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Desenvolvendo um modelo de choque hemorrágico clinicamente relevante em ratos

Published: March 22, 2024
doi:
10.3791/66523
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1CNRS, INSERM, l’institut du thorax,Nantes Université, 2CNRS, INSERM, l’institut du thorax,Nantes Université, CHU Nantes, 3Departement of Biochemistry,CHU de Nantes, 4Oniris

Summary

O choque hemorrágico mata 1,9 milhão de pessoas em todo o mundo todos os anos. Pequenos animais são frequentemente usados como modelos de choque hemorrágico, mas estão associados a questões de padronização, reprodutibilidade e significado clínico, limitando assim sua relevância. Este artigo descreve o desenvolvimento de um novo modelo de choque hemorrágico clinicamente relevante em ratos.

Abstract

Nas últimas décadas, o desenvolvimento de modelos animais permitiu compreender melhor várias patologias e identificar novos tratamentos. O choque hemorrágico, ou seja, falência de órgãos devido à perda rápida de um grande volume de sangue, está associado a uma fisiopatologia altamente complexa envolvendo várias vias. Numerosos modelos animais existentes de choque hemorrágico se esforçam para replicar o que acontece em humanos, mas esses modelos têm limites em termos de relevância clínica, reprodutibilidade ou padronização. O objetivo deste estudo foi refinar esses modelos para desenvolver um novo modelo de choque hemorrágico. Resumidamente, o choque hemorrágico foi induzido em ratos Wistar Han machos (11-13 semanas de idade) por uma exsanguinação controlada responsável por uma queda na pressão arterial média. A próxima fase de 75 min foi manter uma pressão arterial média baixa, entre 32 mmHg e 38 mmHg, para desencadear as vias fisiopatológicas do choque hemorrágico. A fase final do protocolo imitou o atendimento ao paciente com a administração de fluidos intravenosos, solução de Ringer Lactato, para elevar a pressão arterial. Os escores de lactato e comportamentais foram avaliados 16 h após o início do protocolo, enquanto os parâmetros hemodinâmicos e marcadores plasmáticos foram avaliados 24 h após a lesão. Vinte e quatro horas após a indução do choque hemorrágico, a pressão arterial média e diastólica estava diminuída no grupo choque hemorrágico (p < 0,05). A frequência cardíaca e a pressão arterial sistólica permaneceram inalteradas. Todos os marcadores de dano de órgãos foram aumentados com o choque hemorrágico (p < 0,05). Os escores de lactatemia e comportamentais foram aumentados em comparação com o grupo sham (p < 0,05). Em conclusão, demonstramos que o protocolo aqui descrito é um modelo relevante de choque hemorrágico que pode ser utilizado em estudos subsequentes, particularmente para avaliar o potencial terapêutico de novas moléculas.

Introduction

O choque hemorrágico (HS) é um estado de choque caracterizado por perda significativa do volume sanguíneo, resultando em disóxia tecidual. A EH é uma patologia complexa que associa alterações hemodinâmicas e metabólicas a respostas pró e anti-inflamatórias. Aproximadamente 1,9 milhão de mortes em todo o mundo são atribuídas à hemorragia e suas consequências a cada ano1. As diretrizes atuais para o cuidado envolvem principalmente a administração de fluidos intravenosos (suplementados ou não com moléculas vasoativas) e oxigenoterapia. No entanto, esses tratamentos são sintomáticos e podem ser ineficazes, o que explica por que a mortalidade associada à HS permanece alta2. Isso justifica a importância da identificação de novos mecanismos moleculares e celulares e, assim, tratamentos para reduzir a mortalidade.

Os modelos animais permitem decifrar os mecanismos fisiopatológicos envolvidos nas doenças e testar novas estratégias terapêuticas. Existem numerosos modelos animais de choque hemorrágico na literatura. Esses modelos diferem não apenas nas espécies utilizadas, mas também nos meios de indução de SH (por exemplo, pressão fixa vs. volume fixo) (Tabela 1, Tabela 2)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Além disso, os protocolos variam dentro do mesmo tipo de modelo (por exemplo, tempo de hemorragia, pressão arterial média alvo) (Tabela 3)14,15,16,17,18,19,20. Considerando a grande variedade de modelos de choque hemorrágico existentes e a complexidade de replicar a situação clínica, o estudo pré-clínico dessa patologia permanece limitado. O desenvolvimento de um modelo de choque hemorrágico reprodutível, padronizável e de fácil implementação é do interesse de todos. Isso facilitaria a comparação entre os vários estudos e, assim, desvendaria a complexa fisiopatologia do choque hemorrágico. O objetivo deste protocolo foi desenvolver um novo modelo clinicamente relevante de choque hemorrágico em ratos usando duas fases sucessivas de hemorragia com volume fixo seguido por uma fase fixa de pressão arterial baixa.

