Разработка клинически значимой модели геморрагического шока у крыс
Summary
Геморрагический шок ежегодно уносит жизни 1,9 миллиона человек во всем мире. Мелкие животные часто используются в качестве моделей геморрагического шока, но связаны с проблемами стандартизации, воспроизводимости и клинической значимости, что ограничивает их актуальность. В данной статье описывается разработка новой клинически значимой модели геморрагического шока у крыс.
Abstract
В последние десятилетия разработка животных моделей позволила нам лучше понять различные патологии и определить новые методы лечения. Геморрагический шок, т.е. органная недостаточность из-за быстрой потери большого объема крови, связан с очень сложной патофизиологией, включающей несколько путей. Многочисленные существующие модели геморрагического шока на животных стремятся воспроизвести то, что происходит у людей, но эти модели имеют ограничения с точки зрения клинической значимости, воспроизводимости или стандартизации. Целью данного исследования было уточнение этих моделей для разработки новой модели геморрагического шока. Вкратце, геморрагический шок был вызван у самцов крыс Wistar Han (в возрасте 11-13 недель) путем контролируемого обескровливания, ответственного за снижение среднего артериального давления. Следующая фаза продолжительностью 75 минут заключалась в поддержании низкого среднего артериального давления, между 32 мм рт.ст. и 38 мм рт.ст., чтобы запустить патофизиологические пути геморрагического шока. Заключительная фаза протокола имитировала уход за пациентом с введением внутривенных жидкостей, раствора лактата Рингера, для повышения артериального давления. Показатели лактата и поведенческие показатели оценивали через 16 ч после начала протокола, а параметры гемодинамики и плазматические маркеры оценивали через 24 ч после травмы. Через 24 часа после индукции геморрагического шока среднее артериальное и диастолическое артериальное давление снизилось в группе геморрагического шока (p < 0,05). Частота сердечных сокращений и систолическое артериальное давление остались неизменными. Все маркеры повреждения органов были увеличены при геморрагическом шоке (p < 0,05). Показатели лактатемии и поведенческих показателей были повышены по сравнению с фиктивной группой (p < 0,05). В заключение мы продемонстрировали, что описанный здесь протокол является актуальной моделью геморрагического шока, которая может быть использована в последующих исследованиях, в частности, для оценки терапевтического потенциала новых молекул.
Introduction
Геморрагический шок (ГС) – это шоковое состояние, характеризующееся значительной потерей объема крови, что приводит к дисоксии тканей. СГ является сложной патологией, которая связывает гемодинамические и метаболические изменения наряду с про- и противовоспалительными реакциями. Ежегодно из-за кровоизлияния и его последствий во всем мире умирает около 1,9 миллионачеловек1. Современные рекомендации по лечению в первую очередь включают внутривенное введение жидкости (с добавлением или без вазоактивных молекул) и кислородную терапию. Тем не менее, эти методы лечения являются симптоматическими и могут быть неэффективными, что объясняет, почему смертность, связанная с СГ, остаетсявысокой2. Это обосновывает важность выявления новых молекулярных и клеточных механизмов и, таким образом, методов лечения для снижения смертности.
Животные модели позволяют расшифровать патофизиологические механизмы, участвующие в заболеваниях, и протестировать новые терапевтические стратегии. В литературе существует множество животных моделей геморрагического шока. Эти модели различаются не только по используемым веществам, но и по способам индуцирования HS (например, фиксированное давление в зависимости от фиксированного объема) (Таблица 1, Таблица 2)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Кроме того, протоколы различаются в пределах одного и того же типа модели (например, время кровотечения, целевое среднее артериальное давление) (Таблица 3)14,15,16,17,18,19,20. Учитывая большое разнообразие существующих моделей геморрагического шока и сложность репликации клинической ситуации, доклиническое изучение данной патологии остается ограниченным. Разработка воспроизводимой, стандартизированной и простой в реализации модели геморрагического шока отвечает всеобщим интересам. Это облегчило бы сравнение между различными исследованиями и, таким образом, разгадало бы сложную патофизиологию геморрагического шока. Целью данного протокола была разработка новой клинически значимой модели геморрагического шока у крыс с использованием двух последовательных фаз кровоизлияния с фиксированным объемом и последующей фиксированной фазой низкого артериального давления.
