Messung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums und der entfalteten Proteinantwort in HIV-1-infizierten T-Zellen und Analyse seiner Rolle bei der HIV-1-Replikation
Summary
In diesem Artikel beschreiben wir einige etablierte Methoden zur Bestimmung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der Aktivierung der ungefalteten Proteinantwort (UPR), mit besonderem Schwerpunkt auf HIV-1-Infektionen. In diesem Artikel wird auch eine Reihe von Protokollen beschrieben, um die Auswirkungen von ER-Stress/UPR auf die HIV-1-Replikation und die Infektiosität der Virionen zu untersuchen.
Abstract
Virusinfektionen können aufgrund einer abnormalen Proteinakkumulation Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER) verursachen, was zu einer ungefalteten Proteinantwort (UPR) führt. Viren haben Strategien entwickelt, um die UPR des Wirts zu manipulieren, aber es fehlt in der Literatur an einem detaillierten Verständnis der UPR-Modulation und ihrer funktionellen Bedeutung während einer HIV-1-Infektion. In diesem Zusammenhang beschreibt der vorliegende Artikel die in unserem Labor verwendeten Protokolle zur Messung des ER-Stressniveaus und der UPR während einer HIV-1-Infektion in T-Zellen sowie die Wirkung der UPR auf die Virusreplikation und Infektiosität.
Die Thioflavin-T-Färbung (ThT) ist eine relativ neue Methode, die zum Nachweis von ER-Stress in den Zellen durch den Nachweis von Proteinaggregaten verwendet wird. Hier haben wir das Protokoll für die ThT-Färbung in HIV-1-infizierten Zellen zum Nachweis und zur Quantifizierung von ER-Stress veranschaulicht. Darüber hinaus wurde ER-Stress auch indirekt nachgewiesen, indem die Spiegel von UPR-Markern wie BiP, phosphoryliertem IRE1, PERK und eIF2α, das Spleißen von XBP1, die Spaltung von ATF6, ATF4, CHOP und GADD34 in HIV-1-infizierten Zellen unter Verwendung von konventionellem Immunblotting und quantitativer reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gemessen wurden. Wir haben festgestellt, dass die ThT-Fluoreszenz mit den Indikatoren der UPR-Aktivierung korreliert. In diesem Artikel werden auch die Protokolle zur Analyse des Einflusses von ER-Stress und UPR-Modulation auf die HIV-1-Replikation durch Knockdown-Experimente sowie die Verwendung pharmakologischer Moleküle vorgestellt. Die Wirkung von UPR auf die HIV-1-Genexpression/-replikation und die Virusproduktion wurde mittels Luciferase-Reporterassays bzw. p24-Antigen-Capture-ELISA analysiert, während die Wirkung auf die Infektiosität der Virionen durch Färbung infizierter Reporterzellen analysiert wurde. Insgesamt bietet dieser Methodensatz ein umfassendes Verständnis der entfalteten Proteinantwortwege während einer HIV-1-Infektion und enthüllt seine komplizierte Dynamik.
