Medición del estrés del retículo endoplásmico y respuesta proteica desplegada en células T infectadas por VIH-1 y análisis de su papel en la replicación del VIH-1

NOTA: Las líneas celulares utilizadas aquí son HEK-293T y Jurkat J6 (una línea celular CD4 + T), que se obtuvieron del Repositorio de Células, NCCS, Pune, India; TZM-bl, una línea celular derivada de HeLa que ha integrado copias de los genes de β-galactosidasa y luciferasa bajo el promotor de repetición terminal larga (LTR) del VIH-124 y CEM-GFP (otra línea de células T reporteras CD4+)25 se obtuvieron del Repositorio de SIDA de los NIH, EE. UU. 1. Preparación y almacenamiento de las existencias del virus VIH-1 Preparación del stock del virus VIH-1NOTA: Se recomienda poner en práctica las directrices internacionales relacionadas con la bioseguridad disponibles en el manual de la Organización Mundial de la Salud (OMS) o de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) en todos los experimentos que involucren el VIH-1. La manipulación del virus y cualquier experimento con el virus vivo solo debe realizarse en un gabinete de bioseguridad adecuado ubicado en un laboratorio de contención de nivel BSL2 como mínimo. En este segmento del protocolo se describe la producción de partículas infecciosas del VIH-1 utilizando un kit de transfección de fosfato de calcio en mamíferos.Siembre las células HEK-293T en placas de 90 mm con 10 mL de DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco) completo (suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina) en una cabina de bioseguridad de clase II tipo A2 y manténgalo durante aproximadamente 12 h en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C para que la confluencia de las células esté entre el 50% y el 60%. Al día siguiente, prepare la mezcla de transfección: Prepare la solución A que contiene 25 μg de ADN plasmídico pNL4.3 (un clon molecular del VIH-1) en tampón estéril, 86,8 μL de 2 M de CaCl2 y el agua estéril restante para hacer el volumen final de 700 μL para cada placa. Prepare la solución B que contiene 700 μL de 2x solución salina tamponada con HEPES (HBS) para 1 placa. A continuación, ajuste el cálculo para el número total de placas. Ahora agregue la Solución B a la Solución A gota a gota mientras vórtice continuamente la Solución A. El volumen total de la mezcla de transfección ahora es de 1,4 mL para una placa.NOTA: La adición precisa gota a gota de la solución B a la solución A mientras el vórtice continuo conduce a la formación de complejos de transfección perfectos. Incubar esta mezcla a temperatura ambiente (RT) durante unos 20 min. A continuación, agregue lentamente la mezcla gota a gota a cada placa que contenga 9 ml de DMEM fresco y transfiera las placas a la incubadora de CO2 . Después de 8-10 h, cambie el medio existente con 10 mL nuevos de DMEM completo. Después de 24 horas después del cambio de medio, recoja el sobrenadante (que contiene las partículas del virus) de todas las placas en tubos cónicos. Centrifugar a 600 x g durante 5 min utilizando una centrífuga de mesa de baja velocidad (Tabla de Materiales) para eliminar los restos de celda. Transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga de polialómero y colóquelos en el rotor oscilante de una ultracentrífuga (Tabla de materiales). Verifique el equilibrio de los pesos de los soportes de los tubos y ajústelos con un medio estéril si es necesario. Ultracentrífuga a 1,41.000 x g durante 2,5 h a 4 °C. Después de esto, saque con cuidado los tubos y decante el sobrenadante lentamente dentro del gabinete de bioseguridad. Al pellet (que ahora es el virus concentrado) en cada tubo, agregue 1 mL de medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 incompleto y realice un pipeteo vigoroso para desalojar el pellet.NOTA: El pellet después de la ultracentrífuga es casi invisible a simple vista. Por lo tanto, debe