מדידת לחץ רשתית אנדופלסמית ותגובת חלבון פתוחה בתאי T נגועים ב- HIV-1 וניתוח תפקידה בשכפול HIV-1
Summary
כאן, אנו מתארים כמה שיטות מבוססות לקביעת מתח רשתית אנדופלסמית (ER) והפעלת תגובת חלבון פרושה (UPR), עם דגש מיוחד על זיהום HIV-1. מאמר זה מתאר גם סדרה של פרוטוקולים כדי לחקור את ההשפעה של מתח ER / UPR על שכפול HIV-1 והדבקה virion.
Abstract
זיהומים נגיפיים עלולים לגרום ללחץ של רטיקולום אנדופלסמי (ER) עקב הצטברות חלבון חריגה, מה שמוביל לתגובת חלבון מקופלת (UPR). וירוסים פיתחו אסטרטגיות כדי לתפעל את UPR המארח, אבל יש חוסר הבנה מפורטת של אפנון UPR ואת המשמעות התפקודית שלה במהלך זיהום HIV-1 בספרות. בהקשר זה, המאמר הנוכחי מתאר את הפרוטוקולים המשמשים במעבדה שלנו למדידת רמות לחץ בחדר מיון ו- UPR במהלך זיהום HIV-1 בתאי T ואת ההשפעה של UPR על שכפול ויראלי והדבקה.
צביעת תיאופלבין T (ThT) היא שיטה חדשה יחסית המשמשת לזיהוי עקה בחדר מיון בתאים על ידי איתור צברי חלבונים. כאן, הדגמנו את הפרוטוקול לצביעת ThT בתאים נגועים ב- HIV-1 כדי לזהות ולכמת לחץ במיון. יתר על כן, מתח ER זוהה גם בעקיפין על ידי מדידת רמות של סמני UPR כגון BiP, IRE1 זרחני, PERK ו- eIF2α, שחבור של XBP1, מחשוף של ATF6, ATF4, CHOP ו- GADD34 בתאים נגועים ב- HIV-1, באמצעות אימונובלוטינג קונבנציונלי ותגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (RT-PCR). מצאנו כי ThT-fluorescence מתואם עם האינדיקטורים של הפעלת UPR. מאמר זה גם מדגים את הפרוטוקולים לניתוח ההשפעה של לחץ ER ומודולציית UPR על שכפול HIV-1 על ידי ניסויי הפלה, כמו גם שימוש במולקולות פרמקולוגיות. ההשפעה של UPR על ביטוי / שכפול גנים של HIV-1 וייצור וירוסים נותחה על ידי מבחני כתב Luciferase ו- p24 antigen capture ELISA, בהתאמה, ואילו ההשפעה על זיהום ויריונים נותחה על ידי צביעה של תאי דיווח נגועים. באופן קולקטיבי, קבוצה זו של שיטות מספקת הבנה מקיפה של מסלולי תגובת החלבונים שנפרשו במהלך זיהום HIV-1, וחושפת את הדינמיקה המורכבת שלה.
