Summary

Messung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums und der entfalteten Proteinantwort in HIV-1-infizierten T-Zellen und Analyse seiner Rolle bei der HIV-1-Replikation

Published: June 14, 2024
doi:

Summary

In diesem Artikel beschreiben wir einige etablierte Methoden zur Bestimmung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der Aktivierung der ungefalteten Proteinantwort (UPR), mit besonderem Schwerpunkt auf HIV-1-Infektionen. In diesem Artikel wird auch eine Reihe von Protokollen beschrieben, um die Auswirkungen von ER-Stress/UPR auf die HIV-1-Replikation und die Infektiosität der Virionen zu untersuchen.

Abstract

Virusinfektionen können aufgrund einer abnormalen Proteinakkumulation Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER) verursachen, was zu einer ungefalteten Proteinantwort (UPR) führt. Viren haben Strategien entwickelt, um die UPR des Wirts zu manipulieren, aber es fehlt in der Literatur an einem detaillierten Verständnis der UPR-Modulation und ihrer funktionellen Bedeutung während einer HIV-1-Infektion. In diesem Zusammenhang beschreibt der vorliegende Artikel die in unserem Labor verwendeten Protokolle zur Messung des ER-Stressniveaus und der UPR während einer HIV-1-Infektion in T-Zellen sowie die Wirkung der UPR auf die Virusreplikation und Infektiosität.

Die Thioflavin-T-Färbung (ThT) ist eine relativ neue Methode, die zum Nachweis von ER-Stress in den Zellen durch den Nachweis von Proteinaggregaten verwendet wird. Hier haben wir das Protokoll für die ThT-Färbung in HIV-1-infizierten Zellen zum Nachweis und zur Quantifizierung von ER-Stress veranschaulicht. Darüber hinaus wurde ER-Stress auch indirekt nachgewiesen, indem die Spiegel von UPR-Markern wie BiP, phosphoryliertem IRE1, PERK und eIF2α, das Spleißen von XBP1, die Spaltung von ATF6, ATF4, CHOP und GADD34 in HIV-1-infizierten Zellen unter Verwendung von konventionellem Immunblotting und quantitativer reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gemessen wurden. Wir haben festgestellt, dass die ThT-Fluoreszenz mit den Indikatoren der UPR-Aktivierung korreliert. In diesem Artikel werden auch die Protokolle zur Analyse des Einflusses von ER-Stress und UPR-Modulation auf die HIV-1-Replikation durch Knockdown-Experimente sowie die Verwendung pharmakologischer Moleküle vorgestellt. Die Wirkung von UPR auf die HIV-1-Genexpression/-replikation und die Virusproduktion wurde mittels Luciferase-Reporterassays bzw. p24-Antigen-Capture-ELISA analysiert, während die Wirkung auf die Infektiosität der Virionen durch Färbung infizierter Reporterzellen analysiert wurde. Insgesamt bietet dieser Methodensatz ein umfassendes Verständnis der entfalteten Proteinantwortwege während einer HIV-1-Infektion und enthüllt seine komplizierte Dynamik.

Introduction

Das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) ist gekennzeichnet durch eine allmähliche Verringerung der Anzahl der CD4+ T-Lymphozyten, was zu einem fortschreitenden Versagen der Immunantwort führt. Das humane Immundefizienz-Virus-1 (HIV-1) ist der Erreger von AIDS. Es handelt sich um ein umhülltes, einzelsträngiges RNA-Virus mit positivem Sinn und zwei RNA-Kopien pro Virion und gehört zur Familie der Retroviridae. Die Produktion hoher Konzentrationen viraler Proteine in der Wirtszelle belastet die Proteinfaltungsmaschinerie der Zelleübermäßig 1. ER ist das erste Kompartiment im sekretorischen Weg eukaryotischer Zellen. Es ist verantwortlich für die Produktion, Veränderung und Abgabe von Proteinen an den sekretorischen Weg und die Zielstellen im extrazellulären Raum. Proteine durchlaufen zahlreiche posttranslationale Veränderungen und falten sich im ER in ihre natürliche Konformation, einschließlich der Asparagin-gebundenen Glykosylierung und der Bildung intra- und intermolekularer Disulfidbindungen2. Daher sind hohe Konzentrationen von Proteinen im ER-Lumen vorhanden, die sehr anfällig für Aggregation und Fehlfaltung sind. Verschiedene physiologische Zustände wie Hitzeschock, mikrobielle oder virale Infektionen, die eine verstärkte Proteinsynthese oder Proteinmutation erfordern, führen aufgrund einer erhöhten Proteinakkumulation im ER zu ER-Stress, wodurch die ER-Lumen-Homöostase gestört wird. Der ER-Stress aktiviert ein Netzwerk von hochkonservierten adaptiven Signaltransduktionswegen, die Unfolded Protein Response (UPR)3. UPR wird eingesetzt, um den normalen physiologischen Zustand des ER wiederherzustellen, indem seine entfaltete Proteinlast und Faltungskapazität aufeinander abgestimmt werden. Dies wird durch die Erhöhung der ER-Größe und der ER-residenten molekularen Chaperone und Foldasen erreicht, was zu einer Erhöhung der Faltungsfähigkeit des ER führt. UPR verringert auch die Proteinlast des ER durch globale Proteinsynthese-Dämpfung auf translationaler Ebene und erhöht die Clearance von ungefalteten Proteinen aus dem ER durch Hochregulierung des ER-assoziierten Abbaus (ERAD)4,5.