asegurarse de agregar RPMI 1640 en el medio del tubo para que el pellet se desaloje correctamente. A continuación, añada 25 μL de 1 M HEPES pH 7,4 a 1 mL de suspensión de virus. Alicube 50 μL de la suspensión a tubos de centrífuga de 1,5 mL y almacene inmediatamente en un congelador a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo. Cuantificación de la concentración del virus y de la infectividad del viriónNOTA: Para calcular la infectividad del virus, primero es esencial cuantificar su concentración, lo que se hace mediante ELISA de captura de antígeno p24 (de acuerdo con las instrucciones del fabricante y, por lo tanto, no se describe aquí; consulte la tabla de materiales). Este proceso da la concentración del virus en nanogramos por microlitro (ng/μL) de la cepa, que luego se utiliza para identificar el número de virión infeccioso en la cepa a través del siguiente experimento en células reporteras TZM-bl26.Cuente y siembre 0,1 x 106 células TZM-bl en una placa de 24 pocillos utilizando 500 μL de DMEM completo para cada pocillo y manténgalo en una incubadora de cultivo celular durante 10-12 h. Asegúrese de que las células estén confluentes entre un 50% y un 60% antes de comenzar con la infección para la cuantificación del virus. Cambie el medio existente con 250 μL de DMEM completo fresco en cada pocillo.NOTA: Mantenga un pozo de control positivo para descartar cualquier falla experimental. Calcule la cantidad de virus de stock necesaria para infecciones de 1 ng, 0,1 ng y 0,01 ng en duplicados. Agregue la cantidad adecuada de virus a los pocillos y mantenga la placa en la incubadora a 37 °C durante 4 h. Lave las células dos veces con 500 μL de DMEM incompleto y luego agregue 500 μL de DMEM completo. Continúe con el procedimiento de tinción de β galones después de 36 h de cambio de medio.Deseche el medio existente y lave las células dos veces con 1 ml de PBS. Fije las células añadiendo 500 μL de la solución de fijación (0,25% de glutaraldehído en PBS) a cada pocillo e incube en RT dentro de la cabina de bioseguridad durante 5-7 min. Prepare la solución de tinción como se indica en la Tabla 1. Manténgalo alejado de la luz ya que X-gal es sensible a la luz. Lave las células una vez con 1 mL de PBS. Recubrir las células con 500 μL de solución de tinción recién preparada e incubar a 37 °C en la oscuridad durante 2-18 h. Para detener la reacción posterior, enjuague las células con 500 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) al 3% en PBS dos veces y luego mantenga las células en 500 μL de PBS fresco. Cuente las células azules infectadas (como se muestra en la Figura 1A) bajo el microscopio con un aumento de 10x para 5 campos aleatorios. Toma un conteo promedio de los 5 campos y multiplícalo por el factor de campo y el factor de dilución. Esto cuantifica las partículas de virión infeccioso en el stock de virus.NOTA: Para una placa de 24 pocillos, el factor de campo es 75. Componentes Preparación Volumen requerido PBS Prepare 1x PBS a partir de un stock de 10x PBS 14 mL Ferri-ferrocianuro de potasio Disuelva 0,82 g de ferricianuro de potasio y 1,06 g de ferrocianuro de potasio en 25 ml de 1x PBS 0,75 ml Cloruro de magnesio 1 M en 1 mL de 1x PBS 15 μL X-gal Disolver 30 mg en 0,6 mL de N,N-dimetil formamida (en oscuro) 0,3 mL Total = 15 mL Tabla 1: Lista de componentes necesarios para la tinción de β-gal en células TZM-bl. 2. Infección por VIH-1 de líneas de células T Descongelar y cultivar una línea de células T inmortalizadas. En este estudio se utilizó una línea celular CEM-GFP cultivada en medio RPMI 1640 completo suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina-estreptomicina al 1% y 500 μg/mL G418. Cuente y tome 2 millones de células para cada punto de tiempo (no infectadas, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h). Recoja las células no infectadas inmediatamente