性ショックは、世界中で毎年190万人が亡くなっています。小動物は出血性ショックモデルとしてよく使用されますが、標準化、再現性、および臨床的意義の問題に関連しているため、関連性が制限されています。この記事では、ラットにおける臨床的に関連性のある新しい出血性ショックモデルの開発について説明します。
Abstract
ここ数十年で、動物モデルの開発により、さまざまな病状をよりよく理解し、新しい治療法を特定することができました。出血性ショック、すなわち大量の血液の急速な喪失による臓器不全は、いくつかの経路が関与する非常に複雑な病態生理学に関連しています。出血性ショックの既存の動物モデルは数多くあり、ヒトで起こることを再現しようと試みていますが、これらのモデルには臨床的関連性、再現性、または標準化の点で限界があります。この研究の目的は、これらのモデルを改良して、出血性ショックの新しいモデルを開発することでした。簡単に言えば、出血性ショックは、平均動脈圧の低下の原因となる制御された放血によって、雄のWistar Hanラット(11〜13週齢)に誘発されました。.次の 75 分間のフェーズは、平均動脈血圧を 32 mmHg から 38 mmHg の間低く維持して、出血性ショックの病態生理学的経路をトリガーすることでした。プロトコルの最終段階では、血圧を上昇させるために静脈内輸液であるリンゲル乳酸溶液を投与する患者のケアを模倣しました。乳酸スコアと行動スコアはプロトコル開始の 16 時間後に評価されましたが、血行動態パラメーターと血漿マーカーは損傷の 24 時間後に評価されました。出血性ショック誘発の24時間後、出血性ショック群の平均動脈血圧と拡張期血圧が低下しました(p < 0.05)。心拍数と収縮期血圧は変化しませんでした。すべての臓器損傷マーカーは、出血性ショックとともに増加しました(p < 0.05)。乳酸血症と行動スコアは、偽群と比較して増加しました(p < 0.05)。結論として、ここで説明するプロトコルは、出血性ショックの関連モデルであり、特に新しい分子の治療可能性を評価するために、その後の研究で使用できることを示しました。
Introduction
出血性ショック(HS)は、血液量の大幅な減少を特徴とするショック状態であり、組織異毒症を引き起こします。HSは、血行動態および代謝の変化を、炎症誘発性および抗炎症反応とともに関連付ける複雑な病理です。世界中で毎年約190万人が出血とその影響に起因しています1。現在のケアのガイドラインには、主に静脈内輸液投与(血管作用分子が補充されているかどうか)と酸素療法が含まれます。ただし、これらの治療法は対症療法であり、効果がない可能性があるため、HS関連の死亡率が高いままである理由を説明しています2。このことは、新たな分子・細胞メカニズムを特定し、死亡率を低下させる治療法を特定することの重要性を正当化するものです。
動物モデルにより、疾患に関与する病態生理学的メカニズムを解読し、新しい治療戦略を試験することができます。出血性ショックの多数の動物モデルが文献に存在します。これらのモデルは、使用される種だけでなく、HSを誘導する手段(例えば、固定圧力対固定体積)も異なります(表1、表2)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 .また、プロトコルは、同じタイプのモデル内で異なります(例:出血の時間、目標平均動脈圧)(表3)14,15,16,17,18,19,20。既存の出血性ショックモデルが多種多様であることと、臨床状況を再現することの複雑さを考慮すると、この病状の前臨床研究は限られたままです。再現性があり、標準化可能で、実装が容易な出血性ショックモデルの開発は、すべての人の利益になります。これにより、さまざまな研究間の比較が容易になり、出血性ショックの複雑な病態生理学が解明されます。このプロトコルの目的は、固定容量の出血の 2 つの連続したフェーズとそれに続く固定低血圧フェーズを使用して、ラットの出血性ショックの新しい臨床的に関連するモデルを開発することでした。
表1:出血性ショックのモデルとして使用された種3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:出血性ショックの種類13.この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:固定圧力プロトコルによって誘発されたラットの出血性ショックの実験モデルの多様性の例。 出血性ショックのさまざまな実験モデルのパラメータの要約。赤で示した血管が動脈、青で示した血管が静脈です。蘇生法は、採血した血液量を参考にしています(血液:ショック時に採取した血液と同量の蘇生法、x2:ショック時に採取した血液の2倍の蘇生法、x4:ショック時に採取した血液の4倍の蘇生法)。MAP:平均動脈圧;RL:リンゲル乳酸14,15,16,17,18,19,20。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、固定圧モデルと固定体積モデルの組み合わせに基づく出血性ショックの代表的なラットモデルを初めて記述した。ショック導入の24時間後、私たちのモデルは血行動態パラメータと代謝の変化に関連していることを示しました。
その複雑な病態生理学のために、出血性ショックの研究には統合された動物モデルの利用が必要です。実際、in vitroアプローチでは、この疾患に関与するすべての経路を模倣することはできません。出血性ショックプロトコルの後に動物を目覚めさせることは、臨床状況のより良い再現を確実にするステップです。動物を起こすのが難しいため、この段階を含む研究はほとんどありません。動物を目覚めさせる珍しい研究では、短時間(2時間または6時間)で動物を犠牲にしていますが、これは患者16,18,23,24に何が起こっているかを完全には反映していません。出血性ショックモデルの開発にもかかわらず、ショック導入の24時間後にパラメータ(炎症、アポトーシス、臓器機能障害)を評価した研究はごくわずかであり、この種のプロトコルの難しさを強調しています25,26,27。コンピュータモデルと数理モデルの開発は、研究に革命をもたらしました。出血性ショックの数多くの数学的モデルが開発されてきたが、これらのモデルのほとんどは、出血性ショック中の体液交換の全範囲を考慮に入れておらず、潜在的な臨床適用性28の前に改善が必要である。これまでの主な課題の1つは、人間の病理を可能な限り忠実に模倣した動物モデルの開発でした。