Таблица 1: Виды, использованные в качестве модели геморрагического шока 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Различные типы геморрагического шока13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 3: Пример разнообразия экспериментальных моделей геморрагического шока у крыс, вызванного протоколом фиксированного давления. Сводка параметров для различных экспериментальных моделей геморрагического шока. Сосуды, показанные красным цветом, — это артерии, а те, которые показаны синим, — венами. Для реанимации в качестве эталона используется объем взятой крови (кровь: реанимация с объемом, идентичным объему крови, взятой во время шока; x2: реанимация с объемом, в два раза превышающим объем крови, взятой во время шока; x4: реанимация с объемом, в четыре раза превышающим объем крови, взятой во время шока). MAP: среднее артериальное давление; РЛ: Лактат Рингера 14,15,16,17,18,19,20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы впервые описали репрезентативную модель геморрагического шока на крысах, основанную на сочетании моделей фиксированного давления и фиксированного объема. Показано, что через 24 ч после индукции удара наша модель связана с изменением гемодинамических параметров и метаболизма.
Из-за сложной патофизиологии изучение геморрагического шока требует использования интегрированных животных моделей. Действительно, подходы in vitro не могут имитировать все пути, участвующие в этом заболевании. Пробуждение животных после протокола геморрагического шока является шагом, обеспечивающим лучшее воспроизведение клинической ситуации. Из-за трудностей, связанных с пробуждением животных, очень немногие исследования включали этот этап. В редких исследованиях, которые будят животных, они приносятся в жертву через короткое время (2 ч или 6 ч), что не в полной мере отражает то, что происходит с пациентами 16,18,23,24. Несмотря на разработку моделей геморрагического шока, только в нескольких исследованиях оценивались параметры (воспаление, апоптоз, дисфункция органов) через 24 ч после индукции шока, тем самым подчеркивая сложность такого рода протокола. Развитие компьютерных и математических моделей произвело революцию в научных исследованиях. Было разработано множество математических моделей геморрагического шока, но большинство из этих моделей не учитывают весь спектр обмена жидкости в организме во время геморрагического шока и требуют улучшения до потенциальной клиническойприменимости. На сегодняшний день одной из основных задач является разработка животной модели, максимально точно имитирующей патологию у человека.
В литературе описано большое количество моделей геморрагического шока, которые различаются по сосудистым доступам, объемам забора крови или целевомудавлению. В более общем плане, модели геморрагического шока можно разделить на 3 группы: кровоизлияние фиксированного объема, кровоизлияние с фиксированным давлением и неконтролируемое кровоизлияние. Стандартизация и воспроизводимость при кровотечении фиксированного объема затруднены и объясняются соотношением объема крови к массе тела, которое линейно уменьшается с весом крысы. Широко используется кровоизлияние с фиксированным давлением, что объясняет, что настройки (целевое давление, продолжительность удара) очень варьируются от одного исследования к другому, что затрудняет перенос результатов из одной модели в другую. Также важно отметить, что гемодинамические нарушения, которые играют ключевую роль в патофизиологии геморрагического шока, не оцениваются систематически, что может увеличить расхождение в результатах между исследованиями. Наконец, модель неконтролируемого кровоизлияния, хотя и является клинически значимой, поднимает вопросы воспроизводимости и этики. Чтобы максимально совместить клиническую значимость, стандартизацию и воспроизводимость, мы разработали смешанную модель с фазами фиксированного объема и фиксированным давлением.
В описанной здесь модели температура и частота дыхания не изменяются в течение 24 часов после операции. Это можно объяснить тем, что хирургическое вмешательство проводится в стерильных условиях, что ограничивает провоспалительную реакцию. Геморрагический шок определяется как острая недостаточность кровообращения вследствие кровопотери, связанная с падением артериального давления. Как и у человека, данная модель геморрагического шока вызывает снижение среднего артериального давления, в частности из-за снижения диастолического артериального давления. Интересно, что, как было описано ранее, частота сердечных сокращений не изменяется после фазы реанимации в данной модели геморрагического шока 29,30,31. Снижение среднего артериального давления, вероятно, связано со снижением перфузии органов, что приводит к мультивисцеральной дисфункции, что можно проиллюстрировать увеличением различных плазматических маркеров в нашей модели (креатининемия, сердечный тропонин Т, ASAT и АЛТ). Нарушение снабжения кислородом приводит к анаэробному метаболизму, что вызывает повышение лактатемии32. Как было описано ранее, данная модель геморрагического шока приводит к повышению уровня лактата в крови30. Это увеличение может быть связано с ишемией, вызванной на уровне бедренной артерии. Однако, учитывая, что животные в фиктивной группе имеют физиологическую лактатемию и подверглись той же хирургической процедуре, что и в группе геморрагического шока, может показаться, что это увеличение связано с протоколом геморрагического шока. В совокупности все эти данные подтверждают, что описанный в данном исследовании протокол позволяет разработать новую актуальную модель геморрагического шока у крыс.