ER-Stress wird von drei ER-residenten Transmembranproteinen wahrgenommen: Proteinkinase R (PKR)-ähnliche endoplasmatische Retikulumkinase (PERK), aktivierender Transkriptionsfaktor 6 (ATF6) und Inositol-erforderndes Enzym Typ 1 (IRE1). Alle diese Effektoren werden inaktiv gehalten, indem sie an das Chaperon Heat shock protein family A (Hsp70) member 5 (HSPA5) binden, das auch als Bindungsprotein (BiP)/78-kDa-glukosereguliertes Protein (GRP78) bekannt ist. Bei ER-Stress und Akkumulation von ungefalteten/fehlgefalteten Proteinen dissoziiert HSPA5 und führt zur Aktivierung dieser Effektoren, die dann eine Reihe von nachgeschalteten Zielen aktivieren, die bei der Auflösung des ER-Stresses helfen und unter extremen Bedingungen den Zelltod fördern6. Nach der Dissoziation von HSPA5 autophosphoryliert PERK, und seine Kinaseaktivität wird aktiviert7. Seine Kinaseaktivität phosphoryliert eIF2α, was zu einer translationalen Abschwächung führt und die Proteinlast des ER8 senkt. In Gegenwart des phospho-eukaryotischen Initiationsfaktors 2α (eIF2α) werden jedoch nicht-translatierte offene Leserahmen auf spezifischen mRNAs, wie z. B. ATF4, bevorzugt translatiert und regulieren stressinduzierte Gene. ATF4 und C/EBP homologes Protein (CHOP) sind Transkriptionsfaktoren, die stressinduzierte Gene regulieren und die Apoptose und den Zelltod regulieren 9,10. Eines der Ziele von ATF4 und CHOP ist das Wachstumsarrest und DNA-Schadens-induzierbare Protein (GADD34), das zusammen mit der Proteinphosphatase 1 peIF2α dephosphoryliert und als Rückkopplungsregulator für die translationale Dämpfung fungiert11. Unter ER-Stress dissoziiert ATF6 von HSPA5 und sein Golgi-Lokalisierungssignal wird exponiert, was zu seiner Translokation in den Golgi-Apparat führt. Im Golgi-Apparat wird ATF6 durch die Protease an Stelle 1 (S1P) und an der Protease an Stelle 2 (S2P) gespalten, um die gespaltene Form von ATF6 (ATF6 P50) freizusetzen. ATF6 p50 wird dann in den Zellkern transloziert, wo es die Expression von Genen induziert, die an der Proteinfaltung, -reifung und -sekretion sowie am Proteinabbau beteiligt sind12,13. Während ER-Stress dissoziiert IRE1 von HSPA5, multimerisiert und autophosphoryliert14. Die Phosphorylierung von IRE1 aktiviert seine RNase-Domäne und vermittelt spezifisch das Spleißen von 26 Nukleotiden aus dem zentralen Teil der mRNA des X-Box-Bindungsproteins 1 (XBP1)15,16. Dies erzeugt einen neuartigen C-Terminus, der eine Transaktivierungsfunktion verleiht, und erzeugt ein funktionelles XBP1s-Protein, einen potenten Transkriptionsfaktor, der mehrere ER-Stress-induzierte Gene steuert17,18. Die kombinierte Aktivität dieser Transkriptionsfaktoren schaltet genetische Programme ein, die darauf abzielen, die ER-Homöostase wiederherzustellen.

Es gibt verschiedene Methoden, um ER-Stress und UPR zu erkennen. Dazu gehören die herkömmlichen Methoden zur Analyse der UPR-Marker 19,20. Zu den verschiedenen unkonventionellen Methoden gehören die Messung des Redoxzustands des UPR und der Calciumverteilung im ER-Lumen sowie die Beurteilung der ER-Struktur. Die Elektronenmikroskopie kann verwendet werden, um zu sehen, wie stark sich das ER-Lumen als Reaktion auf ER-Stress in Zellen und Geweben vergrößert. Diese Methode ist jedoch zeitaufwändig und hängt von der Verfügbarkeit eines Elektronenmikroskops ab, das möglicherweise nicht jeder Forschungsgruppe zur Verfügung steht. Auch die Messung des Calciumflusses und des Redoxzustands des ER ist aufgrund der Verfügbarkeit von Reagenzien eine Herausforderung. Darüber hinaus sind die Ergebnisse dieser Experimente sehr empfindlich und könnten von anderen Faktoren des Zellstoffwechsels beeinflusst werden.

Eine leistungsfähige und einfache Technik zur Überwachung der UPR-Ausgänge ist die Messung der Aktivierung der verschiedenen Signalwege der UPR und wird seit Jahrzehnten in verschiedenen Stressszenarien eingesetzt. Diese herkömmlichen Methoden zur Messung der UPR-Aktivierung sind wirtschaftlich, praktikabel und liefern die Informationen in kürzerer Zeit als andere bekannte Methoden. Dazu gehören Immunblotting zur Messung der Expression von UPR-Markern auf Proteinebene, wie z. B. die Phosphorylierung von IRE1, PERK und eIF2α und die Spaltung von ATF6 durch Messung der P50-Form von ATF6 und die Proteinexpression anderer Marker wie HSPA5, gespleißtes XBP1, ATF4, CHOP und GADD34 sowie RT-PCR zur Bestimmung der mRNA-Spiegel sowie das Spleißen von XBP1-mRNA.

Dieser Artikel beschreibt eine validierte und zuverlässige Reihe von Protokollen zur Überwachung von ER-Stress und UPR-Aktivierung in HIV-1-infizierten Zellen und zur Bestimmung der funktionellen Relevanz von UPR für die HIV-1-Replikation und Infektiosität. Die Protokolle verwenden sowohl leicht verfügbare als auch kostengünstige Reagenzien und liefern überzeugende Informationen über die UPR-Ausgänge. ER-Stress ist das Ergebnis der Akkumulation von ungefalteten/fehlgefalteten Proteinen, die zur Bildung von Proteinaggregaten neigen21. Hiermit beschreiben wir eine Methode, um diese Proteinaggregate in HIV-1-infizierten Zellen nachzuweisen. Die Thioflavin-T-Färbung ist eine relativ neue Methode, die zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser Proteinaggregate verwendet wird22. Beriault und Werstuck beschrieben diese Technik zum Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinaggregaten und damit von ER-Stress in lebenden Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass das kleine fluoreszierende Molekül Thioflavin T (ThT) selektiv an Proteinaggregate, insbesondere Amyloidfibrillen, bindet.

In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von ThT zum Nachweis und zur Quantifizierung von ER-Stress in HIV-1-infizierten Zellen und korrelieren sie mit der herkömmlichen Methode zur Überwachung der UPR, indem wir die Aktivierung verschiedener Signalwege der UPR messen.

Da es auch an umfassenden Informationen über die Rolle der UPR während der HIV-1-Infektion mangelt, stellen wir eine Reihe von Protokollen zur Verfügung, um die Rolle der UPR bei der HIV-1-Replikation und der Virioninfektiösität zu verstehen. Diese Protokolle umfassen sowohl den Lentivirus-vermittelten Knockdown von UPR-Markern als auch die Behandlung mit pharmakologischen ER-Stressinduktoren. Dieser Artikel zeigt auch die Arten von Auslesungen, die zur Messung der HIV-1-Genexpression, der Virusproduktion sowie der Infektiosität der produzierten Virionen verwendet werden können, wie z. B. der Long Terminal Repeat (LTR)-basierte Luciferase-Assay, der p24-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bzw. der β-Gal-Reporterfärbe-Assay.

Unter Verwendung der meisten dieser Protokolle haben wir kürzlich über die funktionelle Bedeutung einer HIV-1-Infektion auf die UPR in T-Zellenberichtet 23, und die Ergebnisse dieses Artikels deuten auf die Zuverlässigkeit der hier beschriebenen Methoden hin. Daher stellt dieser Artikel eine Reihe von Methoden zur Verfügung, um umfassende Informationen über das Zusammenspiel von HIV-1 mit ER-Stress und UPR-Aktivierung zu erhalten.