多数の出血性ショックモデルが文献に記載されており、血管アプローチ、採取された血液の量、または目標圧力13によって異なる。より一般的には、出血性ショックモデルは、固定量出血、固定圧出血、および制御不能な出血の3つのグループに分類できます。固定容量出血の標準化と再現性は難しく、ラットの体重に比例して減少する血液量/体重比によって説明されます。固定圧出血は広く使用されているため、設定(目標圧力、ショックの持続時間)は研究ごとに大きく異なり、あるモデルから別のモデルに結果を転置するのが困難であることを説明しています。また、出血性ショックの病態生理学において極めて重要な役割を果たす血行動態障害は系統的に評価されていないため、研究間の結果の不一致が増加する可能性があることを指摘することも重要です。最後に、制御不能な出血モデルは、臨床的には関連性がありますが、再現性と倫理の問題を提起します。臨床的関連性、標準化、再現性を可能な限り調和させるために、固定容量相と固定圧力相の両方を備えた混合モデルを開発しました。
ここで説明するモデルでは、手術後24時間で体温と呼吸数は変更されません。これは、手術が無菌条件下で行われるため、炎症誘発性反応が制限されるという事実によって説明できます。出血性ショックは、血圧の低下に伴う失血による急性循環不全と定義されています。ヒトと同様に、この出血性ショックのモデルは、特に拡張期血圧の低下により、平均動脈圧の低下を引き起こします。興味深いことに、そして前述のように、この出血性ショックのモデルでは、蘇生段階後も心拍数は変化しません29,30,31。平均動脈圧の低下は、おそらく臓器灌流の減少と関連しており、多臓機能障害を引き起こし、これは私たちのモデルのさまざまな血漿マーカー(クレアチニン血症、心筋トロポニンT、ASAT、およびALAT)の増加によって説明できます。酸素供給の混乱は嫌気性代謝を引き起こし、それが乳酸血症の増加を引き起こします32。前述のように、この出血性ショックのモデルは、血中乳酸レベル30の増加につながります。この増加は、大腿動脈のレベルで引き起こされる虚血に関連している可能性があります。しかし、偽群の動物が生理的乳酸血症を患っており、出血性ショック群と同じ外科的処置を受けたことを考えると、この増加は出血性ショックプロトコルに関連しているように思われます。まとめると、これらすべてのデータは、この研究で説明されているプロトコルが、ラットの出血性ショックの新しい関連モデルの開発を可能にすることを確認しています。
このモデルの制限は、カニューレなどのプラスチック材料と接触する血液の自然な凝固を減らすために不可欠なヘパリンの使用です。しかし、ヘパリンの使用は、外傷性出血性ショックに関連する凝固障害に影響を与える可能性がある33。この研究は、生後11〜13週齢の健康な雄動物を対象としています。性別、年齢、併存疾患(高血圧、糖尿病など)が結果に影響を与える可能性があることを考えると、私たちのモデルでそれらの影響を評価することは適切です。プロトコルでは、蘇生ステップは、凝固障害および組織浮腫34を促進する可能性のある晶質であるリンゲル乳酸の注射を介して行われる。血液製剤の使用は最適ですが、これらは希少で腐りやすく、プロトコル全体に対してラットの血液を十分にストックするのは難しい場合があります。血液製剤とクリスタロイド/コロイドベースの蘇生出血性ショックモデルは、2つの補完的なアプローチです。
このモデルの強みは、1) その高い再現性 (結果の変動性が低いことで示されます)、2) 適用の容易さ (ほとんどの器具は古典的であり、血管アプローチが知られています)、および 3) 特に動物の覚醒と多臓機能障害による臨床的関連性です。 補足ファイル1に記載の行動スコアに基づき、リミットポイントを設定しました。犠牲は、添付の表に従って9を超えるスコアに達した場合に話し合われます。スコアが11に達した場合、動物は体系的に安楽死させられます。この研究では、どの動物も8を超えるスコアに達しなかったため、研究から除外された動物はいません。これは、ここで説明したモデルが、他の24時間研究の死亡率よりも3倍低い死亡率(16%対47%)と関連している理由を説明している可能性があります25。
モデルの重要なステップは、出血性ショック期です。32〜38 mmHgの圧力範囲を尊重することが重要です。実際、平均動脈圧を32mmHg未満に維持すると、圧力が急激かつ急激に低下することが観察されました。逆に、38 mmHgを超える圧力を維持することでは、臨床の現実に十分に近いモデルが得られません。これらの観察結果は、他のモデル13で目標とされた平均動脈圧の区間と一致しています。
結論として、この研究で詳述されたラット出血性ショックモデルは臨床的に関連性があり、新しい生物学的アクター/経路を特定することによる病態生理学的メカニズムの理解と、さまざまな候補分子をテストすることによる新しい治療戦略の特定の両方に役立つ可能性があることを示しました。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、Société Française d’Anesthésie et de Réanimation(パリ、フランス)、Fondation d’entreprises Genavie(ナント、フランス)、Fédération française de cardiologie(フランス)、Agence nationale de la recherche(20-ASTC-0032-01-hErOiSmE)(パリ、フランス)、Direction Générale de l’Armement(パリ、フランス)の助成を受けて行われました。Thomas Dupasは、博士課程の期間にフランスのDirection Générale de l’Armement(DGA)とRégion des Pays de la Loireからの助成金を受けました。この活動を支援してくださった「Agence Nationale de la Recherche」(フランス・パリ)、「Direction Générale de l’Armement」(フランス・パリ)、「Sauve ton coeur」協会(フランス)に感謝いたします。我々は、UTEのIRS-UN中核施設(SFR Bonamy, Nantes Université, Nantes, France)及びIBISAの中核施設Therassay(フランス・ナント)の支援と技術支援に感謝する。