Ограничением этой модели является использование гепарина, который необходим для снижения естественной свертываемости крови при ее контакте с пластиковыми материалами, такими как канюли. Тем не менее, применение гепарина может повлиять на коагулопатию, связанную с травматическим геморрагическим шоком33. В этом исследовании участвуют здоровые самцы в возрасте 11-13 недель. Учитывая, что пол, возраст и сопутствующие заболевания (гипертония, диабет и т. д.) могут влиять на результаты, было бы целесообразно оценить их влияние в нашей модели. В протоколе этап реанимации выполняется путем инъекции лактата Рингера, кристаллоида, который может способствовать коагулопатии и отеку тканей34. Несмотря на то, что использование продуктов крови является оптимальным, они являются дефицитными и скоропортящимися, и может быть трудно иметь достаточный запас крови крыс для всего протокола. Модели геморрагического шока на основе продуктов крови и кристаллоидов/коллоидов являются двумя взаимодополняющими подходами.
Сильными сторонами этой модели являются: 1) ее высокая воспроизводимость (о чем свидетельствует низкая вариабельность результатов), 2) простота применения (большинство инструментов являются классическими, а сосудистые подходы известны) и 3) ее клиническая значимость, в частности, из-за пробуждения животных и множественной висцеральной дисфункции. На основе поведенческой оценки, описанной в Дополнительном файле 1, были установлены предельные баллы. Жертва будет обсуждаться, если будет достигнуто количество очков выше 9, согласно прилагаемой таблице. Если будет достигнуто 11 баллов, животное будет систематически усыплено. В этом исследовании ни одно из животных не набрало балл выше 8, и, следовательно, ни одно из них не было исключено из исследования. Это может объяснить, почему описанная здесь модель связана с уровнем смертности в 3 раза ниже, чем в другом 24-часовом исследовании (16% против 47%)25.
Критическим этапом модели является фаза геморрагического шока. Важно соблюдать диапазон давления 32-38 мм рт.ст. Фактически, мы наблюдали, что поддержание среднего артериального давления ниже 32 мм рт.ст. приводило к быстрому и резкому падению давления. И наоборот, поддержание давления выше 38 мм рт.ст. не дает модели, которая была бы достаточно близка к клинической реальности. Эти наблюдения согласуются с интервалом среднего артериального давления, заданным в других моделях13.
В заключение мы продемонстрировали, что модель геморрагического шока крыс, описанная в этом исследовании, является клинически значимой и может быть полезна как для понимания патофизиологических механизмов путем идентификации новых биологических акторов/путей, так и для определения новых терапевтических стратегий путем тестирования различных молекул-кандидатов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана “Société Française d’Anesthésie et de Réanimation” (Париж, Франция), “Fondation d’entreprises Genavie” (Нант, Франция), “Fédération française de cardiologie” (Франция), “Agence nationale de la recherche” (20-ASTC-0032-01-hErOiSmE) (Париж, Франция) и “Direction Générale de l’Armement” (Париж, Франция). Томас Дюпас получил гранты от Direction Générale de l’Armement (DGA), Франция и Région des Pays de la Loire во время своей докторской диссертации. Мы благодарим “Agence Nationale de la Recherche” (Париж, Франция), “Direction Générale de l’Armement” (Париж, Франция) и ассоциацию “Sauve ton coeur” (Франция) за поддержку этой работы. Благодарим за помощь и техническую поддержку Центральному центру UTE IRS-UN (СФР Бонами, Нантский университет, Нант, Франция) и основному центру IBISA Therassay (Нант, Франция).