Introduction
תסמונת הכשל החיסוני הנרכש (איידס) מאופיינת בירידה הדרגתית במספר לימפוציטים מסוג CD4+ T, מה שמוביל לכישלון מתקדם של התגובה החיסונית. וירוס הכשל החיסוני האנושי -1 (HIV-1) הוא הגורם הסיבתי לאיידס. זהו וירוס RNA חד-גדילי עטוף וחיובי עם שני עותקים של RNA לכל ויריון, והוא שייך למשפחת הרטרו-ויריים. ייצור ריכוזים גבוהים של חלבונים נגיפיים בתוך התא המארח יוצר לחץ מוגזם על מנגנון קיפול החלבונים של התא1. ER הוא התא הראשון במסלול ההפרשה של תאים אאוקריוטים. הוא אחראי על ייצור, שינוי והעברת חלבונים למסלול ההפרשה ולאתרי המטרה בחלל החוץ-תאי. חלבונים עוברים שינויים רבים לאחר התרגום ומתקפלים לקונפורמציה הטבעית שלהם בחדר המיון, כולל גליקוזילציה הקשורה לאספרגין ויצירת קשרים דיסולפידים תוך-מולקולריים ובין-מולקולריים2. לכן, ריכוזים גבוהים של חלבונים נמצאים בלומן ER ואלה נוטים מאוד לצבירה וקיפול שגוי. מצבים פיזיולוגיים שונים, כגון הלם חום, זיהומים מיקרוביאליים או נגיפיים, הדורשים סינתזת חלבון משופרת או מוטציה חלבונית, מובילים ללחץ בחדר המיון עקב הצטברות חלבון מוגברת בחדר המיון, ובכך מפריעים להומאוסטזיס לומן במיון. הלחץ בחדר המיון מפעיל רשת של מסלולי העברת אותות אדפטיביים שמורים ביותר, תגובת החלבון המקופלת (UPR)3. UPR משמש כדי להחזיר את המצב הפיזיולוגי הרגיל של ER על ידי יישור נטל החלבון הפתוח ויכולת הקיפול שלו. הדבר בא לידי ביטוי בהגדלת גודל חדר המיון והמלווים המולקולריים והקיפולים המתקפלים של חדר המיון, וכתוצאה מכך ניתן להעלות את יכולת הקיפול של חדר המיון. UPR גם מפחית את עומס החלבונים של חדר המיון באמצעות הנחתת סינתזת חלבונים גלובלית ברמת התרגום ומגביר את פינוי החלבונים המקופלים מהמיון על ידי ויסות פירוק הקשור ל- ER (ERAD)4,5.
לחץ ER מורגש על ידי שלושה חלבונים טרנסממברניים תושבי ER: חלבון קינאז R (PKR) דמוי רטיקולום קינאז (PERK), גורם שעתוק מפעיל 6 (ATF6), ואנזים דורש אינוסיטול מסוג 1 (IRE1). כל המשפיעים הללו נשמרים לא פעילים על ידי קשירה למלווה משפחת חלבוני הלם חום A (Hsp70) חבר 5 (HSPA5), הידוע גם בשם חלבון קושר (BiP)/78-kDa חלבון מווסת גלוקוז (GRP78). עם עקה בחדר מיון והצטברות של חלבונים מקופלים / לא מקופלים, HSPA5 מתנתק ומוביל להפעלה של גורמים אלה, אשר לאחר מכן מפעילים סדרה של מטרות במורד הזרם המסייעות בפתרון הלחץ בחדר המיון, ובתנאים קיצוניים, מקדמות מוות תאי6. עם דיסוציאציה מ- HSPA5, PERK autophosphorylates, ופעילות הקינאז שלו מופעלת7. פעילות הקינאז שלו פוספורילטים eIF2α, מה שמוביל להנחתה תרגומית, ומוריד את עומס החלבון של ER8. עם זאת, בנוכחות גורם אתחול פוספו-אאוקריוטי 2α (eIF2α), מסגרות קריאה פתוחות שאינן מתורגמות על mRNA ספציפי הופכות לעדיפות מתורגמות, כגון ATF4, המווסתות גנים הנגרמים על ידי לחץ. ATF4 וחלבון הומולוגי C/EBP (CHOP) הם גורמי שעתוק המווסתים גנים הנגרמים על ידי לחץ ומווסתים אפופטוזיס ומסלולי מוות תאי 9,10. אחת המטרות של ATF4 ו- CHOP היא עצירת גדילה וחלבון המושרה נזק ל- DNA (GADD34), אשר, יחד עם חלבון phosphatase 1 dephosphorylate peIF2α ופועל כמווסת משוב עבור הנחתה תרגומית11. תחת לחץ ER, ATF6 מתנתק מ-HSPA5, ואות הלוקליזציה של גולג’י שלו נחשף, מה שמוביל לטרנסלוקציה שלו למנגנון גולג’י. במנגנון גולג’י, ATF6 נבקע על ידי פרוטאז Site-1 (S1P) ופרוטאז Site-2 (S2P) כדי לשחרר את הצורה החתוכה של ATF6 (ATF6 P50). ATF6 p50 מועבר לאחר מכן לגרעין, שם הוא גורם לביטוי של גנים המעורבים בקיפול, הבשלה והפרשה של חלבונים, כמו גם פירוק חלבונים12,13. במהלך לחץ ER, IRE1 מתנתק מ- HSPA5, מכפיל ופוספורילטים אוטומטיים14. זרחן של IRE1 מפעיל את תחום ה-RNase שלו, ובמיוחד מתווך את השחבור של 26 נוקלאוטידים מהחלק המרכזי של ה-mRNA של חלבון קושר X-box 1 (XBP1)15,16. זה יוצר C-terminus חדשני המעניק פונקציית טרנסאקטיבציה, יצירת חלבון XBP1s פונקציונלי, גורם שעתוק רב עוצמה השולט במספר גנים הנגרמים על ידי לחץ ER17,18. הפעילות המשולבת של גורמי שעתוק אלה מפעילה תוכניות גנטיות שמטרתן לשחזר הומאוסטזיס במיון.
