Misurazione dello stress del reticolo endoplasmatico e della risposta proteica dispiegata nelle cellule T infette da HIV-1 e analisi del suo ruolo nella replicazione dell'HIV-1

La sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) è caratterizzata da una graduale riduzione del numero di linfociti T CD4⁺, che porta al progressivo fallimento della risposta immunitaria. Il virus dell’immunodeficienza umana-1 (HIV-1) è l’agente eziologico dell’AIDS. È un virus a RNA a singolo filamento con involucro, senso positivo, con due copie di RNA per virione e appartiene alla famiglia dei retroviridae. La produzione di alte concentrazioni di proteine virali all’interno della cellula ospite pone uno stress eccessivo sul meccanismo di ripiegamento delle proteine della cellula¹. L’ER è il primo compartimento della via secretoria delle cellule eucariotiche. È responsabile della produzione, dell’alterazione e della consegna delle proteine alla via secretoria e ai siti bersaglio dello spazio extracellulare. Le proteine subiscono numerosi cambiamenti post-traduzionali e si ripiegano nella loro conformazione naturale nell’ER, tra cui la glicosilazione legata all’asparagina e la creazione di legami disolfuro intra- e intermolecolari². Pertanto, nel lume dell’ER sono presenti alte concentrazioni di proteine e queste sono molto inclini all’aggregazione e al ripiegamento errato. Varie condizioni fisiologiche, come lo shock termico, le infezioni microbiche o virali, che richiedono una maggiore sintesi proteica o mutazione proteica, portano allo stress dell’ER a causa dell’aumento dell’accumulo di proteine nell’ER, disturbando così l’omeostasi del lume dell’ER. Lo stress dell’ER attiva una rete di vie di trasduzione del segnale adattive altamente conservate, l’Unfolded Protein Response (UPR)³. L’UPR viene impiegato per riportare la normale condizione fisiologica dell’ER allineando il suo carico proteico dispiegato e la capacità di ripiegamento. Ciò è causato dall’aumento delle dimensioni dell’ER e degli chaperoni molecolari e delle foldasi residenti nell’ER, con conseguente aumento della capacità di ripiegamento dell’ER. L’UPR riduce anche il carico proteico dell’ER attraverso l’attenuazione della sintesi proteica globale a livello traduzionale e aumenta la clearance delle proteine non ripiegate dall’ER attraverso l’upregolazione della degradazione associata all’ER (ERAD)^4,5.

Lo stress dell’ER è rilevato da tre proteine transmembrana residenti nell’ER: la proteina chinasi R (PKR)-like endoplasmic reticulum chinasi (PERK), il fattore di trascrizione attivante 6 (ATF6) e l’enzima di tipo 1 che richiede inositolo (IRE1). Tutti questi effettori sono mantenuti inattivi legandosi al chaperone Heat shock protein family A (Hsp70) member 5 (HSPA5), noto anche come proteina legante (BiP)/proteina regolata dal glucosio 78-kDa (GRP78). In seguito allo stress dell’ER e all’accumulo di proteine non ripiegate/mal ripiegate, HSPA5 si dissocia e porta all’attivazione di questi effettori, che poi attivano una serie di bersagli a valle che aiutano a risolvere lo stress dell’ER e, in condizioni estreme, promuovono la morte cellulare⁶. Dopo la dissociazione da HSPA5, PERK si autofosforilata e la sua attività chinasica viene attivata⁷. La sua attività chinasica fosforila eIF2α, che porta all’attenuazione traduzionale, abbassando il carico proteico dell’ER⁸. Tuttavia, in presenza del fattore di iniziazione fosfo-eucariotico 2α (eIF2α), i frame di lettura aperti non tradotti su specifici mRNA vengono tradotti preferenzialmente, come l’ATF4, regolando i geni indotti dallo stress. L’ATF4 e la proteina omologa C/EBP (CHOP) sono fattori di trascrizione che regolano i geni indotti dallo stress e regolano le vie dell’apoptosi e della morte cellulare ^9,10. Uno dei bersagli di ATF4 e CHOP è la proteina GADD34 (GADD34), che insieme alla proteina fosfatasi 1 defosforilata peIF2α e agisce come regolatore di feedback per l’attenuazione traduzionale¹¹. Sotto stress ER, ATF6 si dissocia da HSPA5 e il suo segnale di localizzazione del Golgi viene esposto, portando alla sua traslocazione nell’apparato di Golgi. Nell’apparato di Golgi, l’ATF6 viene scisso dalla proteasi del sito-1 (S1P) e dalla proteasi del sito-2 (S2P) per rilasciare la forma scissa di ATF6 (ATF6 P50). ATF6 p50 viene quindi traslocato nel nucleo, dove induce l’espressione di geni coinvolti nel ripiegamento, maturazione e secrezione delle proteine, nonché nella degradazione delle proteine^12,13. Durante lo stress ER, IRE1 si dissocia da HSPA5, si multimerizza e auto-fosforila¹⁴. La fosforilazione di IRE1 attiva il suo dominio RNasi, mediando in particolare lo splicing di 26 nucleotidi dalla parte centrale dell’mRNA della proteina legante X-box 1 (XBP1)^15,16. Questo genera un nuovo C-terminale che conferisce funzione di transattivazione, generando la proteina funzionale XBP1s, un potente fattore di trascrizione che controlla diversi geni indotti dallo stress ER^17,18. L’attività combinata di questi fattori di trascrizione attiva i programmi genetici volti a ripristinare l’omeostasi dell’ER.