centrifugando a 100 x g durante 5 min y agregue tampón de lisis celular (50 mM de Tris-HCl pH 7.4, 0.12 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP40, 0.5 mM NaF, 1 mM DTT), suplementado con cóctel de inhibidores de la proteasa, 0.5 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y 1x inhibidor de la fosfatasa (50 μL para 1-3 millones de células) o lisado en el reactivo Trizol (1 mL para 1-3 millones de células) para el aislamiento de ARN (ver Tabla de Materiales). Lave las células una vez con 1 mL de medio RPMI 1640 completo que contenga polibreno (5 μg/mL) a 100 x g durante 5 min en RT. Resuspenda las células en 1 mL de medio completo.NOTA: El policereno es un polímero catiónico que se utiliza para mejorar la infección retroviral en células de mamíferos. Vuelva a suspender los 8 millones de células en 1 ml de medio completo que contenga policeno. Ahora calcule el volumen de stock viral requerido para 4 millones de partículas de virión, agregue el stock de virus y compense el volumen total a 2 mL agregando medios completos. Esto hace que sea un MOI de 0,5. Mantenga las células dentro de la incubadora de CO2 a 37 °C durante 4 h, con golpeteo intermitente cada 30-45 min. Después de 4 h, centrifugar las células y desechar el sobrenadante con cuidado dentro de la cabina de bioseguridad con los métodos de eliminación adecuados.NOTA: A partir de este paso, centrifugar las células a 100 x g durante 5 min a RT. Lavar las células dos veces con 1 mL de medio incompleto. Resuspender las células en 8 mL de medio completo, lo que hace que sea 1 millón de células/mL. En una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos, siembre un número igual de células en el número requerido de pocillos y mantenga la placa en una incubadora de CO2 mantenida a 37 °C. Durante los próximos 4 días, recoja las células cada 24 h añadiendo tampón de lisis celular. Además, recoja el sobrenadante y transfiéralo inmediatamente al congelador a -80 °C. Para comprobar si se ha producido una infección, proceda a realizar el ELISA de captura de antígeno p24 para todos los puntos temporales. Realice diluciones adecuadas para los puntos de tiempo, es decir, una dilución más baja para los puntos de tiempo iniciales y más alta para los posteriores que van de 1:50 a 1:500. Represente las lecturas en un gráfico que represente la progresión de la infección (Figura 1B). 3. Tinción de tioflavina T para determinar el estrés del RE Fijar 1 millón de células CEM-GFP no infectadas e infectadas con 0,5 MOI (tomadas 72 h de células infectadas) con 200 μL de paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 min en RT. Pulverizar las células a 100 x g durante 5 min y tratar con 500 μL de glicina 0,1 M durante 5 min, seguido de un lavado con 500 μL de PBS dos veces. Resuspender las células en 100 μL de PBS. Ensamble los portaobjetos de vidrio, las tarjetas de filtro y las cámaras de muestras. Agregue los 100 μL de células resuspendidas a las cámaras de muestra y haga girar las células a 1000 x g durante 4 min para que las células se adhieran a los portaobjetos en una citocentrífuga (Tabla de Materiales).NOTA: No habría suficientes células inmovilizadas en el portaobjetos después de la centrifugación por citocentrífuga si la suspensión celular está demasiado diluida. Es probable que las células se agrupen y se distribuyan mal después de la citocentrífuga, si la suspensión celular está muy concentrada. Permeabilizar las células durante 10 minutos utilizando gotas de Triton-X-100 al 0,1% en PBS (suficiente para cubrir la zona donde se han adherido las células) y lavar las células dos veces colocando PBS gota a gota y limpiando el PBS con un pañuelo de papel inclinando el portaobjetos. Incubar las células con 10 μL de 5 μM de tioflavina T durante 30 min.NOTA: No lavar después de la incubación con ThT. Monte los portaobjetos con 5 μL de medio de