ישנן שיטות שונות לזיהוי מתח ER ו- UPR. אלה כוללים את השיטות המקובלות לניתוח סמני UPR19,20. שיטות לא קונבנציונליות שונות כוללות מדידת מצב חמצון-חיזור של UPR ופיזור סידן בלומן ER, כמו גם הערכת מבנה המיון. ניתן להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לראות עד כמה לומן המיון גדל בתגובה ללחץ ER בתאים וברקמות. עם זאת, שיטה זו גוזלת זמן רב ותלויה בזמינותו של מיקרוסקופ אלקטרונים, אשר עשוי שלא להיות זמין לכל קבוצת מחקר. כמו כן, מדידת שטף הסידן ומצב החיזור של חדר המיון מאתגרת בשל זמינותם של ריאגנטים. יתר על כן, הקריאה מניסויים אלה רגישה מאוד ועשויה להיות מושפעת מגורמים אחרים של חילוף החומרים התאי.
טכניקה רבת עוצמה ופשוטה לניטור יציאות ה- UPR היא למדוד את ההפעלה של מסלולי האיתות השונים של ה- UPR ושימשה במשך עשרות שנים בתרחישי לחץ שונים. שיטות קונבנציונליות אלה למדידת הפעלת UPR הן חסכוניות, ישימות ומספקות את המידע בפחות זמן בהשוואה לשיטות ידועות אחרות. אלה כוללים immunoblotting כדי למדוד את הביטוי של סמני UPR ברמת החלבון, כגון זרחן של IRE1, PERK, ו eIF2α ו מחשוף של ATF6 על ידי מדידת צורת P50 של ATF6 וביטוי חלבון של סמנים אחרים כגון HSPA5, שחבור XBP1, ATF4, CHOP ו GADD34, כמו גם RT-PCR כדי לקבוע את רמות mRNA, כמו גם שחבור של XBP1 mRNA.
מאמר זה מתאר קבוצה מאומתת ואמינה של פרוטוקולים לניטור לחץ בחדר מיון והפעלת UPR בתאים נגועים ב- HIV-1 ולקביעת הרלוונטיות התפקודית של UPR בשכפול HIV-1 והדבקה. הפרוטוקולים משתמשים בריאגנטים זמינים וחסכוניים ומספקים מידע משכנע על תפוקות UPR. לחץ ER הוא תוצאה של הצטברות של חלבונים מקופלים / לא מקופלים, אשר נוטים ליצור צברי חלבונים21. אנו מתארים בזאת שיטה לאיתור צברי חלבונים אלה בתאים נגועים ב- HIV-1. צביעת תיאופלבין T היא שיטה חדשה יחסית המשמשת לזיהוי וכימות צברי חלבונים אלה22. Beriault ו Werstuck תיארו טכניקה זו כדי לזהות ולכמת אגרגטים חלבונים, ומכאן רמות העקה ER בתאים חיים. הוכח כי המולקולה הפלואורסצנטית הקטנה תיופלבין T (ThT) נקשרת באופן סלקטיבי לצברי חלבונים, במיוחד סיבי עמילואיד.