Materials
| 1 mL syringe | TERUMO | MDSS01SE | |
| 2.5 mL syringe | TERUMO | SS*02SE1 | |
| 20 mL syringe | TERUMO | MDSS20ESE | |
| Anesthesia induction chamber | TEMSEGA | HUBBIV4 | |
| BD Microlance 3 23 G needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| BD Microlance 3 26 G needle | Becton Dickinson | 304300 | |
| Blood pressure transducer | emka TECHNOLOGIES | BP_T | |
| Buprecare | Axience | N/A | 1 mL vial, buprenorphine 0.3 mg/mL |
| DE BAKEY, Atraumatic Vascular Forceps | ALLGAIER instrumente medical | 09-543-150 | |
| Dermal Betadine 10% | Mylan | N/A | 125 mL bottle |
| Fine Forceps – Curved / Serrated | Fine Science Tools | 11065-07 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad by Dotmatics | – | |
| Heating mats | TEMSEGA | OPT/THERM_MATELASSTEREORATS | |
| Heparin sodium | PANPHARMA | N/A | 5 mL bottle, 5,000 UI/mL |
| IOX2 software | emka TECHNOLOGIES | IOX_BASE_4c + IOX_FULLCARDIO_4a | |
| Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Lidocaine | Fresenius | N/A | 10 mL bootle, 8.11 mg, lidocaine hydrochloride |
| MiniHub-V3.2 | TEMSEGA | PF006 | |
| Moria 201/A Vessel Clamp – Straight | Fine Science Tools | 18320-11 | |
| Non sterile compresses | Raffin | 70189 | |
| Non sterile drape | Dutscher | 30786 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Polyethylene tubing PE10 | PHYMEP | BTPE-10 | |
| Polyethylene tubing PE50 | PHYMEP | BTPE-50 | |
| Rats | Charles Rivers | – | Male WISTAR HAN (10 weeks) |
| Rectal probe | TEMSEGA | SONDE_TEMP_RATS | |
| Ringer Lactates | Fresenius Kabi | 964175 | |
| Scrub Betadine 4% | Mylan | N/A | 125 mL bottle |
| Sevoflurane | Abbott | N/A | 250 mL bottle, gas 100% |
| Sevoflurane Vaporizer | TEMSEGA | SEVOTEC3NSELEC | |
| StatStrip lactate test strips | Nova Biomedical | 47486 | |
| StatStrip Xpress lactate Meter | Nova Biomedical | 47486 | |
| Sterile compresses | Laboratoire SYLAMED | 211S05-50 | |
| Sterile drape | Mölnlycke | 800330 | |
| Steriles gloves | MEDLINE | MSG7275 | |
| Suture | Optilene | 3097141 | |
| Suture for vessels | SMI | 8150046 | |
| Syringe pump | Vial médical | 16010 | |
| usbAMP | emka TECHNOLOGIES | – | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vaseline | Cooper | N/A | 10 mL vial |
| Vitamin A Dulcis (ALLERGAN) | Allergan | N/A | 10 g tube, Retinol |
References
- Cannon, J. W. Hemorrhagic Shock. New Eng J Med. 378 (4), 370-379 (2018).
- Fox, E. E., Holcomb, J. B., Wade, C. E., Bulger, E. M., Tilley, B. C. Earlier endpoints are required for hemorrhagic shock trials among severely injured patients. Shock. 47 (5), 567-573 (2017).
- Frink, M., Andruszkow, H., Zeckey, C., Krettek, C., Hildebrand, F. Experimental trauma models: an update. J Biomed Biotechnol. 2011, 797383 (2011).
- Hauser, C. J. Preclinical models of traumatic, hemorrhagic shock. Shock. 24, 24-32 (2005).
- Kemming, G., et al. Can we continue research in splenectomized dogs? Mycoplasma haemocanis: Old problem – new insight. Eur Sur Res. 36 (4), 198-205 (2004).
- Carroll, R. G., Iamsa, S. G., Pryor, W. H., Allison, E. J. Single hemorrhage: A clinically relevant canine model of hemorrhagic shock. Resuscitation. 16 (2), 119-126 (1988).
- Cheung, A. T., Duong, P. L., Driessen, B., Chen, P. C., Jahr, J. S., Gunther, R. A. Systemic function, oxygenation and microvascular correlation during treatment of hemorrhagic shock with blood substitutes. Clin Hemorheol Microcirc. 34 (1-2), 325-334 (2006).
- . Hemorrhage and hemorrhagic shock in swine: A review Available from: https://apps.dtic.mil/sti/citations/ADA221297 (1990)
- Lomas-Niera, J. L., Perl, M., Chung, C. -. S., Ayala, A. Shock and hemorrhage: an overview of animal models. Shock. 24, 33-39 (2005).
- Redl, H., Bahrami, S. Large animal models: baboons for trauma, shock, and sepsis studies. Shock. 24, 88-93 (2005).
- Marques-Bonet, T., Cheng, Z., She, X., Eichler, E. E., Navarro, A. The genomic distribution of intraspecific and interspecific sequence divergence of human segmental duplications relative to human/chimpanzee chromosomal rearrangements. BMC Genom. 9, 384 (2008).
- Schlag, G., Redl, H. R., Till, G. O., Davies, J., Martin, U., Dumont, L. Anti-L-selectin antibody treatment of hemorrhagic-traumatic shock in baboons. Crit Care Med. 27 (9), 1900 (1999).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: A review. Eur Surg Res. 50 (2), 57-70 (2013).
- Zingarelli, B., Ischiropoulos, H., Salzman, A. L., Szabó, C. Amelioration by mercaptoethylguanidine of the vascular and energetic failure in haemorrhagic shock in the anesthetised rat. Eur J Pharmacol. 338 (1), 55-65 (1997).