Introduction
Das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) ist gekennzeichnet durch eine allmähliche Verringerung der Anzahl der CD4+ T-Lymphozyten, was zu einem fortschreitenden Versagen der Immunantwort führt. Das humane Immundefizienz-Virus-1 (HIV-1) ist der Erreger von AIDS. Es handelt sich um ein umhülltes, einzelsträngiges RNA-Virus mit positivem Sinn und zwei RNA-Kopien pro Virion und gehört zur Familie der Retroviridae. Die Produktion hoher Konzentrationen viraler Proteine in der Wirtszelle belastet die Proteinfaltungsmaschinerie der Zelleübermäßig 1. ER ist das erste Kompartiment im sekretorischen Weg eukaryotischer Zellen. Es ist verantwortlich für die Produktion, Veränderung und Abgabe von Proteinen an den sekretorischen Weg und die Zielstellen im extrazellulären Raum. Proteine durchlaufen zahlreiche posttranslationale Veränderungen und falten sich im ER in ihre natürliche Konformation, einschließlich der Asparagin-gebundenen Glykosylierung und der Bildung intra- und intermolekularer Disulfidbindungen2. Daher sind hohe Konzentrationen von Proteinen im ER-Lumen vorhanden, die sehr anfällig für Aggregation und Fehlfaltung sind. Verschiedene physiologische Zustände wie Hitzeschock, mikrobielle oder virale Infektionen, die eine verstärkte Proteinsynthese oder Proteinmutation erfordern, führen aufgrund einer erhöhten Proteinakkumulation im ER zu ER-Stress, wodurch die ER-Lumen-Homöostase gestört wird. Der ER-Stress aktiviert ein Netzwerk von hochkonservierten adaptiven Signaltransduktionswegen, die Unfolded Protein Response (UPR)3. UPR wird eingesetzt, um den normalen physiologischen Zustand des ER wiederherzustellen, indem seine entfaltete Proteinlast und Faltungskapazität aufeinander abgestimmt werden. Dies wird durch die Erhöhung der ER-Größe und der ER-residenten molekularen Chaperone und Foldasen erreicht, was zu einer Erhöhung der Faltungsfähigkeit des ER führt. UPR verringert auch die Proteinlast des ER durch globale Proteinsynthese-Dämpfung auf translationaler Ebene und erhöht die Clearance von ungefalteten Proteinen aus dem ER durch Hochregulierung des ER-assoziierten Abbaus (ERAD)4,5.
ER-Stress wird von drei ER-residenten Transmembranproteinen wahrgenommen: Proteinkinase R (PKR)-ähnliche endoplasmatische Retikulumkinase (PERK), aktivierender Transkriptionsfaktor 6 (ATF6) und Inositol-erforderndes Enzym Typ 1 (IRE1). Alle diese Effektoren werden inaktiv gehalten, indem sie an das Chaperon Heat shock protein family A (Hsp70) member 5 (HSPA5) binden, das auch als Bindungsprotein (BiP)/78-kDa-glukosereguliertes Protein (GRP78) bekannt ist. Bei ER-Stress und Akkumulation von ungefalteten/fehlgefalteten Proteinen dissoziiert HSPA5 und führt zur Aktivierung dieser Effektoren, die dann eine Reihe von nachgeschalteten Zielen aktivieren, die bei der Auflösung des ER-Stresses helfen und unter extremen Bedingungen den Zelltod fördern6. Nach der Dissoziation von HSPA5 autophosphoryliert PERK, und seine Kinaseaktivität wird aktiviert7. Seine Kinaseaktivität phosphoryliert eIF2α, was zu einer translationalen Abschwächung führt und die Proteinlast des ER8 senkt. In Gegenwart des phospho-eukaryotischen Initiationsfaktors 2α (eIF2α) werden jedoch nicht-translatierte offene Leserahmen auf spezifischen mRNAs, wie z. B. ATF4, bevorzugt translatiert und regulieren stressinduzierte Gene. ATF4 und C/EBP homologes Protein (CHOP) sind Transkriptionsfaktoren, die stressinduzierte Gene regulieren und die Apoptose und den Zelltod regulieren 9,10. Eines der Ziele von ATF4 und CHOP ist das Wachstumsarrest und DNA-Schadens-induzierbare Protein (GADD34), das zusammen mit der Proteinphosphatase 1 peIF2α dephosphoryliert und als Rückkopplungsregulator für die translationale Dämpfung fungiert11. Unter ER-Stress dissoziiert ATF6 von HSPA5 und sein Golgi-Lokalisierungssignal wird exponiert, was zu seiner Translokation in den Golgi-Apparat führt. Im Golgi-Apparat wird ATF6 durch die Protease an Stelle 1 (S1P) und an der Protease an Stelle 2 (S2P) gespalten, um die gespaltene Form von ATF6 (ATF6 P50) freizusetzen. ATF6 p50 wird dann in den Zellkern transloziert, wo es die Expression von Genen induziert, die an der Proteinfaltung, -reifung und -sekretion sowie am Proteinabbau beteiligt sind12,13. Während ER-Stress dissoziiert IRE1 von HSPA5, multimerisiert und autophosphoryliert14. Die Phosphorylierung von IRE1 aktiviert seine RNase-Domäne und vermittelt spezifisch das Spleißen von 26 Nukleotiden aus dem zentralen Teil der mRNA des X-Box-Bindungsproteins 1 (XBP1)15,16. Dies erzeugt einen neuartigen C-Terminus, der eine Transaktivierungsfunktion verleiht, und erzeugt ein funktionelles XBP1s-Protein, einen potenten Transkriptionsfaktor, der mehrere ER-Stress-induzierte Gene steuert17,18. Die kombinierte Aktivität dieser Transkriptionsfaktoren schaltet genetische Programme ein, die darauf abzielen, die ER-Homöostase wiederherzustellen.
