Измерение стресса эндоплазматического ретикулума и развернутого белкового ответа в Т-клетках, инфицированных ВИЧ-1, и анализ его роли в репликации ВИЧ-1
Summary
В данной статье мы описываем некоторые установленные методы определения стресса эндоплазматического ретикулума (ЭР) и активации развернутого белкового ответа (УПО), уделяя особое внимание инфекции ВИЧ-1. В этой статье также описывается набор протоколов для исследования влияния стресса ER/UPR на репликацию ВИЧ-1 и инфекционность вириона.
Abstract
Вирусные инфекции могут вызывать стресс эндоплазматического ретикулума (ЭР) из-за аномального накопления белка, что приводит к развернутому белковому ответу (UPR). Вирусы разработали стратегии манипулирования UPR хозяина, но в литературе отсутствует подробное понимание модуляции UPR и ее функционального значения во время инфекции ВИЧ-1. В этом контексте в настоящей статье описываются протоколы, используемые в нашей лаборатории для измерения уровней стресса ER и UPR во время инфекции ВИЧ-1 в Т-клетках, а также влияние UPR на репликацию вируса и инфекционность.
Окрашивание тиофлавином Т (ThT) является относительно новым методом, используемым для обнаружения ER-стресса в клетках путем обнаружения белковых агрегатов. Здесь мы проиллюстрировали протокол окрашивания ThT в инфицированных ВИЧ-1 клетках для выявления и количественного определения ER-стресса. Кроме того, стресс ER также был обнаружен косвенно путем измерения уровней маркеров UPR, таких как BiP, фосфорилированный IRE1, PERK и eIF2α, сплайсинга XBP1, расщепления ATF6, ATF4, CHOP и GADD34 в инфицированных клетках ВИЧ-1, с использованием обычного иммуноблоттинга и количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Установлено, что ThT-флуоресценция коррелирует с показателями активации UPR. В данной статье также демонстрируются протоколы анализа влияния стресса ER и модуляции УПО на репликацию ВИЧ-1 с помощью нокдаун-экспериментов, а также использования фармакологических молекул. Влияние УПО на экспрессию/репликацию гена ВИЧ-1 и продукцию вируса анализировали с помощью репортерного анализа люциферазы и ИФА захвата антигена р24 соответственно, тогда как влияние на инфекционность вириона анализировали путем окрашивания инфицированных репортерных клеток. В совокупности этот набор методов обеспечивает всестороннее понимание путей ответа развернутого белка во время инфекции ВИЧ-1, раскрывая его сложную динамику.
Introduction
Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) характеризуется постепенным снижением количества CD4+ Т-лимфоцитов, что приводит к прогрессирующему провалу иммунного ответа. Вирус иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) является возбудителем СПИДа. Это оболочечный одноцепочечный РНК-вирус с двумя копиями РНК на вирион, принадлежащий к семейству ретровирид. Производство высоких концентраций вирусных белков в клетке-хозяине создает чрезмерную нагрузку на механизм сворачивания белка в клетке1. ER является первым компартментом в секреторном пути эукариотических клеток. Он отвечает за производство, изменение и доставку белков к секреторному пути и местам-мишеням внеклеточного пространства. Белки претерпевают многочисленные посттрансляционные изменения и сворачиваются в свою естественную конформацию в ЭР, включая связанное с аспарагином гликозилирование и создание внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей2. Таким образом, в просвете ER присутствуют высокие концентрации белков, которые очень склонны к агрегации и неправильному сворачиванию. Различные физиологические состояния, такие как тепловой шок, микробные или вирусные инфекции, которые требуют усиленного синтеза белка или мутации белка, приводят к стрессу ЭР из-за повышенного накопления белка в ЭР, тем самым нарушая гомеостаз просвета ЭР. Стресс ER активирует сеть высококонсервативных адаптивных путей передачи сигнала, развернутый белковый ответ (UPR)3. UPR используется для восстановления нормального физиологического состояния ER путем выравнивания его развернутой белковой нагрузки и сворачивающей способности. Это вызвано увеличением размера ER и ER-резидентных молекулярных шаперонов и фолдаз, что приводит к повышению способности ER к сворачиванию. UPR также снижает белковую нагрузку ER за счет глобального ослабления синтеза белка на трансляционном уровне и увеличивает клиренс развернутых белков из ER за счет активации ER-ассоциированной деградации (ERAD)4,5.