montaje (80% de glicerol v/v, 20% PBS v/v y 8 mg/mL de 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano [DABCO]), coloque el cubreobjetos y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Deja que los portaobjetos se sequen.NOTA: En todos estos pasos, asegúrese de que las células no se sequen. Tome las imágenes confocales de las células fijas con una lente de inmersión en glicerol de 63x en un microscopio confocal (consulte la tabla de materiales). Ajuste los siguientes ajustes de excitación y emisión: GFP (Ej. 494 nm, Em. 519 nm) y ThT (Ej. 458 nm, Em. 480-520 nm).NOTA: Cada canal fluorescente debe ser visualizado secuencialmente, en lugar de simultáneamente, para evitar la superposición de canales. La GFP se tomó como indicación de infección por VIH-1, ya que las células CEM-GFP tienen GFP bajo la regulación del promotor LTR, que se dispara tras la infección por VIH-125. Convierta las imágenes fluorescentes a 8 bits antes de cuantificarlas mediante análisis de umbral. Cuantifique la intensidad de cada célula manualmente utilizando un software como Image J (~50 celdas)27. Represente el gráfico con la intensidad de cada celda como puntos en el eje Y con respecto a los criterios infectados y no infectados. Para demostrar la efectividad de este protocolo, se debe realizar un control positivo, por ejemplo, el tratamiento con Thapsigargin (conocido inductor de estrés en el RE) en este caso28. Tratar 1 millón de células CEM-GFP, cada una con 1 μL de DMSO (control de vehículos) y 100 nM de Thapsigargin durante 12 h. Recoja las células y procese la tinción de ThT como se mencionó para las muestras infectadas (pasos 3.1-3.8).NOTA: Para estas muestras, no se requiere fluorescencia GFP. Por lo tanto, solo la fluorescencia ThT se captura en la microscopía confocal. 4. Determinación de la activación y expresión de varios marcadores UPR NOTA: Para determinar la expresión de los marcadores UPR se utilizan dos métodos: Immunoblotting y RT-PCR. Para la inmunotransferencia, recoja las células CEM-GFP infectadas con VIH-1 0,5 MOI en varios puntos después de la infección (24 h, 48 h, 72 h y 96 h post-infección) y vuelva a suspender la célula en el tampón de lisis (como se menciona en el paso 2.2). Alternativamente, para RT-PCR, los gránulos celulares se lisan en el reactivo Trizol (1 mL para 1-3 millones de células) (Ver Tabla de Materiales). Las células resuspendidas en tampón de lisis y reactivo de Trizol pueden almacenarse a -80 °C hasta su uso posterior. Immunoblotting para el análisis de marcadores UPR.Mantenga las células resuspendidas en el tampón de lisis en hielo durante 45 minutos con mezcla intermitente mediante un vórtice. Granule las celdas a 18000 x g durante 15 min utilizando una centrífuga de alta velocidad de sobremesa (consulte la tabla de materiales). Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo. Cuantifique la concentración de proteínas en cada muestra utilizando Bradford o un reactivo similar. Tome una concentración igual de proteína para cada muestra y prepare las muestras de proteína en tampón Laemmli (tampón 6x: 250 mM Tris-Cl pH 6.8, 10% SDS, 30% glicerol y 0.02% azul de bromofenol; 5% β-Mercaptoetanol).NOTA: Para la inmunotransferencia de cada marcador UPR, se utilizó un mínimo de 60-80 μg de proteína. Hervir las muestras de proteína a 96 °C durante 5 min y girar brevemente. Resuelva las muestras de proteínas en un gel SDS-PAGE al 10%-12% y transfiera las proteínas a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (consulte la tabla de materiales). Bloquear con leche en polvo descremada al 5% o albúmina sérica bovina (BSA) durante 1-2 h, lavar dos veces con TBST (20 mM Tris pH7.4 y 0.137 M NaCl; 0.1% Tween 20), y sondear con anticuerpos primarios específicos de proteínas contra marcadores UPR (ver Tabla de Materiales) en un balancín, durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, después