Es gibt verschiedene Methoden, um ER-Stress und UPR zu erkennen. Dazu gehören die herkömmlichen Methoden zur Analyse der UPR-Marker 19,20. Zu den verschiedenen unkonventionellen Methoden gehören die Messung des Redoxzustands des UPR und der Calciumverteilung im ER-Lumen sowie die Beurteilung der ER-Struktur. Die Elektronenmikroskopie kann verwendet werden, um zu sehen, wie stark sich das ER-Lumen als Reaktion auf ER-Stress in Zellen und Geweben vergrößert. Diese Methode ist jedoch zeitaufwändig und hängt von der Verfügbarkeit eines Elektronenmikroskops ab, das möglicherweise nicht jeder Forschungsgruppe zur Verfügung steht. Auch die Messung des Calciumflusses und des Redoxzustands des ER ist aufgrund der Verfügbarkeit von Reagenzien eine Herausforderung. Darüber hinaus sind die Ergebnisse dieser Experimente sehr empfindlich und könnten von anderen Faktoren des Zellstoffwechsels beeinflusst werden.
Eine leistungsfähige und einfache Technik zur Überwachung der UPR-Ausgänge ist die Messung der Aktivierung der verschiedenen Signalwege der UPR und wird seit Jahrzehnten in verschiedenen Stressszenarien eingesetzt. Diese herkömmlichen Methoden zur Messung der UPR-Aktivierung sind wirtschaftlich, praktikabel und liefern die Informationen in kürzerer Zeit als andere bekannte Methoden. Dazu gehören Immunblotting zur Messung der Expression von UPR-Markern auf Proteinebene, wie z. B. die Phosphorylierung von IRE1, PERK und eIF2α und die Spaltung von ATF6 durch Messung der P50-Form von ATF6 und die Proteinexpression anderer Marker wie HSPA5, gespleißtes XBP1, ATF4, CHOP und GADD34 sowie RT-PCR zur Bestimmung der mRNA-Spiegel sowie das Spleißen von XBP1-mRNA.
Dieser Artikel beschreibt eine validierte und zuverlässige Reihe von Protokollen zur Überwachung von ER-Stress und UPR-Aktivierung in HIV-1-infizierten Zellen und zur Bestimmung der funktionellen Relevanz von UPR für die HIV-1-Replikation und Infektiosität. Die Protokolle verwenden sowohl leicht verfügbare als auch kostengünstige Reagenzien und liefern überzeugende Informationen über die UPR-Ausgänge. ER-Stress ist das Ergebnis der Akkumulation von ungefalteten/fehlgefalteten Proteinen, die zur Bildung von Proteinaggregaten neigen21. Hiermit beschreiben wir eine Methode, um diese Proteinaggregate in HIV-1-infizierten Zellen nachzuweisen. Die Thioflavin-T-Färbung ist eine relativ neue Methode, die zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser Proteinaggregate verwendet wird22. Beriault und Werstuck beschrieben diese Technik zum Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinaggregaten und damit von ER-Stress in lebenden Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass das kleine fluoreszierende Molekül Thioflavin T (ThT) selektiv an Proteinaggregate, insbesondere Amyloidfibrillen, bindet.