Protocol

HINWEIS: Bei den hier verwendeten Zelllinien handelt es sich um HEK-293T und Jurkat J6 (eine CD4+T-Zelllinie), die aus dem Cell Repository, NCCS, Pune, Indien, bezogen wurden; TZM-bl, eine von HeLa abgeleitete Zelllinie, die Kopien der β-Galactosidase- und Luciferase-Gene unter dem HIV-1-Long Terminal Repeat (LTR)-Promotor24 und CEM-GFP (einer weiteren CD4+ T-Reporterzelllinie)25 enthält, wurden aus dem NIH AIDS Repository, USA, gewonnen. 1. Vorbereitung und Lagerung von HIV-1-Virus-Vorräten HIV-1 Virus StammaufbereitungHINWEIS: Es wird empfohlen, bei allen Experimenten mit HIV-1 die internationalen Richtlinien zur biologischen Sicherheit zu befolgen, wie sie im Handbuch der Weltgesundheitsorganisation (WHO) oder der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) verfügbar sind. Der Umgang mit dem Virus und alle Experimente mit dem lebenden Virus sollten nur in einer geeigneten Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden, die mindestens in einem Containment-Labor der Stufe BSL2 untergebracht ist. Die Herstellung von infektiösen HIV-1-Partikeln unter Verwendung eines Calciumphosphat-Transfektionskits für Säugetiere wird in diesem Abschnitt des Protokolls beschrieben.HEK-293T-Zellen in 90-mm-Schalen mit 10 ml vollständigem (ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin) DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II Typ A2 säen und ca. 12 h in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C aufbewahren, so dass der Zusammenfluss der Zellen zwischen 50 % und 60 % liegt. Am nächsten Tag stellen Sie die Transfektionsmischung her: Bereiten Sie Lösung A vor, die 25 μg pNL4.3 (ein molekularer Klon von HIV-1) Plasmid-DNA in sterilem Puffer, 86,8 μl 2 M CaCl 2 und das restliche sterile Wasser enthält, um das endgültige Volumen von 700 μl für jede Platte zu erhalten. Bereiten Sie Lösung B mit 700 μl 2x HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (HBS) für 1 Platte vor. Passen Sie dann die Berechnung für die Gesamtzahl der Platten an. Geben Sie nun Lösung B tropfenweise zu Lösung A, während Sie Lösung A kontinuierlich vortexen. Das Gesamtvolumen der Transfektionsmischung beträgt nun 1,4 mL für eine Platte.HINWEIS: Die präzise tropfenweise Zugabe von Lösung B zu Lösung A während des kontinuierlichen Vortexens führt zur Bildung perfekter Transfektionskomplexe. Inkubieren Sie diese Mischung bei Raumtemperatur (RT) für ca. 20 min. Geben Sie dann die Mischung langsam tropfenweise auf jede Platte mit frischen 9 ml vollständigem DMEM und geben Sie die Platten in den CO2 -Inkubator. Tauschen Sie das vorhandene Medium nach 8-10 h durch frische 10 mL vollständiges DMEM aus. Nach 24 Stunden nach dem Medienwechsel den Überstand (der die Viruspartikel enthält) von allen Platten in konischen Röhrchen sammeln. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 600 x g mit einer Tischzentrifuge mit niedriger Drehzahl (Materialtabelle), um Zellreste zu entfernen. Der Überstand wird in Polyallomer-Ultrazentrifugenröhrchen überführt und in den Ausschwingrotor einer Ultrazentrifuge eingesetzt (Materialtabelle). Überprüfen Sie die Gewichte der Röhrchenhalter auf Gleichgewicht und stellen Sie sie bei Bedarf mit einem sterilen Medium ein. Ultrazentrifuge bei 1,41,000 x g für 2,5 h bei 4 °C. Nehmen Sie danach die Röhrchen vorsichtig heraus und dekantieren Sie den Überstand langsam in der Biosicherheitswerkbank. Fügen Sie dem Pellet (das jetzt das konzentrierte Virus ist) in jedem Röhrchen 1 ml unvollständiges RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 Medium hinzu und pipettieren Sie kräftig, um das Pellet zu entfernen.HINWEIS: Das Pellet nach der Ultrazentrifuge ist für das bloße Auge fast unsichtbar. Es muss also darauf geachtet werden, RPMI 1640 in die Mitte des Rohrs zu geben, damit das Pellet richtig gelöst wird. Fügen Sie anschließend 25 μl 1 M HEPES pH 7,4 zu den 1 ml Virussuspension hinzu. Aliquotieren Sie 50 μl der Suspension in 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und lagern Sie sie sofort in einem -80 °C Gefrierschrank zur Langzeitlagerung. Quantifizierung der Viruskonzentration und der Infektiosität des VirionsHINWEIS: Für die Berechnung der Infektiosität des Virus ist es wichtig, zunächst seine Konzentration zu quantifizieren, was mit dem p24 Antigen Capture ELISA erfolgt (gemäß den Anweisungen des Herstellers und wird daher hier nicht beschrieben; siehe Materialtabelle). Dieser Prozess gibt die Konzentration des Virus in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μL) des Stammes an, die dann verwendet wird, um die infektiöse Virionzahl im Stamm durch das folgende Experiment in TZM-bl-Reporterzellen26 zu identifizieren.Zählen und säen Sie 0,1 x 106 TZM-bl-Zellen in einer 24-Well-Platte mit 500 μl vollständigem DMEM für jede Vertiefung und bewahren Sie sie 10-12 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator auf. Stellen Sie sicher, dass die Zellen zu 50 % bis 60 % konfluent sind, bevor Sie mit der Infektion für die Virusquantifizierung beginnen. Wechseln Sie das vorhandene Medium mit 250 μl frischem vollständigem DMEM in jede Vertiefung.HINWEIS: Bewahren Sie eine Positivkontrolle gut auf, um einen experimentellen Fehler auszuschließen. Berechnen Sie die Menge an Stammviren, die für Infektionen von 1 ng, 0,1 ng und 0,01 ng in Duplikaten benötigt wird. Geben Sie die entsprechende Menge Virus in die Vertiefungen und halten Sie die Platte im Inkubator 4 h lang bei 37 °C. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 μl unvollständigem DMEM und fügen Sie dann 500 μl vollständiges DMEM hinzu. Fahren Sie nach 36 Stunden Medienwechsel mit dem β-Gallonen-Färbeverfahren fort.Entsorgen Sie das vorhandene Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml PBS. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 500 μl der Fixierlösung (0,25 % Glutaraldehyd in PBS) in jede Vertiefung geben und 5-7 Minuten lang bei RT in der Biosicherheitswerkbank inkubieren. Bereiten Sie die Färbelösung wie in Tabelle 1 angegeben vor. Halten Sie es von Licht fern, da X-Gal lichtempfindlich ist. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL PBS. Die Zellen mit 500 μl frisch zubereiteter Färbelösung überlagern und bei 37 °C im Dunkeln 2-18 h inkubieren. Um die Reaktion danach zu stoppen, spülen Sie die Zellen zweimal mit 500 μl 3 % Dimethylsulfoxid (DMSO) in PBS und halten Sie die Zellen dann in 500 μl frischem PBS. Zählen Sie die blauen infizierten Zellen (wie in Abbildung 1A gezeigt) unter dem Mikroskop in 10-facher Vergrößerung für 5 zufällige Felder. Nehmen Sie eine durchschnittliche Zählung der 5 Felder und multiplizieren Sie diese mit dem Feldfaktor und dem Verdünnungsfaktor. Damit werden die infektiösen Virionpartikel im Virusbestand quantifiziert.HINWEIS: Bei einer 24-Well-Platte beträgt der Feldfaktor 75. Komponenten Präparat Erforderliches Volumen PBS Bereiten Sie 1x PBS aus einem Vorrat von 10x PBS zu 14 mL Kalium-Ferri-Ferrocyanid Lösen Sie 0,82 g Kaliumferricyanid und 1,06 g Kaliumferrocyanid in 25 mL 1x PBS 0,75 mL Magnesiumchlorid 1 M in 1 mL von 1x PBS 15 μL X-Gal 30 mg in 0,6 ml N,N-Dimethylformamid (in dunklem Zustand) auflösen 0,3 mL Gesamt = 15 mL Tabelle 1: Liste der Komponenten, die für die β-Gal-Färbung in TZM-bl-Zellen erforderlich sind. 2. HIV-1-Infektion von T-Zelllinien Tauen Sie eine immortalisierte T-Zelllinie auf und kultivieren Sie sie. In dieser Studie wurde eine CEM-GFP-Zelllinie verwendet, die in einem vollständigen RPMI 1640-Medium kultiviert wurde, das mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und 500 μg/ml G418 ergänzt wurde. Zählen und entnehmen Sie 2 Millionen Zellen für jeden Zeitpunkt (nicht infiziert, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h). Ernten Sie die nicht infizierten Zellen sofort, indem Sie 5 Minuten lang bei 100 x g zentrifugieren und Zelllysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,12 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 % NP40, 0,5 mM NaF, 1 mM DTT), ergänzt mit Proteaseinhibitor-Cocktail, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 1x Phosphatase-Inhibitor (50 μl für 1-3 Millionen Zellen) oder lysieren Sie in Trizol-Reagenz (1 mL für 1-3 Millionen Zellen) zur RNA-Isolierung (siehe Tabelle von Materialien). Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL vollständigem RPMI 1640-Medium, das Polybren (5 μg/ml) bei 100 x g für 5 min bei RT enthält. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 mL vollständigem Medium.HINWEIS: Polybren ist ein kationisches Polymer, das zur Verbesserung retroviraler Infektionen in Säugetierzellen verwendet wird. Resuspendieren Sie die 8 Millionen Zellen in 1 ml Polybrene, das das vollständige Medium enthält. Berechnen Sie nun das Volumen der Virusbrühe, die für 4 Millionen Virionpartikel benötigt wird, fügen Sie die Virusbrühe hinzu und erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 2 ml, indem Sie das gesamte Medium hinzufügen. Dies macht es zu einem Trägheitsmoment von 0,5. Halten Sie die Zellen im CO2 -Inkubator 4 h lang bei 37 °C, wobei alle 30-45 Minuten intermittierend geklopft wird. Nach 4 Stunden schleudern Sie die Zellen herunter und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig in der Biosicherheitswerkbank mit geeigneten Entsorgungsmethoden.HINWEIS: Ab diesem Schritt zentrifugieren Sie die Zellen bei 100 x g für 5 min bei RT. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml unvollständigem Medium. Resuspendieren Sie die Zellen in 8 ml vollständigem Medium, was 1 Million Zellen/ml ergibt. In einer 6-Well-Gewebekulturplatte wird die gleiche Anzahl von Zellen in der erforderlichen Anzahl von Wells ausgesät und die Platte in einem CO2 -Inkubator bei 37 °C gehalten. In den nächsten 4 Tagen ernten Sie die Zellen alle 24 Stunden durch Zugabe von Zelllysepuffer. Sammeln Sie auch den Überstand und geben Sie ihn sofort in den -80 °C heißen Gefrierschrank. Um zu überprüfen, ob eine Infektion stattgefunden hat, fahren Sie mit dem p24-Antigen-Capture-ELISA für alle Zeitpunkte fort. Nehmen Sie die richtigen Verdünnungen für die Zeitpunkte vor, d.h. eine niedrigere Verdünnung für die Anfangszeitpunkte und eine höhere für spätere Zeitpunkte zwischen 1:50 und 1:500. Stellen Sie die Messwerte in einer Grafik dar, die den Verlauf der Infektion darstellt (Abbildung 1B). 3. Thioflavin-T-Färbung zur Bestimmung des ER-Stresses Fixieren Sie jeweils 1 Million nicht infizierte und 0,5 MOI infizierte CEM-GFP-Zellen (72 h infizierte Zellen) mit 200 μl 4% Paraformaldehyd in PBS für 20 min bei RT. Pelletieren Sie die Zellen bei 100 x g für 5 min und behandeln Sie 5 Minuten lang mit 500 μl 0,1 M Glycin, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 500 μl PBS. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl PBS. Montieren Sie die Objektträger, Filterkarten und Probenkammern. Geben Sie die 100 μl resuspendierten Zellen in die Probenkammern und drehen Sie die Zellen 4 Minuten lang bei 1000 x g , um die Zellen an den Objektträgern in einer Zytozentrifuge zu haften (Materialtabelle).HINWEIS: Nach der Zytozentrifugenzentrifugation wären nicht genügend Zellen auf dem Objektträger immobilisiert, wenn die Zellsuspension zu stark verdünnt ist. Es ist wahrscheinlich, dass die Zellen nach der Zytozentrifuge verklumpen und schlecht verteilt sind, wenn die Zellsuspension sehr konzentriert ist. Permeabilisieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit Tropfen von 0,1 % Triton-X-100 in PBS (genug, um den Bereich abzudecken, an dem die Zellen anhaften) und waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie tropfenweise PBS auftragen und das PBS mit einem Gewebe abwischen, indem Sie den Objektträger kippen. Inkubieren Sie die Zellen mit 10 μl 5 μM Thioflavin T für 30 min.HINWEIS: Nach der Inkubation mit ThT nicht waschen. Montieren Sie die Objektträger mit 5 μl Eindeckmedium (80 % Glycerin v/v, 20 % PBS v/v und 8 mg/ml 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan [DABCO]), legen Sie Deckglas auf und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack. Lassen Sie die Folien trocknen.HINWEIS: Achten Sie bei all diesen Schritten darauf, dass die Zellen nicht austrocknen. Nehmen Sie die konfokalen Bilder von fixierten Zellen mit einer 63-fachen Glycerin-Immersionslinse an einem konfokalen Mikroskop auf (siehe Materialtabelle). Passen Sie die folgenden Anregungs- und Emissionseinstellungen an: GFP (z. B. 494 nm, Em. 519 nm) und ThT (z. B. 458 nm, Em. 480-520 nm).HINWEIS: Jeder Fluoreszenzkanal sollte sequenziell und nicht gleichzeitig abgebildet werden, um Kanalüberlappungen zu vermeiden. GFP wurde als Hinweis auf eine HIV-1-Infektion gewertet, da CEM-GFP-Zellen GFP unter der Regulation des LTR-Promotors aufweisen, der bei einer HIV-1-Infektion feuert25. Konvertieren Sie die Fluoreszenzbilder in 8-Bit, bevor Sie sie durch Schwellenwertanalyse quantifizieren. Quantifizieren Sie die Intensität jeder Zelle manuell mit einer Software wie Image J (~50 Zellen)27. Zeichnen Sie das Diagramm mit der Intensität der einzelnen Zellen als Punkte auf der Y-Achse anhand der Kriterien für nicht infizierte und infizierte Zellen. Um die Wirksamkeit dieses Protokolls zu demonstrieren, nehmen Sie eine Positivkontrolle, z. B. eine Thapsigargin-Behandlung (bekannter ER-Stressinduktor), in diesem Fall28. Behandeln Sie 1 Million CEM-GFP-Zellen mit jeweils 1 μl DMSO (Fahrzeugkontrolle) und 100 nM Thapsigargin für 12 Stunden. Ernten Sie die Zellen und verfahren Sie die ThT-Färbung, wie bei infizierten Proben beschrieben (Schritte 3.1-3.8).HINWEIS: Für diese Proben ist keine GFP-Fluoreszenz erforderlich. Daher wird in der konfokalen Mikroskopie nur die ThT-Fluoreszenz erfasst. 