Tabela 1: Espécies utilizadas como modelo para choque hemorrágico 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Os diferentes tipos de choque hemorrágico13. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Exemplo da diversidade de modelos experimentais de choque hemorrágico em ratos induzido por um protocolo de pressão fixa. Resumo dos parâmetros para diferentes modelos experimentais de choque hemorrágico. Os vasos mostrados em vermelho são artérias e os mostrados em azul são veias. Para a ressuscitação, o volume de sangue amostrado é usado como referência (sangue: ressuscitação com volume idêntico ao do sangue coletado durante o choque; x2: ressuscitação com um volume duas vezes maior que o do sangue coletado durante o choque; x4: ressuscitação com um volume quatro vezes maior que o do sangue coletado durante o choque). PAM: Pressão Arterial Média; RL: Ringer Lactato 14,15,16,17,18,19,20. Clique aqui para baixar esta tabela.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados e realizados em conformidade com o comitê de ética regional (protocolo (#17858 e #32499, CEEA-Pays de la Loire, França) de acordo com a Diretiva 2010/63/UE da União Europeia. O relatório está de acordo com as diretrizes atuais do ARRIVE e o Guia do National Institutes of Health (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Pub. No. 85-23, revisado em 2011). 1. Estatuto ético e informações gerais sobre os ratos Ratos Wistar Han machos (Charles River, Saint-Germain-Nuelles, França) foram entregues à Unité Thérapeutique Expérimentale com 10 semanas de idade. Aloje os ratos por pelo menos 1 semana sob temperatura padrão (21-24 °C), umidade (40%-60%) e ciclo claro/escuro de 12 h com um período de luz começando às 07h30. Forneça comida e água ad libitum. Use ratos de 11 a 13 semanas de idade pesando 300-400 g para o protocolo. 2. Etapas de configuração e preparação da sala Ligue a estação de anestesia, ajuste a esteira de aquecimento para 37.5 °C e cubra-a com uma cortina não estéril. Esterilize os instrumentos cirúrgicos necessários para o protocolo: pinça atraumática DeBakey (1), tesoura ou bisturi fino e afiado (1), pinça padrão padrão (2), porta-agulhas (1), tesoura de micro dissecação Vannas (1), pinça (1). Prepare cateteres para a veia jugular e artéria femoral.Para o cateter da veia jugular, monte o tubo de polietileno (PE) (PE50) em uma agulha de 23 G com a ponta cortada na extremidade. Para o cateter da artéria femoral, prepare o descrito na etapa 2.3.1 e conecte um tubo PE10 à extremidade do tubo PE50. Preparar o transdutor de pressão e os cateteres para a artéria femoral e veia jugular, preenchendo-o com solução de Ringer com lactato heparinizada a 100 UI/mL. Colocar uma seringa de 2 mL contendo solução de Ringer com lactato heparinizada a 100 UI/mL na extremidade dos cateteres e do transdutor de pressão. Tenha cuidado para não deixar bolhas, pois elas causam defeitos de sinal. Ligue o software associado ao transdutor de pressão e calibre-o de acordo com as instruções do fornecedor. 3. Preparando o rato para a cirurgia Anestesiar o rato com uma caixa de indução (parâmetros: sevoflurano 8%, fluxo de ar: 1 L/min). Após verificar a profundidade da anestesia via reflexo podal, manter a anestesia em sevoflurano 4%, com fluxo aéreo de 0,6 L/min. O uso de analgésicos no pré-operatório foi evitado devido aos efeitos hemodinâmicos dessas moléculas.NOTA: A partir desta etapa, a profundidade da anestesia é avaliada a cada 20 minutos por reflexo podal. Pese o rato, coloque-o em decúbito dorsal em uma esteira de aquecimento e depile-o nas regiões inguinal e cervical. Desinfetar as áreas depiladas com soluções alternadas de iodopovidona a 10% e 4% (3 vezes cada) usando compressas de gaze não estéreis. Aplique uma gota de pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar o ressecamento. Coloque o rato em uma esteira de aquecimento na mesa cirúrgica (decúbito dorsal). Coloque a sonda retal lubrificada para controlar a temperatura do rato. Manter a anestesia em sevoflurano a 4%, com fluxo de ar de 0,6 L/min. Troque as luvas por estéreis, coloque a cortina estéril no rato e corte-a nas regiões inguinal e do pescoço. 