Medindo o estresse do retículo endoplasmático e a resposta da proteína desdobrada em células T infectadas pelo HIV-1 e analisando seu papel na replicação do HIV-1

A síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) é caracterizada por uma redução gradual no número de linfócitos T CD4⁺, o que leva à falha progressiva da resposta imune. O vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1) é o agente causador da AIDS. É um vírus de RNA de fita simples, envelopado, de sentido positivo, com duas cópias de RNA por vírion e pertence à família retroviridae. A produção de altas concentrações de proteínas virais dentro da célula hospedeira coloca estresse excessivo na maquinaria de dobramento de proteínas da célula¹. O RE é o primeiro compartimento na via secretora das células eucarióticas. É responsável por produzir, alterar e entregar proteínas à via secretora e aos locais-alvo do espaço extracelular. As proteínas sofrem inúmeras alterações pós-traducionais e se dobram em sua conformação natural no RE, incluindo glicosilação ligada à asparagina e a criação de ligações dissulfeto intra e intermoleculares². Portanto, altas concentrações de proteínas estão presentes no lúmen do RE e são muito propensas à agregação e dobramento incorreto. Várias condições fisiológicas, como choque térmico, infecções microbianas ou virais, que exigem maior síntese de proteínas ou mutação de proteínas, levam ao estresse do RE devido ao aumento do acúmulo de proteínas no RE, perturbando assim a homeostase do lúmen do RE. O estresse do RE ativa uma rede de vias de transdução de sinal adaptativas altamente conservadas, a Resposta de Proteína Desdobrada (UPR)³. A UPR é empregada para trazer de volta a condição fisiológica normal do RE, alinhando sua carga de proteína desdobrada e capacidade de dobramento. Isso é causado pelo aumento do tamanho do ER e das chaperonas e foldases moleculares residentes no ER, resultando em uma elevação da capacidade de dobramento do ER. A UPR também diminui a carga proteica do RE por meio da atenuação da síntese global de proteínas no nível translacional e aumenta a depuração de proteínas desdobradas do RE pela regulação positiva da degradação associada ao ER (ERAD) ^{4 , 5} .

O estresse do ER é detectado por três proteínas transmembranares residentes no ER: Proteína quinase R (PKR) – semelhante à quinase endoplasmática do retículo (PERK), Fator de transcrição ativador 6 (ATF6) e Inositol – Todos esses efetores são mantidos inativos pela ligação ao membro 5 (HSPA5) da família A da proteína de choque térmico chaperona (Hsp70), também conhecida como proteína de ligação (BiP) / proteína regulada por glicose de 78 kDa (GRP78). Após o estresse do RE e o acúmulo de proteínas desdobradas/mal dobradas, o HSPA5 se dissocia e leva à ativação desses efetores, que então ativam uma série de alvos a jusante que ajudam a resolver o estresse do RE e, em condições extremas, promovem a morte celular⁶. Após a dissociação do HSPA5, o PERK se autofosforila e sua atividade quinase é ativada⁷. Sua atividade quinase fosforila eIF2α, o que leva à atenuação translacional, diminuindo a carga proteica do ER⁸. No entanto, na presença do fator de iniciação fosfo-eucariótico 2α (eIF2α), quadros de leitura abertos não traduzidos em mRNAs específicos tornam-se preferencialmente traduzidos, como ATF4, regulando genes induzidos por estresse. ATF4 e proteína homóloga C/EBP (CHOP) são fatores de transcrição que regulam genes induzidos por estresse e regulam as vias de apoptose e morte celular ^9,10. Um dos alvos do ATF4 e do CHOP é a proteína induzível por danos ao DNA (GADD34), que, juntamente com a proteína fosfatase 1, desfosforila peIF2α atua como um regulador de feedback para atenuação translacional¹¹. Sob estresse ER, o ATF6 se dissocia do HSPA5 e seu sinal de localização de Golgi é exposto, levando à sua translocação para o aparelho de Golgi. No aparelho de Golgi, o ATF6 é clivado pela protease do sítio 1 (S1P) e pela protease do sítio 2 (S2P) para liberar a forma clivada do ATF6 (ATF6 P50). O ATF6 p50 é então translocado para o núcleo, onde induz a expressão de genes envolvidos no dobramento, maturação e secreção de proteínas, bem como na degradação de proteínas^12,13. Durante o estresse do RE, o IRE1 se dissocia do HSPA5, multimeriza e autofosforila¹⁴. A fosforilação de IRE1 ativa seu domínio RNase, mediando especificamente o splicing de 26 nucleotídeos da parte central do mRNA da proteína de ligação X-box 1 (XBP1) ^{15 , 16} . Isso gera um novo terminal C que confere função de transativação, gerando a proteína XBP1s funcional, um potente fator de transcrição que controla vários genes induzidos por estresse do ER^17,18. A atividade combinada desses fatores de transcrição ativa programas genéticos destinados a restaurar a homeostase do RE.