4. Bestimmung der Aktivierung und Expression verschiedener UPR-Marker HINWEIS: Um die Expression von UPR-Markern zu bestimmen, werden zwei Methoden verwendet: Immunoblotting und RT-PCR. Für das Immunblotting ernten Sie die 0,5 MOI HIV-1-infizierten CEM-GFP-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion (24 h, 48 h, 72 h und 96 h nach der Infektion) und resuspendieren Sie das Zellpellet in Lysepuffer (wie in Schritt 2.2 erwähnt). Alternativ werden die Zellpellets für die RT-PCR in Trizol-Reagenz (1 mL für 1-3 Millionen Zellen) lysiert (siehe Materialtabelle). Die in Lysepuffer und Trizol-Reagenz resuspendierten Zellen können bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert werden. Immunoblotting zur Analyse von UPR-Markern.Halten Sie die resuspendierten Zellen 45 Minuten lang im Lysepuffer auf Eis mit intermittierendem Mischen mit einem Wirbel. Pelletieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 18000 x g mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge (siehe Materialtabelle). Sammeln Sie den Überstand in einer frischen Tube. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration in jeder Probe mit Bradford oder einem ähnlichen Reagenz. Nehmen Sie für jede Probe eine gleiche Proteinkonzentration und bereiten Sie die Proteinproben in Laemmli-Puffer vor (6x Puffer: 250 mM Tris-Cl pH 6,8, 10 % SDS, 30 % Glycerin und 0,02 % Bromphenolblau; 5 % β-Mercaptoethanol).HINWEIS: Für das Immunblotting wurde für jeden UPR-Marker ein Minimum von 60-80 μg Protein verwendet. Die Proteinproben bei 96 °C 5 min kochen und kurz schleudern. Lösen Sie die Proteinproben auf einem 10%-12% SDS-PAGE-Gel auf und übertragen Sie die Proteine auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran (siehe Materialtabelle). Mit 5 % fettfreier Trockenmilch oder Rinderserumalbumin (BSA) für 1-2 h blockieren, zweimal mit TBST (20 mM Tris pH7,4 und 0,137 M NaCl; 0,1 % Tween 20) waschen und mit proteinspezifischen Primärantikörpern gegen UPR-Marker (siehe Materialtabelle) in einer Wippe über Nacht bei 4 °C untersuchen. Am nächsten Tag nach zweimaligem Waschen der Blots mit TBST 1,5 h lang mit den entsprechenden Sekundärantikörpern sondieren. Waschen Sie die Blots erneut mit TBST und visualisieren Sie die Proteinbanden mit einem Chemilumineszenz-detektierenden Substrat (siehe Materialtabelle) in einem Western Blot Imaging Instrument. RT-PCRIsolieren Sie die Gesamt-RNA aus den Zellen mit dem Trizol-Reagenz (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie die cDNA aus gleicher RNA-Konzentration mit der Reverse-Transkriptase des Moloney-Maus-Leukämievirus (MMLV-RT) vor (siehe Materialtabelle). Analysieren Sie die Modulation der mRNA-Expression von HSPA5, gespleißtem XBP1, ATF4, CHOP und GADD34 mittels qRT-PCR mit genspezifischen Primern (Tabelle 2). Kurz gesagt, bereiten Sie 10 μl Reaktionsgemische vor, die cDNA-Template (100 ng), 5 μl SYBR Green Farbstoff (siehe Materialtabelle) und 10 pmol jedes genspezifischen Oligonukleotid-Primerpaares enthalten. Stellen Sie die Lautstärke mit sterilem H2O ein. Lassen Sie die Mischungen auf einer Real-Time-PCR-Maschine mit dem folgenden Programm laufen: Erstdenaturierung bei 95 °C für 3 Minuten und 40 Zyklen von 95 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s, gefolgt von der Schmelzkurvenanalyse. Berechnen Sie die Faltungsänderung in der Expression des Zielgens relativ zum Haushaltsgen (z. B. β-Aktin) wie folgt:Faltenänderung = 2-Δ(ΔCT)Dabei ist ΔCT = CT (Ziel) − CT (Haushaltsgen)und Δ(ΔCT) = ΔCT (behandelt) -ΔCT (Kontrolle) Um das Spleißen von XBP1 weiter zu bestätigen, wird eine semiquantitative RT-PCR mit nicht infizierten und 72 h infizierten Proben durchgeführt.HINWEIS: Das Spleißen der XBP-1-mRNA wird mittels RT-PCR an der Spleißstelle untersucht. Die cDNA wird mit XBP1-Primern (Tabelle 2) unter Verwendung eines High-Fidelity-PCR-Mastermixes (siehe Materialtabelle) unter folgenden Bedingungen amplifiziert: 1 Zyklus mit 98 °C für 30 s, gefolgt von 5 Zyklen mit 98 °C für 15 s, 65*Δ-5 °C für 30 s und 72 °C für 30 s, gefolgt von 30 Zyklen mit 98 °C für 15 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung um 72 °C für 10 min und Halten bei 4 °C. Trennen Sie die Amplikons auf einem 2,5%igen Agarose-Gel, das 50 ng Ethidiumbromid/ml enthält, und visualisieren Sie sie in einem Gel-Doc-Instrument. Die gespleißte XBP1-Bande ist um 26 Nukleotide kleiner. 5. Knockdown von UPR-Markern und Analyse der HIV-1-LTR-gesteuerten Genexpression und Virusproduktion Präparation von shRNA-Konstrukten für den Knockdown von UPR-MarkernErstellung von shRNA-Konstrukten unter Verwendung des pLKO.1-TRC-Vektorrückgrats (lentiviraler Klonierungsvektor)29. Konstruieren Sie zwei shRNA-Konstrukte für jedes Gen (IRE1, PERK, ATF6 und HSPA5). Sense- und Anti-Sense-Oligonukleotide, die auf die mRNA des jeweiligen Gens abzielen, wurden vom RNAi-Konsortium (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) entwickelt (Tabelle 3).HINWEIS: Auf ähnliche Weise können shRNA-Konstrukte für andere UPR-Marker hergestellt werden. Die Primer (je 100 nM Vorwärts- und Rückwärts) werden bei 95 °C geglüht und anschließend schrittweise auf RT abgekühlt. Dann ligieren Sie es mit einer T4-DNA-Ligase in die Age1 – und EcoRI-Stellen des pLKO.1-Vektors (siehe Materialtabelle). Bestätigen Sie die Sequenz durch DNA-Sequenzierung.HINWEIS: Ein shRNA-Konstrukt, das auf das LacZ-Gen abzielt, wird als Nicht-Targeting-Kontrolle verwendet. Knockdown von PERK, ATF6, IRE1 und HSPA5 in HEK-293T-Zellen, Luciferase-Assay und p24-ELISAEine Mischung aus shRNA-Konstrukt (0,9 μg) und einem Transfektionsreagenz wie Polyethylenimin (PEI) (3 μl PEI für 1 μg DNA) (siehe Materialtabelle) in 50 μl serumfreiem Medium durch Vortexen vorbereiten und 20 min inkubieren. Aus konfluenten HEK-293T-Zellen, die einen Kolben enthalten, trypsinisieren und säen ~0,25 x 106 Zellen zusammen mit der Transfektion, mischen Sie sie in einer 24-Well-Platte, wodurch ein Gesamtvolumen von 125 μl entsteht, und inkubieren Sie für 6 Stunden bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator. Diese Methode wird als umgekehrte Transfektion bezeichnet, bei der die Zellen zusammen mit der Transfektionsmischung ausgesät werden. Geben Sie nach 6 Stunden 125 μl des vollständigen Mediums in die Vertiefungen und resuspendieren Sie die Zellen für eine gleichmäßige Aussaat.HINWEIS: Bei Knockdown-Experimenten führt die umgekehrte Transfektion (Schritte 5.2.1-5.2.3) zu einer besseren Effizienz sowohl bei shRNAs als auch bei siRNAs. Nach 24 h führen Sie eine zweite Transfektion durch. Bereiten Sie eine Mischung aus pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) und pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0,5) Konstrukten mit PEI (3 μl PEI für 1 μg DNA) in 50 μl unvollständigem Medium durch Vortexen vortexen. Inkubieren Sie die Mischung 20 Minuten lang bei RT. Tauschen Sie das vorhandene Medium durch 250 μl frisches, unvollständiges Medium aus und geben Sie die