4. Canulação da veia jugular Localize a região jugular na região inferior direita do pescoço, acima da clavícula, por pulsação visível. Utilizando a pinça atraumática DeBakey, segure suavemente a pele e, em seguida, faça uma incisão precisa usando uma tesoura fina e afiada ou um bisturi. Aplique uma gota de anestésico local (lidocaína 2%) na área incisada. Corte suavemente o tecido com uma pinça de padrão padrão. Localize a veia jugular e libere-a suavemente de seu compartimento muscular com uma pinça de padrão padrão. Coloque um fio de sutura de seda 4/0 e amarre firmemente o lado distal (em direção à cabeça). Use a sutura com os porta-agulhas para tensionar a veia jugular. Coloque uma sutura 4/0 no lado proximal (em direção ao coração) e prepare um nó de cirurgião sem apertá-lo. Faça uma pequena incisão na veia jugular usando uma tesoura de microdissecação Vannas. Depois de agarrar cuidadosamente a parede da veia com uma pequena pinça, insira o cateter PE50 na veia jugular com a mão ou com uma pinça de padrão padrão. Nesta fase, use uma gaze estéril para limpar eventuais gotas de sangue, que podem vazar da veia. Avance ligeiramente o cateter (0,5 cm) e verifique sua colocação correta na veia retirando uma pequena quantidade de sangue e depois reinjetando-o (o sangue na cânula indica que está na veia). Aperte o nó previamente preparado para prender o cateter. Deixe o cateter no lugar, conectado a uma seringa pré-cheia com solução de Ringer com lactato e cubra a área incisada com uma gaze estéril umedecida. 5. Canulação da artéria femoral Use uma pinça atraumática de DeBakey para agarrar a pele do triângulo de Scarpa da perna esquerda e faça uma incisão com uma tesoura fina e afiada ou um bisturi. Aplique uma gota de anestésico local (lidocaína 2%) na área incisada. Dilacerate suavemente o tecido com uma pinça de padrão padrão. Localize a tríade femoral (artéria, veia e nervo). Passe uma pinça sob a tríade e, usando a segunda pinça padrão padrão, separe suavemente a artéria do nervo e da veia femoral.NOTA: A artéria é menor, rosa e pulsante. Este é um passo crítico; A veia e a artéria são frágeis e podem se romper facilmente. Coloque uma sutura 4/0 e ligue a artéria femoral distalmente (lado da perna). Faça a sutura com os porta-agulhas para tensionar a artéria femoral. Coloque uma sutura 4/0 no lado proximal (lado do coração) e prepare um nó sem fechá-lo. Clampeie a artéria (coloque a pinça a montante da sutura do lado proximal). Incisar a artéria femoral transversalmente com uma tesoura de microdissecação Vannas (um pequeno volume de sangue deve fluir da artéria). Usando uma pinça de padrão padrão, segure suavemente a parede da artéria e canule a artéria femoral com o cateter (PE10 terminado), segurando-o com uma pinça. Desaperte suavemente para verificar se há vazamentos e, em seguida, verifique o sinal de pressão (valida que o cateter está na artéria femoral) e verifique se o sangue não está fluindo de volta para o cateter (sinal de vazamento das válvulas/transdutor de pressão). Se o sinal for bom (valores esperados: pressão arterial sistólica: 120 mmHg, pressão arterial diastólica: 80 mmHg) e não houver sinais de vazamento, avance ligeiramente o cateter (0,5 cm) e aperte o nó do cirurgião previamente preparado. Heparinizar o animal a 100 UI/kg e aplicar uma gaze estéril umedecida sobre a área incisada. Após a cirurgia, mantenha a anestesia com sevoflurano a 3% a uma taxa de fluxo de ar de 0,6 L/min. 6. Protocolo de choque hemorrágico (Figura 1) Fase 1: Estabilização (5 min).Após a heparinização, aguarde 10 min para que os valores de pressão se estabilizem. Faça uma gravação de 5 minutos para os valores hemodinâmicos basais. Fase 2: Exsanguinação (5 min):NOTA: Esta fase corresponde à fase de volume fixo do modelo.Retire 5 mL de sangue da artéria femoral durante 5 min (500 μL / 30 s) usando uma seringa de 1 mL (valores esperados: pressão arterial sistólica: 45 mmHg, pressão arterial diastólica: 30 mmHg). Prepare uma mistura de solução de Ringer com lactato a 50% com 50% de sangue coletado em temperatura ambiente. Coloque a mistura em uma seringa de 2 mL e coloque-a no final da cânula da veia jugular. Fase 3: Choque hemorrágico (75 min)NOTA: Esta fase é a fase de pressão fixa do modelo.Manter a pressão arterial média em uma média de 35 mmHg. Quando a pressão arterial média for superior ou igual a 38 mmHg, retirar 200 μL de sangue pela artéria femoral (média em n = 12 ratos: 10,2 mL). Se a pressão arterial média cair abaixo de 32 mmHg, injete 200 μL de uma mistura de solução de Ringer com 50% de sangue e 50% de lactato através da veia jugular (média em n = 12 ratos: 0,90 mL). Meça o lactato no sangue periférico em uma gota de sangue da extremidade da cauda usando a ponta de uma agulha (26 G) após a preparação estéril da cauda com uma gaze no final da fase de choque hemorrágico. Fase 4: Ressuscitação fluídica intravenosa (20 min)Ressuscitar com uma solução de Ringer com lactato à temperatura ambiente (RT) a 10 mL/kg durante 20 min (taxa de fluxo de 10,5 mL/h para um rato de 350 g) com uma seringa de 20 mL através do cateter jugular com uma bomba de seringa. 