In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von ThT zum Nachweis und zur Quantifizierung von ER-Stress in HIV-1-infizierten Zellen und korrelieren sie mit der herkömmlichen Methode zur Überwachung der UPR, indem wir die Aktivierung verschiedener Signalwege der UPR messen.
Da es auch an umfassenden Informationen über die Rolle der UPR während der HIV-1-Infektion mangelt, stellen wir eine Reihe von Protokollen zur Verfügung, um die Rolle der UPR bei der HIV-1-Replikation und der Virioninfektiösität zu verstehen. Diese Protokolle umfassen sowohl den Lentivirus-vermittelten Knockdown von UPR-Markern als auch die Behandlung mit pharmakologischen ER-Stressinduktoren. Dieser Artikel zeigt auch die Arten von Auslesungen, die zur Messung der HIV-1-Genexpression, der Virusproduktion sowie der Infektiosität der produzierten Virionen verwendet werden können, wie z. B. der Long Terminal Repeat (LTR)-basierte Luciferase-Assay, der p24-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bzw. der β-Gal-Reporterfärbe-Assay.
Unter Verwendung der meisten dieser Protokolle haben wir kürzlich über die funktionelle Bedeutung einer HIV-1-Infektion auf die UPR in T-Zellenberichtet 23, und die Ergebnisse dieses Artikels deuten auf die Zuverlässigkeit der hier beschriebenen Methoden hin. Daher stellt dieser Artikel eine Reihe von Methoden zur Verfügung, um umfassende Informationen über das Zusammenspiel von HIV-1 mit ER-Stress und UPR-Aktivierung zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Geltungsbereich des vorliegenden Protokolls umfasst (i) den Umgang mit HIV-1-Virusbeständen und die Messung der Viruskonzentration und der Virioninfektiösität, (ii) die Infektion von T-Zellen mit HIV-1 und die Bewertung ihrer Wirkung auf ER-Stress und verschiedene UPR-Marker, (iii) die Wirkung des Knockdowns von UPR-Markern und ihre Wirkung auf die HIV-1-LTR-gesteuerte Genaktivität, Virusproduktion und Virion-Infektiosität und (iv) Überstimulation der UPR mit pharmakologischen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, der indischen Regierung, für die interne Unterstützung. AT und AD sind dankbar für die Unterstützung der Doktorandenforschung, die sie vom National Centre for Cell Science, Department of Biotechnology, Government of India, erhalten haben. DM ist dankbar für das JC Bose National Fellowship von SERB, der indischen Regierung.