Mischung in die Zellen.HINWEIS: Ein Reportervektor für die HIV-1-LTR wurde durch Subklonierung von LTR von pU3RIII30,31 in pGL3basic im Labor früher32 entwickelt. Die GFP-Expression mit pEGFP-N1 wurde verwendet, um die Transfektionseffizienz zu normalisieren32. Wechseln Sie das Medium nach 6 h nach der Transfektion mit 500 μl vollständigem DMEM. Ernten Sie die Zellen nach 36 Stunden für Immunblotting und Luciferase-Assay. Für den Luciferase-Assay pelletieren Sie die Zellen und resuspendieren sie in einem kommerziell erhältlichen Luciferase-Substrat (50 μl) (siehe Materialtabelle). Geben Sie das resuspendierte Zelllysat in eine undurchsichtige 96-Well-Platte und inkubieren Sie es 10-15 Minuten lang. Ermitteln Sie den Luziferase-Messwert in einem Luminometer. Messen Sie auch die GFP-Fluoreszenz in denselben Proben, um den Luciferase-Messwert in einem Mikroplatten-Mikromoden-Plattenleser zu normalisieren (z. B. 494 nm, Em: 519 nm). Zeichnen Sie das Diagramm als Luziferase-Einheit/GFP auf der Y-Achse.HINWEIS: Der Knockdown der jeweiligen UPR-Marker sollte überprüft werden, und zwar entweder durch Immunblotting oder qRT-PCR unter Verwendung von genspezifischen Antikörpern bzw. Primern. Sammeln Sie die Überstände, um sie wie oben erwähnt für den p24-ELISA zu verarbeiten. Bildung stabiler Zellen mit Knockdown von UPR-Markern und HIV-1-Infektion.Bereiten Sie die Lentivirus-Partikel vor, indem Sie HEK-293T-Zellen, die in einer 6-Well-Platte ausgesät wurden, mit den entsprechenden shRNA-Konstrukten (1 μg) zusammen mit pMD2.G (VSV-G-Hüllvektor) (0,75 μg) und psPAX2 (Lentivirales Verpackungsplasmid) (0,25 μg) (siehe Materialtabelle) unter Verwendung von PEI im Verhältnis 1 μg DNA: 3 μl PEI transfizieren. Bereiten Sie die Mischung in 100 μl unvollständigem DMEM vor und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei RT. Geben Sie die Mischung zu 1,8 ml vollständigem Medium in den ausgesäten HEK-293T-Zellen.HINWEIS: HEK-293T-Zellen mindestens 12 Stunden vor der Transfektion in einer 6-Well-Platte säen, bis sie Morphologie gewinnen und zu etwa 60-70 % konfluent sind. Nach 24 Stunden Transfektion geben Sie 1 ml vollständiges DMEM in jede Vertiefung. Die Überstände werden nach 48 Stunden gesammelt, bei -80 °C im Gefrierschrank gelagert und p24-ELISA durchgeführt, um das Vorhandensein des Virus in diesen Überständen zu bestätigen. Verwenden Sie diesen rohen lentiviralen Überstand für die Transduktion von J6-Zellen. Inkubieren Sie 2 Millionen Zellen in einer 6-Well-Platte mit einem gleichen Volumen an lentiviralem Überstand (500 μl) für jedes Kontroll- und genspezifische Knockdown-Lentivirus und fügen Sie frisches, vollständiges RPMI 1640-Medium in Gegenwart von Polybren (5 μg/ml) hinzu, um das Volumen auf 2 ml aufzufüllen. Nach 24 Stunden geben Sie Puromycin (1 μg/ml) in jede Vertiefung, um stabile Zellen auszuwählen. Nach der Zugabe von Puromycin pelletieren Sie die Zellen alle 24 Stunden und fügen Sie 2 ml frisches Medium mit Puromycin hinzu. Tun Sie dies, bis kein Zelltod mehr auftritt (~1 Woche). Die überlebenden Zellen sind die stabilen Zellen mit dem gewünschten Gen-Knockdown.HINWEIS: Der Knockdown der jeweiligen Gene kann in regelmäßigen Abständen und schließlich, wenn nur überlebende Zellen in Puromycin-haltigen Medien sichtbar sind, mittels Immunblotting oder qRT-PCR überprüft werden. Infizieren Sie die LacZ- und genspezifischen Knockdown-Zellen mit 0,5 MOI HIV-1, wie in Abschnitt 2 beschrieben, und ernten Sie die Zellen 48 Stunden nach der Infektion. Sammeln Sie den Überstand aus jeder Probe und verarbeiten Sie ihn für p24-ELISA, wie zuvor beschrieben, und bearbeiten Sie die Zellen, um den Knockdown-Pegel durch Immunblotting zu überprüfen. 6. Behandlung mit ER-Stressinduktor und Analyse seiner Wirkung auf die HIV-1-Replikation HINWEIS: Um die Wirkung einer Überstimulation von UPR während der HIV-1-Replikation zu bestimmen, kann das pharmakologische Induktormolekül Thapsigargin verwendet werden. Bestimmung der prozentualen Zellviabilität nach Behandlung mit Thapsigargin.HINWEIS: Die Zytotoxizität von Thapsigargin wird durch das MTT-Reagenz bestimmt (siehe Materialtabelle).25.000-30.000 CEM-GFP-Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit 100 μl vollständigem RPMI 1640 aussäen. Geben Sie 100 nM Thapsigargin in das Medium und inkubieren Sie bei 37 °C in einem Inkubator.HINWEIS: Zellen, die mit 1 μl DMSO behandelt wurden, wurden als Vehikelkontrolle entnommen. Nach 48 h 10 μl MTT (5 mg/ml) in jede Vertiefung geben und 4 h im Dunkeln inkubieren, um Formazankristalle bei 37 °C mit 5 % CO2 zu bilden. Nach 4 h lösen Sie die Kristalle mit 100 μl Isopropanol auf, um eine violette Farbe zu bilden, und messen Sie die Extinktion bei 570 nm mit einem Spektralphotometer. Berechnen Sie die prozentuale Zellviabilität basierend auf der unten angegebenen Gleichung% Zellviabilität = (KontrolleOD570 – BehandlungOD570)/ KontrolleOD570 x 100 Vorbehandlung mit Thapsigargin und Analyse des Fortschreitens der HIV-1-Infektion mittels p24 ELISA.1 Million CEM-GFP-Zellen werden in einer 12-Well-Platte mit 1 ml vollständigem RPMI 1640 gesät und mit 100 nM Thapsigargin oder 1 μl DMSO (Vehikelkontrolle) für 12 Stunden in einem CO2 -Inkubator behandelt, der bei 37 °C gehalten wird. Nach 12 Stunden waschen Sie die Zellen mit vollständigem RPMI 1640 und infizieren Sie mit 0,5 MOI HIV-1, wie zuvor beschrieben. Ernten Sie die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten, z. B. 24 h, 48 h und 72 h nach der Infektion, für das Immunblotting. Entnehmen Sie die Überstände aus jeder Probe und führen Sie den p24-ELISA wie zuvor beschrieben durch. Plotten Sie das Diagramm mit der p24-Konzentration in der Probe als Y-Achse und den entsprechenden Zeitpunkten als X-Achse. Analysieren Sie mit Hilfe des Immunblottings die ER-Stressinduktion aufgrund der Thapsigargin-Behandlung, indem Sie den Spiegel aller UPR-Marker messen. In dieser Studie wurde HSPA5 als Marker verwendet. 7. TZM-bl β-Gal-Infektiositätstest zur Bestimmung der Wirkung von UPR auf die Virioninfektiösität HINWEIS: Um die Rolle von UPR bei der Infektiosität des Virions zu verstehen, kann der Überstand aus dem Knockdown sowie die Behandlung mit Thapsigargin für den TZM-bl β-Gal-Infektiositätstest wie in Abschnitt 1.2 beschrieben verwendet werden, basierend auf der durch p24-ELISA bestimmten p24-Konzentration. Infizieren Sie TZM-bl-Zellen mit einer gleichen Konzentration von p24 aus jeder Probe und führen Sie eine β-Gallen-Färbung durch. Zählen Sie die blauen infizierten Zellen unter dem Mikroskop in 10-facher Vergrößerung für 5 zufällige Felder. Nehmen Sie einen Durchschnitt der Anzahl der 5 Felder für jede Stichprobe aus den obigen Schritten. Berechnen Sie die Falzänderung wie unten erwähnt:Faltenänderung = Durchschnittliche Anzahl blauer Zellen in den Testproben/Durchschnittliche Anzahl blauer Zellen in der Kontrollprobe.