7. Fim da cirurgia e recuperação e acompanhamento pós-cirúrgico Clampeie a veia jugular e a artéria femoral e remova o cateter. Vasos ligate. Verifique cuidadosamente se não há vazamento de sangue. Adicione uma gota de anestésico local às áreas incisas. Suturar áreas incisas com pontos subcutâneos e cutâneos usando sutura estéril 5-0. Desinfete com solução de iodopovidona a 10%. Injete buprenorfina por via subcutânea (0,05 mg / kg, 0,3 mL / kg) usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 26 G. Espere o rato desmamar da anestesia enquanto monitora a temperatura. Quando ele mostrar sinais de despertar (vibrissas se movendo, movimentos das patas), remova a sonda retal e coloque o rato em sua gaiola em uma esteira de aquecimento. 10 minutos depois, devolva o rato ao seu quarto de acomodação. Administre buprenorfina por via subcutânea (0,05 mg / kg, 0,3 mL / kg) a cada 8 h. Avalie a frequência respiratória, o comportamento, a temperatura e o lactato sanguíneo 16 h após a indução do choque hemorrágico, conforme descrito na etapa 6.3. Figura 1: Modelo de choque hemorrágico misto de rato. Criado com BioRender.com Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 8. 24 h após a indução do choque hemorrágico Anestesiar o animal conforme descrito no passo 3.1. Coloque o animal na mesa cirúrgica e insira a sonda retal conforme descrito na etapa 3.5. Preparar o cateter para a canulação da artéria carótida conforme descrito para a veia jugular nos passos 2.3 e 2.4. Use uma pinça atraumática DeBakey para agarrar a pele e faça uma incisão no meio do pescoço com uma tesoura fina e afiada ou um bisturi. Aplique uma gota de anestésico local (lidocaína 2%). Dilacerate suavemente o tecido com uma pinça de padrão padrão. Separe as glândulas salivares e abra o músculo traqueal para revelar os anéis traqueais. Pegue a artéria carótida esquerda e separe-a do nervo com uma pinça de padrão padrão (é altamente provável que a respiração do animal acelere). Ligue a artéria carótida distalmente (lado da cabeça) com fio de seda 4/0. Coloque um fio de sutura no lado proximal (lado do coração) e prepare um nó de cirurgião sem fechá-lo. Clampeie a artéria (coloque a pinça a montante da sutura do lado proximal). Incisar a artéria carótida com uma tesoura de microdissecação Vannas (um pequeno volume de sangue deve fluir da artéria). Usando uma pinça de padrão padrão, segure suavemente a parede da artéria para ampliar a abertura e canule a artéria carótida com o cateter fornecido, segurando-a com uma pinça. Desaperte e verifique o sinal de pressão para confirmar a colocação do cateter e verifique se o sangue não está fluindo de volta para o cateter (um sinal de vazamento das válvulas/transdutor de pressão). Se o sinal for bom e não houver vazamento, avance levemente o cateter (0,5 cm) e aperte e prenda o nó cirurgião previamente preparado. Heparinizar o animal a 100 UI/kg e aplicar uma compressa estéril umedecida sobre a incisão. Após a cirurgia, manter a anestesia com sevoflurano a 3% a uma taxa de fluxo aéreo de 0,6 L/min. Aguarde 10 min para registrar os valores hemodinâmicos de 24 h (valores esperados: pressão arterial sistólica: 120 mmHg, pressão arterial diastólica: 60 mmHg). Para avaliar os marcadores plasmáticos de lesão de órgãos, retire 1 mL de sangue da artéria carótida e centrifugue a 1600 x g por 10 min. Alíquota e salve o plasma para análise posterior. Sacrifique o rato imediatamente após medir os valores hemodinâmicos em 24 h e colete sangue.NOTA: O método de eutanásia deve ser adaptado aos parâmetros específicos ou amostras que serão coletadas posteriormente. O grupo simulado é submetido apenas à cirurgia (seções 1-5, 7 e 8) sem o procedimento de choque hemorrágico (seção 6). Os animais foram aleatoriamente designados pelo experimentador entre os grupos sham e choque hemorrágico. Apenas o experimentador estava ciente da alocação do grupo nos diferentes estágios do experimento.