Existem vários métodos para detectar estresse de ER e UPR. Estes incluem os métodos convencionais de análise dos marcadores UPR ^19,20. Vários métodos não convencionais incluem a medição do estado redox da UPR e da distribuição de cálcio no lúmen do RE, bem como a avaliação da estrutura do RE. A microscopia eletrônica pode ser usada para ver o quanto o lúmen do RE aumenta em resposta ao estresse do RE nas células e tecidos. No entanto, esse método é demorado e depende da disponibilidade de um microscópio eletrônico, que pode não estar disponível para todos os grupos de pesquisa. Além disso, medir o fluxo de cálcio e o estado redox do RE é um desafio devido à disponibilidade de reagentes. Além disso, a leitura desses experimentos é muito sensível e pode ser afetada por outros fatores do metabolismo celular.

Uma técnica poderosa e simples para monitorar as saídas da UPR é medir a ativação das diferentes vias de sinalização da UPR e tem sido usada há décadas em vários cenários de estresse. Esses métodos convencionais para medir a ativação da UPR são econômicos, viáveis e fornecem as informações em menos tempo em comparação com outros métodos conhecidos. Isso inclui immunoblotting para medir a expressão de marcadores UPR no nível da proteína, como fosforilação de IRE1, PERK e eIF2α e clivagem de ATF6 medindo a forma P50 de ATF6 e expressão proteica de outros marcadores, como HSPA5, XBP1 emendado, ATF4, CHOP e GADD34, bem como RT-PCR para determinar os níveis de mRNA, bem como splicing de mRNA de XBP1.

Este artigo descreve um conjunto validado e confiável de protocolos para monitorar o estresse do ER e a ativação da UPR em células infectadas pelo HIV-1 e para determinar a relevância funcional da UPR na replicação e infectividade do HIV-1. Os protocolos utilizam reagentes facilmente disponíveis e econômicos e fornecem informações convincentes sobre os resultados da UPR. O estresse do RE é o resultado do acúmulo de proteínas desdobradas/mal dobradas, que são propensas a formar agregados proteicos²¹. Descrevemos um método para detectar esses agregados proteicos em células infectadas pelo HIV-1. A coloração com tioflavina T é um método relativamente novo usado para detectar e quantificar esses agregados proteicos²². Beriault e Werstuck descreveram essa técnica para detectar e quantificar agregados de proteínas e, portanto, níveis de estresse de ER em células vivas. Foi demonstrado que a pequena molécula fluorescente tioflavina T (ThT) se liga seletivamente a agregados de proteínas, especialmente fibrilas amilóides.

Neste artigo, descrevemos o uso de ThT para detectar e quantificar o estresse do ER em células infectadas pelo HIV-1 e correlacioná-lo com o método convencional de monitoramento da UPR, medindo a ativação de diferentes vias de sinalização da UPR.

Uma vez que também há uma falta de informações abrangentes sobre o papel da UPR durante a infecção pelo HIV-1, fornecemos um conjunto de protocolos para entender o papel da UPR na replicação do HIV-1 e na infectividade do vírion. Esses protocolos incluem o knockdown mediado por lentivírus de marcadores UPR, bem como o tratamento com indutores farmacológicos de estresse de RE. Este artigo também mostra os tipos de leitura que podem ser usados para medir a expressão do gene HIV-1, a produção viral, bem como a infectividade dos vírions produzidos, como ensaio de luciferase baseado em repetição terminal longa (LTR), ensaio de imunoabsorção enzimática p24 (ELISA) e ensaio de coloração repórter de β-gal, respectivamente.

Usando a maioria desses protocolos, relatamos recentemente a implicação funcional da infecção pelo HIV-1 na UPR em células T²³, e os resultados desse artigo sugerem a confiabilidade dos métodos aqui descritos. Assim, este artigo fornece um conjunto de métodos para informações abrangentes sobre a interação do HIV-1 com o estresse do RE e a ativação da UPR.