Representative Results

In dieser Arbeit haben wir ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung von in vitro ER-Stress und UPR-Aktivierung nach einer HIV-1-Infektion in T-Zellen beschrieben (Abbildung 2). In dieser Studie werden auch Methoden zur Analyse der funktionellen Relevanz von UPR bei der HIV-1-Replikation und der Virioninfektiösität beschrieben (Abbildung 3). Zu diesem Zweck analysierten wir den durch ein…

Discussion

Der Geltungsbereich des vorliegenden Protokolls umfasst (i) den Umgang mit HIV-1-Virusbeständen und die Messung der Viruskonzentration und der Virioninfektiösität, (ii) die Infektion von T-Zellen mit HIV-1 und die Bewertung ihrer Wirkung auf ER-Stress und verschiedene UPR-Marker, (iii) die Wirkung des Knockdowns von UPR-Markern und ihre Wirkung auf die HIV-1-LTR-gesteuerte Genaktivität, Virusproduktion und Virion-Infektiosität und (iv) Überstimulation der UPR mit pharmakologischen…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, der indischen Regierung, für die interne Unterstützung. AT und AD sind dankbar für die Unterstützung der Doktorandenforschung, die sie vom National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, Government of India, erhalten haben. DM ist dankbar für das JC Bose National Fellowship von SERB, der indischen Regierung.