Стресс ER воспринимается тремя ER-резидентными трансмембранными белками: протеинкиназой R (PKR)-подобной эндоплазматической ретикулумкиназой (PERK), активирующим фактором транскрипции 6 (ATF6) и инозитол-требующим ферментом типа 1 (IRE1). Все эти эффекторы остаются неактивными за счет связывания с шапероном белка теплового шока семейства A (Hsp70) 5 (HSPA5), также известным как связывающий белок (BiP)/78-кДа глюкозорегулируемый белок (GRP78). При стрессе ЭР и накоплении развернутых/неправильно свернутых белков HSPA5 диссоциирует и приводит к активации этих эффекторов, которые затем активируют ряд нижестоящих мишеней, которые помогают в разрешении стресса ЭР и, в экстремальных условиях,способствуют гибели клеток. При диссоциации от HSPA5 PERK аутофосфорилатируется, и его киназная активность активируется7. Его киназная активность фосфорилирует eIF2α, что приводит к трансляционному ослаблению, снижая белковую нагрузку ER8. Однако в присутствии фосфо-эукариотического фактора инициации 2α (eIF2α) нетранслируемые открытые рамки считывания на определенных мРНК, таких как ATF4, становятся предпочтительно транслируемыми, регулируя стресс-индуцированные гены. ATF4 и гомологичный белок C/EBP (CHOP) являются факторами транскрипции, которые регулируют гены, вызванные стрессом, и регулируют пути апоптоза и гибели клеток 9,10. Одной из мишеней ATF4 и CHOP является белок, вызывающий остановку роста и индуцируемый повреждением ДНК (GADD34), который вместе с протеинфосфатазой 1 дефосфорилирует peIF2α и действует как регулятор обратной связи для трансляционного ослабления11. Под воздействием ER-стресса ATF6 диссоциирует от HSPA5, и его сигнал локализации по Гольджи подвергается воздействию, что приводит к его транслокации в аппарат Гольджи. В аппарате Гольджи ATF6 расщепляется протеазой сайта-1 (S1P) и протеазой сайта-2 (S2P) с высвобождением расщепленной формы ATF6 (ATF6 P50). Затем ATF6 p50 перемещается в ядро, где он индуцирует экспрессию генов, участвующих в сворачивании, созревании и секреции белка, а также в деградации белка12,13. Во время ER-стресса IRE1 диссоциирует от HSPA5, мультимеризуется и аутофосфорилируется14. Фосфорилирование IRE1 активирует его РНКазный домен, в частности, опосредуя сплайсинг 26 нуклеотидов из центральной части мРНК X-box-связывающего белка 1 (XBP1)15,16. Это приводит к образованию нового С-конца, придающего трансактивационную функцию, генерируя функциональный белок XBP1s, мощный транскрипционный фактор, контролирующий несколько генов, индуцированных стрессом ER17,18. Совместная активность этих транскрипционных факторов включается генетическими программами, направленными на восстановление гомеостаза ЭР.
Существуют различные методы определения напряжения ER и UPR. К ним относятся традиционные методы анализа маркеров УПО19,20. К различным нетрадиционным методам относятся измерение окислительно-восстановительного состояния UPR и распределения кальция в просвете ER, а также оценка структуры ER. Электронная микроскопия может быть использована для того, чтобы увидеть, насколько увеличивается просвет ER в ответ на стресс ER в клетках и тканях. Однако этот метод занимает много времени и зависит от наличия электронного микроскопа, который может быть доступен не каждой исследовательской группе. Кроме того, измерение потока кальция и окислительно-восстановительного состояния ЭР является сложной задачей из-за доступности реагентов. Кроме того, результаты этих экспериментов очень чувствительны и могут быть подвержены влиянию других факторов клеточного метаболизма.
Мощным и простым методом мониторинга выходов УПО является измерение активации различных сигнальных путей УПО, который десятилетиями использовался в различных сценариях стресса. Эти традиционные методы измерения активации УПО экономичны, осуществимы и предоставляют информацию за меньшее время по сравнению с другими известными методами. К ним относятся иммуноблоттинг для измерения экспрессии маркеров UPR на белковом уровне, таких как фосфорилирование IRE1, PERK и eIF2α, и расщепление ATF6 путем измерения P50-формы ATF6 и экспрессии белков других маркеров, таких как HSPA5, сплайсированный XBP1, ATF4, CHOP и GADD34, а также ОТ-ПЦР для определения уровней мРНК, а также сплайсинг мРНК XBP1.