Materials
| Acrylamamide | Biorad, USA | 1610107 | |
| Agarose | G-Biosciences, USA | RC1013 | |
| Ammonium persulphate | Sigma-Aldrich, USA | A3678 | |
| anti-ATF4 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 11815 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-ATF6 antibody | Abcam, UK | ab122897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-CHOP antibody | Cell Signaling Technology, USA | 2897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-eIF2α antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-11386 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| anti-GADD34 antibody | Abcam, UK | ab236516 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-32233 | Western blot detection Dilution-1:3000 |
| anti-HSPA5 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3177 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-IRE1 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| Anti-mouse HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706516 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
| anti-peIF2α antibody | Invitrogen, USA | 44-728G | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-PERK antibody | Cell Signaling Technology, USA | 5683 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| anti-pIRE1 antibody | Abcam, UK | ab243665 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-pPERK antibody | Invitrogen, USA | PA5-40294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| Anti-rabbit HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706515 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
| anti-XBP1 antibody | Abcam, UK | ab37152 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| Bench top high speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5804R | Rotor- F-45-30-11 |
| Bench top low speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5702R | Rotor- A-4-38 |
| Bis-Acrylamide | Biorad, USA | 1610201 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP biomedicals, USA | 160069 | |
| Bradford reagent | Biorad, USA | 5000006 | |
| CalPhos mammalian Transfection kit | Clontech, Takara Bio, USA | 631312 | Virus stock preparation |
| CEM-GFP | NIH, AIDS Repository, USA | 3655 | |
| Clarity ECL substrate | Biorad, USA | 1705061 | chemiluminescence detecting substrate |
| Clarity max ECL substrate | Biorad, USA | 1705062 | chemiluminescence detecting substrate |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus, Japan | Model:FV3000 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | ASHA78300003 | |
| DMEM | Invitrogen, USA | 11995073 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D2650 | |
| dNTPs | Promega, USA | U1515 | |
| DTT | Invitrogen, USA | R0861 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | 12635 | |
| EtBr | Invitrogen, USA | `15585011 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, USA | 16000044 | |
| G418 | Invitrogen, USA | 11811023 | |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich, USA | G6257 | Infectivity assay |
| Glycine | Thermo Fisher Scientific, USA | Q24755 | |
| HEK-293T | NCCS, India | ||
| HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3 | NIH, AIDS Repository, USA | 114 | |
| Inverted microscope | Nikon, Japan | Model: Eclipse Ti2 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad, USA | 1715124 | |
| Jurkat J6 | NCCS, India | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, USA | M8266 | Infectivity assay |
| MMLV-RT | Invitrogen, USA | 28025013 | |
| MTT reagent | Sigma-Aldrich, USA | M5655 | Cell viability assay |
| N,N-dimethyl formamide | Fluka Chemika | 40255 | Infectivity assay |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific, USA | Q27605 | |
| NaF | Sigma-Aldrich, USA | 201154 | |
| NP40 | Invitrogen, USA | 85124 | |
| P24 antigen capture ELISA kit | ABL, USA | 5421 | |
| PageRuler prestained protein ladder | Sci-fi Biologicals, India | PGPMT078 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, USA | P6148 | |
| pEGFP-N1 | Clontech, USA | 632515 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen, USA | 151140122 | |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 4906837001 | |
| Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC buffer | NEB,USA | M05532 | |
| pLKO.1-TRC | Addgene, USA | 10878 | Lentiviral cloning vector |
| pMD2.G | Addgene, USA | 12259 | VSV-G envelope vector |
| PMSF | Sigma-Aldrich, USA | P7626 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc., USA | 23966 | |
| Potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich, USA | 244023 | Infectivity assay |
| Potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich, USA | P3289 | Infectivity assay |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 5056489001 | |
| psPAX2 | Addgene, USA | 12260 | Lentiviral packaging plasmid |
| Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P8833 | Selection of stable cells |
| PVDF membrane | Biorad, USA | 1620177 | |
| Random primers | Invitrogen, USA | 48190011 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen, USA | 22400105 | |
| SDS | Sigma-Aldrich, USA | L3771 | |
| Steady-Glo substrate | Promega, USA | E2510 | Luciferase assay |
| T4 DNA ligase | Invitrogen, USA | 15224017 | |
| TEMED | Invitrogen, USA | 17919 | |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich, USA | T9033 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich, USA | 596200 | |
| Tris | Thermo Fisher Scientific, USA | Q15965 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | |
| Trizol | Invitrogen, USA | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, USA | P1379 | |
| TZM-bl | NIH, AIDS Repository, USA | 8129 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Optima L90K, USA | 330049 | Rotor-SW28Ti |
| UltraPure X-gal | Invitrogen, USA | 15520-018 | Infectivity assay |
References
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