במאמר זה, אנו מתארים את השימוש ב- ThT כדי לזהות ולכמת לחץ ER בתאים נגועים ב- HIV-1 ומתאמים אותו לשיטה הקונבנציונלית של ניטור UPR על ידי מדידת ההפעלה של מסלולי איתות שונים של UPR.
מכיוון שחסר גם מידע מקיף לגבי תפקידו של UPR במהלך הידבקות ב- HIV-1, אנו מספקים סדרה של פרוטוקולים להבנת תפקידו של UPR בשכפול HIV-1 ובהדבקה בנגיף. פרוטוקולים אלה כוללים את ההפלה בתיווך lentivirus של סמני UPR, כמו גם טיפול עם גורמי לחץ פרמקולוגיים במיון. מאמר זה מציג גם את סוגי הקריאה שניתן להשתמש בהם כדי למדוד את ביטוי הגן HIV-1, ייצור ויראלי, כמו גם את ההדבקה של הנגיפים המיוצרים, כגון בדיקת לוציפראז מבוססת לוציפראז מסוף ארוך (LTR), בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים p24 (ELISA) ובדיקת צביעה של כתב β-גל בהתאמה.
באמצעות רוב הפרוטוקולים הללו, דיווחנו לאחרונה על המשמעות התפקודית של זיהום HIV-1 על UPR בתאי T23, והתוצאות של מאמר זה מצביעות על אמינות השיטות המתוארות כאן. לפיכך, מאמר זה מספק סדרה של שיטות למידע מקיף לגבי יחסי הגומלין של HIV-1 עם מתח ER והפעלת UPR.
Protocol
Representative Results
Discussion
היקף הפרוטוקול הנוכחי כולל (i) טיפול במלאי נגיף HIV-1 ומדידת ריכוז הנגיף והדבקה בנגיף, (ii) זיהום תאי T ב- HIV-1 והערכת השפעתו על לחץ ER וסמנים שונים של UPR, (iii) השפעת הפלת סמני UPR והשפעתם על פעילות גנים מונעת HIV-1 LTR, ייצור וירוסים והדבקה בנגיפים ו-(iv) גירוי יתר של ה-UPR באמצעות מולקולה פר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרכז הלאומי למדעי התא, המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו, על התמיכה הפנימית. AT ו- AD אסירי תודה על תמיכת המחקר לתואר שלישי שהתקבלה מהמרכז הלאומי למדעי התא, המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו. DM אסירת תודה על המלגה הלאומית של JC Bose מ- SERB, ממשלת הודו.
Materials
| Acrylamamide | Biorad, USA | 1610107 | |
| Agarose | G-Biosciences, USA | RC1013 | |
| Ammonium persulphate | Sigma-Aldrich, USA | A3678 | |
| anti-ATF4 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 11815 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-ATF6 antibody | Abcam, UK | ab122897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-CHOP antibody | Cell Signaling Technology, USA | 2897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-eIF2α antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-11386 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| anti-GADD34 antibody | Abcam, UK | ab236516 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-32233 | Western blot detection Dilution-1:3000 |
| anti-HSPA5 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3177 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-IRE1 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| Anti-mouse HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706516 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
| anti-peIF2α antibody | Invitrogen, USA | 44-728G | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-PERK antibody | Cell Signaling Technology, USA | 5683 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| anti-pIRE1 antibody | Abcam, UK | ab243665 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| anti-pPERK antibody | Invitrogen, USA | PA5-40294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
| Anti-rabbit HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706515 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
| anti-XBP1 antibody | Abcam, UK | ab37152 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
| Bench top high speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5804R | Rotor- F-45-30-11 |
| Bench top low speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5702R | Rotor- A-4-38 |
| Bis-Acrylamide | Biorad, USA | 1610201 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP biomedicals, USA | 160069 | |
| Bradford reagent | Biorad, USA | 5000006 | |
| CalPhos mammalian Transfection kit | Clontech, Takara Bio, USA | 631312 | Virus stock preparation |
| CEM-GFP | NIH, AIDS Repository, USA | 3655 | |
| Clarity ECL substrate | Biorad, USA | 1705061 | chemiluminescence detecting substrate |
| Clarity max ECL substrate | Biorad, USA | 1705062 | chemiluminescence detecting substrate |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus, Japan | Model:FV3000 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | ASHA78300003 | |
| DMEM | Invitrogen, USA | 11995073 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D2650 | |
| dNTPs | Promega, USA | U1515 | |
| DTT | Invitrogen, USA | R0861 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | 12635 | |
| EtBr | Invitrogen, USA | `15585011 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, USA | 16000044 | |
| G418 | Invitrogen, USA | 11811023 | |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich, USA | G6257 | Infectivity assay |
| Glycine | Thermo Fisher Scientific, USA | Q24755 | |
| HEK-293T | NCCS, India | ||
| HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3 | NIH, AIDS Repository, USA | 114 | |
| Inverted microscope | Nikon, Japan | Model: Eclipse Ti2 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad, USA | 1715124 | |
| Jurkat J6 | NCCS, India | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, USA | M8266 | Infectivity assay |
| MMLV-RT | Invitrogen, USA | 28025013 | |
| MTT reagent | Sigma-Aldrich, USA | M5655 | Cell viability assay |
| N,N-dimethyl formamide | Fluka Chemika | 40255 | Infectivity assay |
| NaCl | Thermo Fisher Scientific, USA | Q27605 | |
| NaF | Sigma-Aldrich, USA | 201154 | |
| NP40 | Invitrogen, USA | 85124 | |
| P24 antigen capture ELISA kit | ABL, USA | 5421 | |
| PageRuler prestained protein ladder | Sci-fi Biologicals, India | PGPMT078 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, USA | P6148 | |
| pEGFP-N1 | Clontech, USA | 632515 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen, USA | 151140122 | |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 4906837001 | |
| Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC buffer | NEB,USA | M05532 | |
| pLKO.1-TRC | Addgene, USA | 10878 | Lentiviral cloning vector |
| pMD2.G | Addgene, USA | 12259 | VSV-G envelope vector |
| PMSF | Sigma-Aldrich, USA | P7626 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc., USA | 23966 | |
| Potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich, USA | 244023 | Infectivity assay |
| Potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich, USA | P3289 | Infectivity assay |
| Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 5056489001 | |
| psPAX2 | Addgene, USA | 12260 | Lentiviral packaging plasmid |
| Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P8833 | Selection of stable cells |
| PVDF membrane | Biorad, USA | 1620177 | |
| Random primers | Invitrogen, USA | 48190011 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen, USA | 22400105 | |
| SDS | Sigma-Aldrich, USA | L3771 | |
| Steady-Glo substrate | Promega, USA | E2510 | Luciferase assay |
| T4 DNA ligase | Invitrogen, USA | 15224017 | |
| TEMED | Invitrogen, USA | 17919 | |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich, USA | T9033 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich, USA | 596200 | |
| Tris | Thermo Fisher Scientific, USA | Q15965 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | |
| Trizol | Invitrogen, USA | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, USA | P1379 | |
| TZM-bl | NIH, AIDS Repository, USA | 8129 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Optima L90K, USA | 330049 | Rotor-SW28Ti |
| UltraPure X-gal | Invitrogen, USA | 15520-018 | Infectivity assay |
References
- Levy, J. A. . HIV and the Pathogenesis of AIDS. , (2007).
- Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
- Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
- Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
- Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
- Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
- Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
- Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
- Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
- Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
- Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
- Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
- Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
- Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
- Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
- Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
- Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307 (2010).
- Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
- Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
- Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
- Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855 (1998).
- Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
- Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).
- Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
- Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
- Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
- Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
- Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
- Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
- Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
- Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374 (2022).
- Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4 (2021).
- Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536 (2021).
- Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
- Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
- Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156 (2021).