Representative Results

Seguindo o protocolo descrito acima, foram avaliados vários parâmetros hemodinâmicos 24 horas após a indução do choque hemorrágico. A pressão arterial média basal (antes do início do protocolo de choque hemorrágico) é semelhante entre os grupos sham e choque hemorrágico (Figura 2A). Como esperado, a pressão arterial média diminui significativamente com o protocolo de choque hemorrágico, o que pode ser explicado pela queda da pressão arterial diastólica (Pressão arterial média: Sham: 92 mmHg ± 3 mmHg; EH: 82 mmHg ± 2 mmHg; Pressão arterial diastólica: 73 mmHg ± 3 mmHg; FPM: 61 mmHg ± 2 mmHg) (Figura 2B, C). O choque hemorrágico não afeta a pressão arterial sistólica, a pressão de pulso e a frequência cardíaca (Figura 2D-F). O índice de choque (frequência cardíaca/pressão arterial sistólica) e o índice de choque modificado (MSI) (frequência cardíaca/pressão arterial média) são dois preditores de mortalidade em pacientes graves14,15. Quanto mais altos forem os valores, maior será o risco de mortalidade. Nesse modelo, o índice de choque não é modificado entre os dois grupos, enquanto o índice de choque modificado tende a aumentar no choque hemorrágico (MSI: Sham: 4,24 ± 0,11; SH: 4,70 ± 0,15) (Figura 2G,H). Figura 2: Impacto do choque hemorrágico nos parâmetros hemodinâmicos. (A) pressão arterial média basal, (B) pressão arterial média, (C) pressão arterial diastólica, (D) pressão arterial sistólica, (E) pressão de pulso, (F) frequência cardíaca, (G) índice de choque e (H) índice de choque modificado entre animais de choque simulado e hemorrágico. Os resultados são representados como média ± EPM. A significância estatística foi avaliada pelo teste t não pareado. *: p < 0,05; : p < 0,001. n = 6-12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. O comprometimento metabólico global durante o choque hemorrágico pode ser avaliado pela lactatemia. Como esperado, a lactatemia aumentou após o protocolo de choque hemorrágico e 16 h após (Fim do protocolo: Sham: 1,13 mmol/L ± 0,14 mmol/L; SH: 5,98 mmol/L ± 0,39 mmol/L; H+16: Simulação: 1,95 mmol/L ± 0,23 mmol/L; SH: 2,95 mmol/L ± 0,19 mmol/L) (Figura 3A,B). A temperatura e a frequência respiratória são dois componentes da Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS), uma resposta pró-inflamatória característica do estado de choque. Nem a temperatura nem a frequência respiratória são modificadas entre os dois grupos 16 h após a indução do choque hemorrágico (Figura 3C,D). Avaliamos o impacto do choque hemorrágico em alguns parâmetros de comportamento, como postura, atividade, etc. (Arquivo Suplementar 1). O escore comportamental está aumentado no grupo choque hemorrágico 16 h após o protocolo (Sham: 0,33 ± 0,21; SH: 2,27 ± 0,69) (Figura 3E). Figura 3: Impacto do choque hemorrágico na lactatemia, temperatura, frequência respiratória e escore comportamental. (A) Lactatemia ao final do protocolo de choque hemorrágico, (B) lactatemia, (C) temperatura, (D) frequência respiratória e (E) escore comportamental 16 h após a indução do choque hemorrágico entre animais Sham e choque hemorrágico. Os resultados são representados como média ± EPM. A significância estatística foi avaliada pelo teste t não pareado. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. n = 6-12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. O choque hemorrágico está associado a uma disfunção orgânica. Para avaliar se o modelo poderia ser clinicamente relevante, avaliamos marcadores plasmáticos de lesão de órgãos 24 h após o protocolo. A creatininemia (Sham: 19,13 μmol/L ± 0,33 μmol/L; HS: 28,88 μmol/L ± 2,69 μmol/L), a troponina T cardíaca (Sham: 9,38 ng/L ± 1,87 ng/L; HS: 35,62 ng/L ± 2,28 ng/L), e a aspartato e alanina aminotransferase (ASAT: Sham: 221 UI/L ± 48 UI/L; HS: 963 UI/L ± 144 UI/L; ALAT: Simulação: 36 UI/L ± 4 UI/L; FPM: 323 UI/L ± 13 UI/L), que refletem danos aos rins, coração e fígado, respectivamente, aumentam significativamente com o choque hemorrágico (Figura 4). Figura 4: O modelo de choque hemorrágico está associado à disfunção orgânica. (A) creatininemia, (B) troponina T cardíaca, (C) aspartato aminotransferase e (D) níveis de alanina aminotransferase 24 h após a indução do choque hemorrágico entre animais Sham e choque hemorrágico. Os resultados são representados como média ± EPM. A significância estatística foi avaliada pelo teste t não pareado. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. n = 4 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Arquivo suplementar 1: Detalhes da pontuação comportamental Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Neste trabalho, descrevemos pela primeira vez um modelo representativo de choque hemorrágico de rato baseado em uma mistura entre os modelos de pressão fixa e volume fixo. Demonstramos que 24 h após a indução do choque, nosso modelo está associado a uma alteração dos parâmetros hemodinâmicos e do metabolismo.