Materials
| 1 mL syringe | TERUMO | MDSS01SE | |
| 2.5 mL syringe | TERUMO | SS*02SE1 | |
| 20 mL syringe | TERUMO | MDSS20ESE | |
| Anesthesia induction chamber | TEMSEGA | HUBBIV4 | |
| BD Microlance 3 23 G needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| BD Microlance 3 26 G needle | Becton Dickinson | 304300 | |
| Blood pressure transducer | emka TECHNOLOGIES | BP_T | |
| Buprecare | Axience | N/A | 1 mL vial, buprenorphine 0.3 mg/mL |
| DE BAKEY, Atraumatic Vascular Forceps | ALLGAIER instrumente medical | 09-543-150 | |
| Dermal Betadine 10% | Mylan | N/A | 125 mL bottle |
| Fine Forceps – Curved / Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad by Dotmatics | – | |
| Heating mats | TEMSEGA | OPT/THERM_MATELASSTEREORATS | |
| Heparin sodium | PANPHARMA | N/A | 5 mL bottle, 5,000 UI/mL |
| IOX2 software | emka TECHNOLOGIES | IOX_BASE_4c + IOX_FULLCARDIO_4a | |
| Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Lidocaine | Fresenius | N/A | 10 mL bootle, 8.11 mg, lidocaine hydrochloride |
| MiniHub-V3.2 | TEMSEGA | PF006 | |
| Moria 201/A Vessel Clamp – Straight | Fine Science Tools | 18320-11 | |
| Non sterile compresses | Raffin | 70189 | |
| Non sterile drape | Dutscher | 30786 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Polyethylene tubing PE10 | PHYMEP | BTPE-10 | |
| Polyethylene tubing PE50 | PHYMEP | BTPE-50 | |
| Rats | Charles Rivers | – | Male WISTAR HAN (10 weeks) |
| Rectal probe | TEMSEGA | SONDE_TEMP_RATS | |
| Ringer Lactates | Fresenius Kabi | 964175 | |
| Scrub Betadine 4% | Mylan | N/A | 125 mL bottle |
| Sevoflurane | Abbott | N/A | 250 mL bottle, gas 100% |
| Sevoflurane Vaporizer | TEMSEGA | SEVOTEC3NSELEC | |
| StatStrip lactate test strips | Nova Biomedical | 47486 | |
| StatStrip Xpress lactate Meter | Nova Biomedical | 47486 | |
| Sterile compresses | Laboratoire SYLAMED | 211S05-50 | |
| Sterile drape | Mölnlycke | 800330 | |
| Steriles gloves | MEDLINE | MSG7275 | |
| Suture | Optilene | 3097141 | |
| Suture for vessels | SMI | 8150046 | |
| Syringe pump | Vial médical | 16010 | |
| usbAMP | emka TECHNOLOGIES | – | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vaseline | Cooper | N/A | 10 mL vial |
| Vitamin A Dulcis (ALLERGAN) | Allergan | N/A | 10 g tube, Retinol |
References
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