Esistono vari metodi per rilevare lo stress ER e l’UPR. Questi includono i metodi convenzionali di analisi dei marcatori UPR^19,20. Vari metodi non convenzionali includono la misurazione dello stato redox dell’UPR e della distribuzione del calcio nel lume dell’ER, nonché la valutazione della struttura dell’ER. La microscopia elettronica può essere utilizzata per vedere quanto il lume dell’ER si allarga in risposta allo stress dell’ER nelle cellule e nei tessuti. Tuttavia, questo metodo richiede molto tempo e dipende dalla disponibilità di un microscopio elettronico, che potrebbe non essere disponibile per tutti i gruppi di ricerca. Inoltre, la misurazione del flusso di calcio e dello stato redox dell’ER è impegnativa a causa della disponibilità di reagenti. Inoltre, la lettura di questi esperimenti è molto sensibile e potrebbe essere influenzata da altri fattori del metabolismo cellulare.

Una tecnica potente e semplice per monitorare le uscite dell’UPR consiste nel misurare l’attivazione delle diverse vie di segnalazione dell’UPR ed è stata utilizzata per decenni in vari scenari di stress. Questi metodi convenzionali per misurare l’attivazione dell’UPR sono economici, fattibili e forniscono le informazioni in meno tempo rispetto ad altri metodi noti. Questi includono l’immunoblotting per misurare l’espressione dei marcatori UPR a livello proteico, come la fosforilazione di IRE1, PERK e eIF2α e la scissione di ATF6 misurando la forma P50 di ATF6 e l’espressione proteica di altri marcatori come HSPA5, XBP1, ATF4, CHOP e GADD34 spliced, nonché RT-PCR per determinare i livelli di mRNA e lo splicing dell’mRNA XBP1.

Questo articolo descrive un insieme convalidato e affidabile di protocolli per monitorare lo stress ER e l’attivazione dell’UPR nelle cellule infette da HIV-1 e per determinare la rilevanza funzionale dell’UPR nella replicazione e nell’infettività dell’HIV-1. I protocolli utilizzano reagenti facilmente reperibili ed economici e forniscono informazioni convincenti sulle uscite UPR. Lo stress ER è il risultato dell’accumulo di proteine non ripiegate/mal ripiegate, che tendono a formare aggregati proteici²¹. Con la presente descriviamo un metodo per rilevare questi aggregati proteici nelle cellule infette da HIV-1. La colorazione con tioflavina T è un metodo relativamente nuovo utilizzato per rilevare e quantificare questi aggregati proteici²². Beriault e Werstuck hanno descritto questa tecnica per rilevare e quantificare gli aggregati proteici e, quindi, i livelli di stress ER nelle cellule vive. È stato dimostrato che la piccola molecola fluorescente tioflavina T (ThT) si lega selettivamente agli aggregati proteici, in particolare alle fibrille amiloidi.

In questo articolo, descriviamo l’uso del ThT per rilevare e quantificare lo stress ER nelle cellule infette da HIV-1 e lo correliamo al metodo convenzionale di monitoraggio dell’UPR misurando l’attivazione di diverse vie di segnalazione dell’UPR.

Poiché mancano anche informazioni complete sul ruolo dell’UPR durante l’infezione da HIV-1, forniamo una serie di protocolli per comprendere il ruolo dell’UPR nella replicazione dell’HIV-1 e nell’infettività del virione. Questi protocolli includono il knockdown mediato da lentivirus dei marcatori UPR e il trattamento con induttori farmacologici dello stress ER. Questo articolo mostra anche i tipi di lettura che possono essere utilizzati per misurare l’espressione genica dell’HIV-1, la produzione virale e l’infettività dei virioni prodotti, come il saggio della luciferasi basato sulla ripetizione terminale lunga (LTR), il saggio di immunoassorbimento enzimatico p24 (ELISA) e il saggio di colorazione reporter β-gal.

Utilizzando la maggior parte di questi protocolli, abbiamo recentemente riportato l’implicazione funzionale dell’infezione da HIV-1 sull’UPR nelle cellule T²³, e i risultati di quell’articolo suggeriscono l’affidabilità dei metodi qui descritti. Pertanto, questo articolo fornisce una serie di metodi per informazioni complete sull’interazione di HIV-1 con lo stress ER e l’attivazione dell’UPR.