Devido à sua complexa fisiopatologia, o estudo do choque hemorrágico requer a utilização de modelos animais integrados. De fato, as abordagens in vitro não podem mimetizar todas as vias envolvidas nesta doença. O despertar dos animais após o protocolo de choque hemorrágico é uma etapa que garante uma melhor replicação da situação clínica. Devido à dificuldade envolvida em acordar os animais, poucos estudos incluíram esse estágio. Os raros estudos que acordam os animais os sacrificam em tempos curtos (2 h ou 6 h), o que não reflete totalmente o que está acontecendo com os pacientes 16,18,23,24. Apesar do desenvolvimento de modelos de choque hemorrágico, poucos estudos avaliaram parâmetros (inflamação, apoptose, disfunção orgânica) 24 h após a indução do choque, destacando a dificuldade desse tipo de protocolo 25,26,27. O desenvolvimento de modelos computacionais e matemáticos revolucionou a pesquisa. Numerosos modelos matemáticos de choque hemorrágico foram desenvolvidos, mas a maioria desses modelos não leva em consideração toda a gama de trocas de fluidos corporais durante o choque hemorrágico e requer melhorias antes de uma possível aplicabilidade clínica28. Até o momento, um dos principais desafios é o desenvolvimento de um modelo animal que mimetize a patologia em humanos o mais próximo possível.

Um grande número de modelos de choque hemorrágico é descrito na literatura e difere por meio de abordagens vasculares, volumes de sangue coletados ou pressão alvo13. De forma mais geral, os modelos de choque hemorrágico podem ser classificados em 3 grupos: hemorragia de volume fixo, hemorragia de pressão fixa e hemorragia descontrolada. A padronização e a reprodutibilidade com a hemorragia de volume fixo são difíceis e explicadas pela relação volume sanguíneo/peso corporal, que diminui linearmente com o peso do rato. A hemorragia por pressão fixa é amplamente utilizada, explicando que as configurações (pressão alvo, duração do choque) são muito variáveis de um estudo para outro, dificultando a transposição dos resultados de um modelo para outro. Também é importante ressaltar que o comprometimento hemodinâmico, que desempenha um papel fundamental na fisiopatologia do choque hemorrágico, não é avaliado sistematicamente, o que poderia aumentar a discrepância nos resultados entre os estudos. Por fim, o modelo de hemorragia não controlada, embora clinicamente relevante, levanta questões de reprodutibilidade e ética. Para conciliar ao máximo a relevância clínica, padronização e reprodutibilidade, desenvolvemos um modelo misto com fases de volume fixo e pressão fixa.