Materials

Acrylamamide Biorad, USA 1610107
Agarose G-Biosciences, USA RC1013
Ammonium persulphate Sigma-Aldrich, USA A3678
anti-ATF4 antibody Cell Signaling Technology, USA 11815 Western blot detection Dilution-1:1000
anti-ATF6 antibody Abcam, UK ab122897 Western blot detection Dilution-1:1000
anti-CHOP antibody Cell Signaling Technology, USA 2897 Western blot detection Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibody Santa Cruz Biotechnology, USA sc-11386 Western blot detection Dilution-1:2000 
anti-GADD34 antibody Abcam, UK ab236516 Western blot detection Dilution-1:1000
anti-GAPDH antibody Santa Cruz Biotechnology, USA sc-32233 Western blot detection Dilution-1:3000 
anti-HSPA5 antibody Cell Signaling Technology, USA 3177 Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibody Cell Signaling Technology, USA 3294 Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody  Biorad, USA 1706516 Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibody Invitrogen, USA 44-728G Western blot detection Dilution-1:1000
anti-PERK antibody Cell Signaling Technology, USA 5683 Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 antibody Abcam, UK ab243665 Western blot detection Dilution-1:1000
anti-pPERK antibody Invitrogen, USA PA5-40294 Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate antibody Biorad, USA 1706515 Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-XBP1 antibody Abcam, UK ab37152 Western blot detection Dilution-1:1000
Bench top high speed centrifuge Eppendorf, USA 5804R Rotor- F-45-30-11
Bench top low speed centrifuge Eppendorf, USA 5702R Rotor- A-4-38
Bis-Acrylamide Biorad, USA 1610201
Bovine Serum Albumin (BSA) MP biomedicals, USA 160069
Bradford reagent Biorad, USA 5000006
CalPhos mammalian Transfection kit Clontech, Takara Bio, USA 631312 Virus stock preparation
CEM-GFP NIH, AIDS Repository, USA 3655
Clarity ECL substrate Biorad, USA 1705061 chemiluminescence detecting substrate
Clarity max ECL substrate Biorad, USA 1705062 chemiluminescence detecting substrate
Confocal laser scanning microscope Olympus, Japan Model:FV3000
Cytospin centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA ASHA78300003
DMEM Invitrogen, USA 11995073
DMSO Sigma-Aldrich, USA D2650
dNTPs Promega, USA U1515
DTT Invitrogen, USA R0861
EDTA Invitrogen, USA 12635
EtBr Invitrogen, USA `15585011
Fetal Bovine Serum Invitrogen, USA 16000044
G418 Invitrogen, USA 11811023
Glutaraldehyde 25% Sigma-Aldrich, USA G6257 Infectivity assay
Glycine Thermo Fisher Scientific, USA Q24755
HEK-293T NCCS, India
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3 NIH, AIDS Repository, USA 114
Inverted microscope Nikon, Japan Model: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green Supermix Biorad, USA 1715124
Jurkat J6 NCCS, India
Magnesium chloride Sigma-Aldrich, USA M8266 Infectivity assay
MMLV-RT  Invitrogen, USA 28025013
MTT reagent Sigma-Aldrich, USA M5655 Cell viability assay
N,N-dimethyl formamide Fluka Chemika 40255 Infectivity assay
NaCl Thermo Fisher Scientific, USA Q27605
NaF Sigma-Aldrich, USA 201154
NP40 Invitrogen, USA 85124
P24 antigen capture ELISA kit ABL, USA 5421
PageRuler prestained protein ladder Sci-fi Biologicals, India PGPMT078
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich, USA P6148
pEGFP-N1 Clontech, USA 632515
Penicillin/Streptomycin Invitrogen, USA 151140122
Phosphatase Inhibitor Sigma-Aldrich, USA 4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC buffer NEB,USA M05532
pLKO.1-TRC Addgene, USA 10878 Lentiviral cloning vector
pMD2.G Addgene, USA 12259 VSV-G envelope vector
PMSF Sigma-Aldrich, USA P7626
Polyethylenimine (PEI)  Polysciences, Inc., USA 23966
Potassium ferricyanide Sigma-Aldrich, USA 244023 Infectivity assay
Potassium ferrocyanide Sigma-Aldrich, USA P3289 Infectivity assay
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich, USA  5056489001
psPAX2 Addgene, USA 12260 Lentiviral packaging plasmid
Puromycin Sigma-Aldrich, USA P8833 Selection of stable cells
PVDF membrane Biorad, USA 1620177
Random primers Invitrogen, USA 48190011
RPMI 1640 Invitrogen, USA 22400105
SDS Sigma-Aldrich, USA L3771
Steady-Glo substrate Promega, USA E2510 Luciferase assay
T4 DNA ligase Invitrogen, USA 15224017
TEMED Invitrogen, USA 17919
Thapsigargin Sigma-Aldrich, USA T9033
Thioflavin T Sigma-Aldrich, USA 596200
Tris Thermo Fisher Scientific, USA Q15965
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, USA T8787
Trizol Invitrogen, USA 15596018
Tween 20 Sigma-Aldrich, USA P1379
TZM-bl NIH, AIDS Repository, USA 8129
Ultracentrifuge Beckman Optima L90K, USA 330049 Rotor-SW28Ti
UltraPure X-gal Invitrogen, USA 15520-018 Infectivity assay

Referenzen

  1. Levy, J. A. . HIV and the Pathogenesis of AIDS. , (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307 (2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855 (1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374 (2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4 (2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536 (2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156 (2021).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Tripathi, A., Dasgupta, A., Mitra, D. Measuring Endoplasmic Reticulum Stress and Unfolded Protein Response in HIV-1 Infected T-Cells and Analyzing its Role in HIV-1 Replication. J. Vis. Exp. (208), e66522, doi:10.3791/66522 (2024).

View Video