de lavar las manchas dos veces con TBST, sondear con los anticuerpos secundarios respectivos durante 1,5 h. Lave las manchas de nuevo con TBST y visualice las bandas de proteínas utilizando un sustrato que detecta la quimioluminiscencia (consulte la Tabla de materiales) en un instrumento de adquisición de imágenes Western blot. RT PCRAísle el ARN total de las células utilizando el reactivo Trizol (consulte la tabla de materiales). Prepare el ADNc a partir de una concentración igual de ARN utilizando la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT) (consulte la tabla de materiales). Analizar la modulación de la expresión de ARNm de HSPA5, XBP1 empalmado, ATF4, CHOP y GADD34 mediante qRT-PCR con cebadores específicos de genes (Tabla 2). Brevemente, prepare mezclas de reacción de 10 μL que contengan una plantilla de ADNc (100 ng), 5 μL de colorante verde SYBR (consulte la tabla de materiales) y 10 pmol de cada par de cebadores de oligonucleótidos específicos del gen. Ajuste el volumen con H2O estéril. Ejecute las mezclas en una máquina de PCR en tiempo real utilizando el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min y 40 ciclos de 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s seguido del análisis de la curva de fusión. Calcule el cambio de pliegue en la expresión génica objetivo en relación con el gen de mantenimiento (por ejemplo, β-actina) como:Cambio de pliegue = 2-Δ(ΔCT)Donde ΔCT = CT (diana) − CT (gen de mantenimiento)y Δ(ΔCT) = ΔCT (tratado) -ΔCT (control) Para confirmar aún más el empalme de XBP1, realice una RT-PCR semicuantitativa con muestras no infectadas y 72 h infectadas.NOTA: El empalme del ARNm de XBP-1 se estudia mediante RT-PCR en el sitio de empalme. Amplificar el ADNc con cebadores XBP1 (Tabla 2) utilizando una mezcla maestra de PCR de alta fidelidad (ver Tabla de Materiales) en las siguientes condiciones: 1 ciclo de 98 °C durante 30 s, seguido de 5 ciclos de 98 °C durante 15 s, 65*Δ-5 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, seguidos de 30 ciclos de 98 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, seguido de una extensión final de 72 °C durante 10 min y mantener a 4 °C. Separe los amplicones en un gel de agarosa al 2,5% que contenga 50 ng de bromuro de etidio/mL y visualice en un instrumento de gel doc. La banda XBP1 empalmada es más pequeña en 26 nucleótidos. 5. Eliminación de marcadores UPR y análisis de la expresión génica impulsada por LTR y la producción de virus por VIH-1 Preparación de construcciones de shRNA para la eliminación de marcadores UPRCree construcciones de shRNA utilizando la columna vertebral del vector pLKO.1-TRC (vector de clonación lentiviral)29. Construya dos construcciones de shRNA para cada gen (IRE1, PERK, ATF6 y HSPA5). Los oligonucleótidos sentido y antisentido dirigidos al ARNm del gen respectivo son diseñados por el Consorcio ARNi (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (Tabla 3).NOTA: De manera similar, se pueden hacer construcciones de shRNA para otros marcadores UPR. Recocer los cebadores (100 nM de avance y retroceso) a 95 °C seguido de un enfriamiento gradual a RT. A continuación, ligarlo en los sitios Age1 y EcoRI del vector pLKO.1 utilizando una ligasa de ADN T4 (ver Tabla de Materiales). Confirme la secuencia mediante secuenciación de ADN.NOTA: Una construcción de shRNA dirigida al gen LacZ se utiliza como control no dirigido. Eliminación de PERK, ATF6, IRE1 y HSPA5 en células HEK-293T, ensayo de luciferasa y ELISA p24Prepare una mezcla de construcción de shRNA (0,9 μg) y un reactivo de transfección como la polietilenimina (PEI) (3 μL de PEI por 1 μg de ADN) (ver Tabla de Materiales) en 50 μL de medios libres de suero mediante vórtice e incube durante 20 min. A partir de un matraz HEK-293T confluente que contiene un matraz, tripsiniza y siembra ~0,25 x 106 células junto con la