No modelo aqui descrito, a temperatura e a frequência respiratória não são modificadas 24 horas após a cirurgia. Isso pode ser explicado pelo fato de a cirurgia ser realizada em condições estéreis, limitando assim a resposta pró-inflamatória. O choque hemorrágico é definido como uma insuficiência circulatória aguda devido à perda de sangue associada a uma queda na pressão arterial. Como nos humanos, esse modelo de choque hemorrágico causa uma diminuição na pressão arterial média, notadamente devido à diminuição da pressão arterial diastólica. Curiosamente, e como descrito anteriormente, a freqüência cardíaca permanece inalterada após a fase de ressuscitação neste modelo de choque hemorrágico 29,30,31. A queda da pressão arterial média provavelmente está associada à redução da perfusão orgânica, levando à disfunção multivisceral, o que pode ser ilustrado pelo aumento de vários marcadores plasmáticos em nosso modelo (creatininemia, troponina T cardíaca, ASAT e ALAT). A interrupção no fornecimento de oxigênio leva ao metabolismo anaeróbio, que causa aumento da lactatemia32. Como descrito anteriormente, esse modelo de choque hemorrágico leva a um aumento nos níveis de lactato sanguíneo30. Esse aumento pode estar associado à isquemia causada ao nível da artéria femoral. No entanto, considerando que os animais do grupo sham apresentam lactatemia fisiológica e foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico do grupo choque hemorrágico, parece que esse aumento está ligado ao protocolo de choque hemorrágico. Em conjunto, todos esses dados confirmam que o protocolo descrito neste estudo permite o desenvolvimento de um novo modelo relevante de choque hemorrágico no rato.

A limitação desse modelo é o uso da heparina, essencial para reduzir a coagulação natural do sangue quando entra em contato com materiais plásticos, como cânulas. No entanto, o uso de heparina pode impactar na coagulopatia associada ao choque hemorrágico traumático33. Este estudo envolve animais machos saudáveis com idades entre 11 e 13 semanas. Considerando que sexo, idade e comorbidades (hipertensão, diabetes, etc.) podem impactar nos resultados, seria relevante avaliar seu impacto em nosso modelo. No protocolo, a etapa de ressuscitação é realizada por meio de injeção de Ringer Lactato, um cristalóide que pode promover coagulopatia e edema tecidual34. Embora o uso de hemoderivados seja ideal, eles são escassos e perecíveis, e pode ser difícil ter um estoque suficiente de sangue de rato para todo o protocolo. Modelos de choque hemorrágico de ressuscitação baseados em cristaloides/coloides são duas abordagens complementares.

Os pontos fortes deste modelo são 1) sua alta reprodutibilidade (ilustrada pela baixa variabilidade nos resultados), 2) sua facilidade de aplicação (a maioria dos instrumentos são clássicos e as abordagens vasculares são conhecidas) e 3) sua relevância clínica, notadamente devido ao despertar animal e à disfunção multivisceral. Com base na pontuação comportamental descrita no Arquivo Suplementar 1, os pontos limite foram estabelecidos. O sacrifício será discutido se for atingida uma pontuação acima de 9, de acordo com a tabela anexa. Se uma pontuação de 11 for alcançada, o animal será sistematicamente sacrificado. Neste estudo, nenhum dos animais atingiu escore superior a 8 e, portanto, nenhum foi excluído do estudo. Isso pode explicar por que o modelo aqui descrito está associado a uma taxa de mortalidade 3 vezes menor do que a do outro estudo de 24 horas (16% vs. 47%)25.

A etapa crítica do modelo é a fase de choque hemorrágico. É importante respeitar a faixa de pressão de 32-38 mmHg. De fato, observamos que a manutenção da pressão arterial média abaixo de 32 mmHg resultou em uma queda rápida e abrupta da pressão. Por outro lado, manter uma pressão acima de 38 mmHg não fornece um modelo suficientemente próximo da realidade clínica. Essas observações estão de acordo com o intervalo de pressão arterial média almejado em outros modelos13.