В данной статье описывается валидированный и надежный набор протоколов для мониторинга стресса ER и активации УПО в инфицированных клетках ВИЧ-1, а также для определения функциональной значимости УПО в репликации и инфекционности ВИЧ-1. В протоколах используются легкодоступные и экономичные реагенты и предоставляется убедительная информация о выходах УПО. Стресс ER является результатом накопления развернутых/неправильно свернутых белков, которые склонны к образованию белковых агрегатов21. Мы описываем способ обнаружения этих белковых агрегатов в ВИЧ-1-инфицированных клетках. Окрашивание тиофлавином Т является относительно новым методом, используемым для обнаружения и количественного определения этих белковых агрегатов. Берио и Верштук описали этот метод для обнаружения и количественного определения белковых агрегатов и, следовательно, уровней стресса ER в живых клетках. Было продемонстрировано, что малая флуоресцентная молекула тиофлавина Т (ThT) избирательно связывается с белковыми агрегатами, особенно амилоидными фибриллами.
В этой статье мы описываем использование ThT для обнаружения и количественной оценки ER-стресса в инфицированных клетках ВИЧ-1 и соотносим его с традиционным методом мониторинга UPR путем измерения активации различных сигнальных путей UPR.
Поскольку также отсутствует исчерпывающая информация о роли УПО во время инфицирования ВИЧ-1, мы предоставляем набор протоколов для понимания роли УПО в репликации ВИЧ-1 и инфекционности вириона. Эти протоколы включают лентивирус-опосредованный нокдаун маркеров УПО, а также лечение фармакологическими индукторами стресса ER. В этой статье также показаны типы считывания, которые могут быть использованы для измерения экспрессии гена ВИЧ-1, вирусной продукции, а также инфекционности производимых вирионов, такие как анализ люциферазы на основе длинных терминальных повторов (LTR), иммуноферментный анализ p24 (ИФА) и репортерный анализ окрашивания β-gal соответственно.
Используя большинство из этих протоколов, мы недавно сообщили о функциональном влиянии инфекции ВИЧ-1 на УПО в Т-клетках23, и результаты этой статьи свидетельствуют о надежности описанных здесь методов. Таким образом, в данной статье представлен набор методов для получения исчерпывающей информации о взаимодействии ВИЧ-1 со стрессом ER и активацией УПО.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сфера применения настоящего протокола включает в себя: (i) обработку запасов вируса ВИЧ-1 и измерение концентрации вируса и инфекционности вириона, (ii) инфицирование Т-клеток ВИЧ-1 и оценку его влияния на стресс ER и различные маркеры УПО, (iii) влияние нокдауна маркеров УПО…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Национальный центр клеточных наук Департамента биотехнологии правительства Индии за внутреннюю поддержку. AT и AD благодарны за поддержку докторских исследований, полученную от Национального центра клеточных наук, Департамента биотехнологии правительства Индии. DM выражает благодарность за Национальную стипендию JC Bose от SERB, правительство Индии.