mezcla de transfección en una placa de 24 pocillos, haciendo el volumen total de 125 μL e incuba durante 6 h a 37 °C en una incubadora de CO2 . Este método se denomina transfección inversa, en la que las células se siembran junto con la mezcla de transfección. Después de 6 h, agregue 125 μL de medio completo a los pocillos y vuelva a suspender las celdas para una siembra uniforme.NOTA: Para los experimentos de derribo, la transfección inversa (pasos 5.2.1-5.2.3) proporciona una mejor eficiencia tanto con shRNAs como con siRNAs. Pasadas 24 h, realizar una segunda transfección. Prepare una mezcla de construcciones de pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) y pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0.5) con PEI (3 μL de PEI por 1 μg de ADN) en 50 μL de medios incompletos por vórtice. Incubar la mezcla durante 20 min en RT. Cambie el medio existente con 250 μL de medio fresco incompleto y agregue la mezcla a las celdas.NOTA: Un vector reportero para el VIH-1 LTR se desarrolló mediante la subclonación de LTR de pU3RIII30,31 en pGL3basic en el laboratorio anteriormente32. Se utilizó la expresión de GFP utilizando pEGFP-N1 para normalizar la eficiencia de la transfección32. Cambie el medio después de 6 h después de la transfección con 500 μL de DMEM completo. Recolectar las células después de 36 h para inmunotransferencia y ensayo de luciferasa. Para el ensayo de luciferasa, granule las células y vuelva a suspenderlas en un sustrato de luciferasa obtenido comercialmente (50 μL) (consulte la tabla de materiales). Agregue el lisado celular resuspendido a una placa opaca de 96 pocillos e incube durante 10-15 minutos. Obtenga la lectura de luciferasa en un luminómetro. Mida también la fluorescencia de GFP en las mismas muestras para normalizar la lectura de luciferasa en un lector de placas micromodo de microplaca (Ex: 494 nm, Em: 519 nm). Traza el gráfico como la unidad de luciferasa/GFP en el eje Y.NOTA: Se debe comprobar la eliminación de los respectivos marcadores UPR, y se puede realizar mediante inmunotransferencia o qRT-PCR utilizando anticuerpos específicos de genes o cebadores, respectivamente. Recoja los sobrenadantes para procesar el ELISA p24 como se mencionó anteriormente. Creación de células estables con knockdown de marcadores UPR e infección por VIH-1.Prepare las partículas de lentivirus mediante la transfección de células HEK-293T sembradas en una placa de 6 pocillos, con las respectivas construcciones de shRNA (1 μg) junto con pMD2.G (vector de envoltura VSV-G) (0,75 μg) y psPAX2 (plásmido de empaquetamiento lentiviral) (0,25 μg) (ver Tabla de Materiales) utilizando PEI en la proporción 1 μg de ADN: 3 μL de PEI. Prepare la mezcla en 100 μL de DMEM incompleto e incube durante 20 min en RT. Agregue la mezcla a 1,8 mL de medio completo en las células HEK-293T sembradas.NOTA: Siembre las células HEK-293T en una placa de 6 pocillos al menos 12 h antes de la transfección hasta que adquieran morfología y sean aproximadamente 60-70% confluentes. Después de 24 h de transfección, añadir 1 mL de DMEM completo a cada pocillo. Recoja los sobrenadantes después de 48 h, almacene a -80 °C en el congelador y realice el ELISA p24 para confirmar la presencia del virus en estos sobrenadantes. Utilice este sobrenadante lentiviral crudo para transducir células J6. Incubar 2 millones de células en una placa de 6 pocillos con un volumen igual de sobrenadante lentiviral (500 μL) para cada lentivirus de control y de eliminación específico del gen y agregar un medio RPMI 1640 completo y fresco en presencia de polibreno (5 μg/mL) para compensar el volumen a 2 mL. Después de 24 h, agregue Puromicina (1 μg/mL) a cada pocillo para seleccionar células estables. Después de agregar Puromicina, granule las células cada 24 h y agregue 2 mL de medio fresco con Puromicina. Haga esto hasta que no haya muerte celular (~ 