Em conclusão, demonstramos que o modelo de choque hemorrágico de rato detalhado neste estudo é clinicamente relevante e pode ser útil tanto na compreensão dos mecanismos fisiopatológicos, identificando novos atores/vias biológicas, quanto na identificação de novas estratégias terapêuticas, testando diferentes moléculas candidatas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela “Société Française d’Anesthésie et de Réanimation” (Paris, França), “Fondation d’entreprises Genavie” (Nantes, França), “Fédération française de cardiologie” (França), “Agence nationale de la recherche” (20-ASTC-0032-01-hErOiSmE) (Paris, França) e “Direction Générale de l’Armement” (Paris, França). Thomas Dupas foi apoiado por bolsas da Direction Générale de l’Armement (DGA), França e Région des Pays de la Loire durante seu doutorado. Antoine Persello foi apoiado por bolsas da InFlectis BioScience, França durante seu doutorado. Agradecemos à “Agence Nationale de la Recherche” (Paris, França), “Direction Générale de l’Armement” (Paris, França) e à associação “Sauve ton coeur” (França) pelo apoio a este trabalho. Agradecemos à instalação central da UTE IRS-UN (SFR Bonamy, Nantes Université, Nantes, França) e à instalação central da IBISA Therassay (Nantes, França) por sua assistência e suporte técnico.

Materials

1 mL syringe TERUMO MDSS01SE
2.5 mL syringe TERUMO SS*02SE1
20 mL syringe TERUMO MDSS20ESE
Anesthesia induction chamber TEMSEGA HUBBIV4
BD Microlance 3 23 G needle Becton Dickinson 300800
BD Microlance 3 26 G needle Becton Dickinson 304300
Blood pressure transducer emka TECHNOLOGIES BP_T
Buprecare Axience N/A 1 mL vial, buprenorphine 0.3 mg/mL
DE BAKEY, Atraumatic Vascular Forceps ALLGAIER instrumente medical 09-543-150
Dermal Betadine 10% Mylan N/A 125 mL bottle
Fine Forceps – Curved / Serrated Fine Science Tools 11065-07
GraphPad Prism 8 GraphPad by Dotmatics –
Heating mats TEMSEGA OPT/THERM_MATELASSTEREORATS
Heparin sodium PANPHARMA  N/A 5 mL bottle, 5,000 UI/mL
IOX2 software emka TECHNOLOGIES IOX_BASE_4c + IOX_FULLCARDIO_4a
Iris Scissors – ToughCut Fine Science Tools 14058-11
Lidocaine Fresenius N/A 10 mL bootle, 8.11 mg, lidocaine hydrochloride
MiniHub-V3.2 TEMSEGA PF006
Moria 201/A Vessel Clamp – Straight Fine Science Tools 18320-11
Non sterile compresses Raffin 70189
Non sterile drape Dutscher  30786
Olsen-Hegar Needle Holder with Scissors  Fine Science Tools 12002-12
Polyethylene tubing PE10 PHYMEP BTPE-10
Polyethylene tubing PE50 PHYMEP BTPE-50
Rats Charles Rivers – Male WISTAR HAN (10 weeks)
Rectal probe TEMSEGA SONDE_TEMP_RATS
Ringer Lactates Fresenius Kabi 964175
Scrub Betadine 4% Mylan N/A 125 mL bottle
Sevoflurane Abbott N/A 250 mL bottle, gas 100%
Sevoflurane Vaporizer TEMSEGA SEVOTEC3NSELEC
StatStrip lactate test strips Nova Biomedical 47486
StatStrip Xpress lactate Meter Nova Biomedical 47486
Sterile compresses Laboratoire SYLAMED 211S05-50
Sterile drape Mölnlycke 800330
Steriles gloves MEDLINE MSG7275
Suture Optilene 3097141
Suture for vessels SMI 8150046
Syringe pump Vial médical 16010
usbAMP emka TECHNOLOGIES –
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Vaseline Cooper N/A 10 mL vial
Vitamin A Dulcis (ALLERGAN) Allergan N/A 10 g tube, Retinol
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Dupas, T., Aillerie, V., Vergnaud, A., Pelé, T., Persello, A., Blangy-Letheule, A., Erraud, A., Erfanian, M., Hivonnait, A., Maillard, A., Lecomte, J., Bigot-Corbel, E., Leroux, A. A., Denis, M., Rozec, B., Lauzier, B. Developing a Clinically Relevant Hemorrhagic Shock Model in Rats. J. Vis. Exp. (205), e66523, doi:10.3791/66523 (2024).
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