Materials
| Acrylamamide | Biorad, USA | 1610107 | |
| Agarose | G-Biosciences, USA | RC1013 | |
| Ammonium persulphate | Sigma-Aldrich, USA | A3678 | |
| anti-ATF4 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 11815 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-ATF6 antibody | Abcam, UK | ab122897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-CHOP antibody | Cell Signaling Technology, USA | 2897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-eIF2α antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-11386 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| anti-GADD34 antibody | Abcam, UK | ab236516 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-32233 | Western blot detection Dilution-1:3000 |
| anti-HSPA5 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3177 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-IRE1 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| Anti-mouse HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706516 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
| anti-peIF2α antibody | Invitrogen, USA | 44-728G | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-PERK antibody | Cell Signaling Technology, USA | 5683 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| anti-pIRE1 antibody | Abcam, UK | ab243665 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-pPERK antibody | Invitrogen, USA | PA5-40294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| Anti-rabbit HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706515 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
| anti-XBP1 antibody | Abcam, UK | ab37152 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| Bench top high speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5804R | Rotor- F-45-30-11 |
| Bench top low speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5702R | Rotor- A-4-38 |
| Bis-Acrylamide | Biorad, USA | 1610201 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP biomedicals, USA | 160069 | |
| Bradford reagent | Biorad, USA | 5000006 | |
| CalPhos mammalian Transfection kit | Clontech, Takara Bio, USA | 631312 | Virus stock preparation |
| CEM-GFP | NIH, AIDS Repository, USA | 3655 | |
| Clarity ECL substrate | Biorad, USA | 1705061 | chemiluminescence detecting substrate |
| Clarity max ECL substrate | Biorad, USA | 1705062 | chemiluminescence detecting substrate |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus, Japan | Model:FV3000 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | ASHA78300003 | |
| DMEM | Invitrogen, USA | 11995073 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D2650 | |
| dNTPs | Promega, USA | U1515 | |
| DTT | Invitrogen, USA | R0861 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | 12635 | |
| EtBr | Invitrogen, USA | `15585011 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, USA | 16000044 | |
| G418 | Invitrogen, USA | 11811023 | |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich, USA | G6257 | Infectivity assay |
| Glycine | Thermo Fisher Scientific, USA | Q24755 | |
| HEK-293T | NCCS, India | ||
| HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3 | NIH, AIDS Repository, USA | 114 | |
| Inverted microscope | Nikon, Japan | Model: Eclipse Ti2 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad, USA | 1715124 | |
| Jurkat J6 | NCCS, India | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, USA | M8266 | Infectivity assay |
| MMLV-RT | Invitrogen, USA | 28025013 | |
| MTT reagent | Sigma-Aldrich, USA | M5655 | Cell viability assay |
| N,N-dimethyl formamide | Fluka Chemika | 40255 | Infectivity assay |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific, USA | Q27605 | |
| NaF | Sigma-Aldrich, USA | 201154 | |
| NP40 | Invitrogen, USA | 85124 | |
| P24 antigen capture ELISA kit | ABL, USA | 5421 | |
| PageRuler prestained protein ladder | Sci-fi Biologicals, India | PGPMT078 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, USA | P6148 | |
| pEGFP-N1 | Clontech, USA | 632515 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen, USA | 151140122 | |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 4906837001 | |
| Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC buffer | NEB,USA | M05532 | |
| pLKO.1-TRC | Addgene, USA | 10878 | Lentiviral cloning vector |
| pMD2.G | Addgene, USA | 12259 | VSV-G envelope vector |
| PMSF | Sigma-Aldrich, USA | P7626 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc., USA | 23966 | |
| Potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich, USA | 244023 | Infectivity assay |
| Potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich, USA | P3289 | Infectivity assay |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 5056489001 | |
| psPAX2 | Addgene, USA | 12260 | Lentiviral packaging plasmid |
| Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P8833 | Selection of stable cells |
| PVDF membrane | Biorad, USA | 1620177 | |
| Random primers | Invitrogen, USA | 48190011 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen, USA | 22400105 | |
| SDS | Sigma-Aldrich, USA | L3771 | |
| Steady-Glo substrate | Promega, USA | E2510 | Luciferase assay |
| T4 DNA ligase | Invitrogen, USA | 15224017 | |
| TEMED | Invitrogen, USA | 17919 | |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich, USA | T9033 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich, USA | 596200 | |
| Tris | Thermo Fisher Scientific, USA | Q15965 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | |
| Trizol | Invitrogen, USA | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, USA | P1379 | |
| TZM-bl | NIH, AIDS Repository, USA | 8129 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Optima L90K, USA | 330049 | Rotor-SW28Ti |
| UltraPure X-gal | Invitrogen, USA | 15520-018 | Infectivity assay |
References
- Levy, J. A. . HIV and the Pathogenesis of AIDS. , (2007).
- Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
- Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
- Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
- Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
- Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
- Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
- Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
- Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
- Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
- Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
- Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
- Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
- Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
- Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307 (2010).
- Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
- Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
- Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
- Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855 (1998).
- Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
- Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
- Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
- Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
- Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
- Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
- Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
- Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
- Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
- Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374 (2022).
- Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4 (2021).
- Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536 (2021).
- Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
- Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
- Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156 (2021).