1 semana). Las células supervivientes son las células estables con la eliminación genética deseada.NOTA: La eliminación de los genes respectivos se puede verificar a intervalos regulares y, finalmente, cuando solo las células sobrevivientes son visibles en medios que contienen puromicina mediante el uso de inmunotransferencia o qRT-PCR. Infectar las células LacZ y las células knockdown específicas del gen con 0,5 MOI de VIH-1 como se describe en la sección 2 y recolectar las células 48 h después de la infección. Recoja el sobrenadante de cada muestra y procese el ELISA p24 como se describió anteriormente y procese las células para verificar el nivel de knockdown mediante inmunotransferencia. 6. Tratamiento con inductor de estrés del RE y análisis de su efecto sobre la replicación del VIH-1 NOTA: Para determinar el efecto de la sobreestimulación de UPR durante la replicación del VIH-1, se puede utilizar la molécula inductora farmacológica, Thapsigargin. Determinación del porcentaje de viabilidad celular tras el tratamiento con Thapsigargin.NOTA: La citotoxicidad de la Thapsigargin se determina mediante el reactivo MTT (ver Tabla de Materiales).Siembre 25.000-30.000 células CEM-GFP por pocillo en una placa de 96 pocillos que contiene 100 μL de RPMI 1640 completo. Añada 100 nM de Thapsigargin al medio e incube a 37 °C en una incubadora.NOTA: Las células tratadas con 1 μL de DMSO se tomaron como vehículo de control. Después de 48 h, añadir 10 μL de MTT (5 mg/mL) en cada pocillo e incubar en la oscuridad durante 4 h para la formación de cristales de formazano a 37 °C con 5% de CO2. Después de 4 h, disuelva los cristales usando 100 μL de isopropanol para formar un color púrpura y mida la absorbancia a 570 nm usando un espectrofotómetro. Calcule el porcentaje de viabilidad de la celda en función de la ecuación que se muestra a continuación% de viabilidad celular = (ControlOD570 – TratamientoOD570)/ ControlOD570 x 100 Pretratamiento de Thapsigargin y análisis de la progresión de la infección por VIH-1 mediante ELISA p24.Siembre 1 millón de células CEM-GFP en una placa de 12 pocillos que contenga 1 mL de RPMI 1640 completo y trate las células con 100 nM de Thapsigargin o 1 μL de DMSO (control de vehículos) durante 12 h en una incubadora de CO2 mantenida a 37 °C. Después de 12 h, lavar las células con RPMI 1640 completo e infectar con 0,5 MOI de VIH-1 como se describió anteriormente. Recoja las células en diferentes puntos temporales, como 24 h, 48 h y 72 h después de la infección, para la inmunotransferencia. Recoja los sobrenadantes de cada muestra y realice el ELISA p24 como se describió anteriormente. Traza el gráfico con la concentración de p24 en la muestra como eje Y y los puntos de tiempo respectivos como eje X. Mediante el uso de inmunotransferencia, analice la inducción de estrés del RE debido al tratamiento con Thapsigargin midiendo el nivel de cualquier marcador UPR. En este estudio se utilizó HSPA5 como marcador. 7. Ensayo de infectividad TZM-bl β-gal para determinar el efecto de UPR sobre la infectividad del virión NOTA: Para comprender el papel de la UPR en la infectividad del virión, el sobrenadante del knockdown, así como el tratamiento con Thapsigargin, se puede utilizar para el ensayo de infectividad de TZM-bl β-gal como se describe en la sección 1.2, basado en la concentración de p24 determinada por p24 ELISA. Infecte las células TZM-bl con una concentración igual de p24 de cada muestra y realice la tinción de β galones. Cuente las células azules infectadas bajo el microscopio con un aumento de 10x para 5 campos aleatorios. Tome un promedio del recuento de los 5 campos para cada muestra de los pasos anteriores. Calcule el cambio de pliegue como se menciona a continuación:Cambio de pliegue = Número medio de células azules en las muestras de prueba/Número medio de células azules en la muestra de control.