- Gonzalez, R. J., Moore, E. E., Ciesla, D. J., Nieto, J. R., Johnson, J. L., Silliman, C. C. Post-hemorrhagic shock mesenteric lymph activates human pulmonary microvascular endothelium for in vitro neutrophil-mediated injury: the role of intercellular adhesion molecule-1. J Trauma. 54 (2), 219-223 (2003).
- Hoppen, R. A., Corso, C. O., Grezzana, T. J. M., Severino, A., Dal-Pizzol, F., Ritter, C. Hypertonic saline and hemorrhagic shock: hepatocellular function and integrity after six hours of treatment. Acta Cir Bras. 20 (6), 414-417 (2005).
- Rupani, B., et al. Relationship between disruption of the unstirred mucus layer and intestinal restitution in loss of gut barrier function after trauma hemorrhagic shock. Surgery. 141 (4), 481-489 (2007).
- Cai, B., Dong, W., Sharpe, S., Deitch, E. A., Ulloa, L. Survival and inflammatory responses in experimental models of hemorrhage. J Surg Res. 169 (2), 257-266 (2011).
- Esiobu, P., Childs, E. W. A rat model of hemorrhagic shock for studying vascular hyperpermeability. Methods Mol Biol. 1717, 53-60 (2018).
- Sordi, R., Chiazza, F., Patel, N. S. A., Doyle, R. A., Collino, M., Thiemermann, C. Preconditioning’ with low dose lipopolysaccharide aggravates the organ injury / dysfunction caused by hemorrhagic shock in rats. PLoS One. 10 (4), 0122096 (2015).
- Liu, Y., et al. Modified shock index and mortality rate of emergency patients. World J Emerg Med. 3 (2), 114-117 (2012).
- Sahu, N., et al. Shock index as a marker for mortality rates in those admitted to the medical intensive care unit from the emergency department. Cureus. 12 (4), e7903 (2020).
- Zou, L., et al. Glucosamine improves cardiac function following trauma-hemorrhage by increased protein O-GlcNAcylation and attenuation of NF-κB signaling. Am J Physiol Heart Circ Phy. 296 (2), H515-H523 (2009).
- Nöt, L. G., Marchase, R. B., Fülöp, N., Brocks, C. A., Chatham, J. C. Glucosamine administration improves survival rate after severe hemorrhagic shock combined with trauma in rats. Shock. 28 (3), 345 (2007).
- Nöt, L. G., Brocks, C. A., Vámhidy, L., Marchase, R. B., Chatham, J. C. Increased O-linked β-N-acetylglucosamine levels on proteins improves survival, reduces inflammation and organ damage 24 hours after trauma-hemorrhage in rats. Crit Care Med. 38 (2), 562-571 (2010).
- Patel, N. M., et al. Inhibition of macrophage migration inhibitory factor activity attenuates haemorrhagic shock-induced multiple organ dysfunction in rats. Front Immunol. 13, 886421 (2022).
- Patel, N. M., et al. Inhibition of Bruton’s tyrosine kinase activity attenuates hemorrhagic shock-induced multiple organ dysfunction in rats. Ann Surg. 277 (3), e624-e633 (2023).
- Curcio, L., D’Orsi, L., De Gaetano, A. Seven mathematical models of hemorrhagic shock. Comput Math Methods Med. 2021, e6640638 (2021).
- Rönn, T., Lendemans, S., de Groot, H., Petrat, F. A new model of severe hemorrhagic shock in rats. Comp Med. 61 (5), 419-426 (2011).
- Hussmann, B., Lendemans, S., de Groot, H., Rohrig, R. Volume replacement with Ringer-lactate is detrimental in severe hemorrhagic shock but protective in moderate hemorrhagic shock: studies in a rat model. Crit Care. 18 (1), 5 (2014).
- Mihara, R., Takasu, A., Maemura, K., Minami, T. Prolonged severe hemorrhagic shock at a mean arterial pressure of 40 mmHg does not lead to brain damage in rats. Acute Med Surg. 5 (4), 350-357 (2018).
- Vincent, J. -. L., De Backer, D. Circulatory shock. N Engl J Med. 369 (18), 1726-1734 (2013).
- Halbgebauer, R., et al. Hemorrhagic shock drives glycocalyx, barrier and organ dysfunction early after polytrauma. J Crit Care. 44, 229-237 (2018).
- Chipman, A. M., Jenne, C., Wu, F., Kozar, R. A. Contemporary resuscitation of hemorrhagic shock: What will the future hold. Am J Surg. 220, 580-588 (2020).
