Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi
Summary
Mini-Tn7 tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bir akış pompası geninin tek kopyalı kromozomal tamamlayıcısı için tasarlanmış bir akış eksikliği olan Acinetobacter baumannii suşuna kolay bir prosedür tarif ediyoruz. Bu hassas genetik araç, çoklu ilaca dirençli patojenlerde akış pompalarının karakterizasyonu için anahtar olan kontrollü gen ekspresyonuna izin verir.
Abstract
Acinetobacter baumannii , antibiyotiklere karşı yaygın direnci nedeniyle zorlu bir Gram-negatif patojen olarak kabul edilmektedir. Yeni ve etkili terapötik seçenekler tasarlamak için bu direncin arkasındaki mekanizmaları anlamak çok önemlidir. Ne yazık ki, A. baumannii’deki bu mekanizmaları araştırma yeteneğimiz, uygun genetik manipülasyon araçlarının yetersizliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, fonksiyonel RND tipi akış mekanizmalarından yoksun bir A. baumannii suşunda tek kopya gen ekspresyonu elde etmek için kromozomal mini-Tn7 tabanlı bir sistemi kullanma yöntemlerini açıklıyoruz. Yüksek kopya sayılı plazmitlerde RND akış operonlarının varlığı genellikle bakteri hücreleri tarafından zayıf bir şekilde tolere edildiğinden, tek kopya ekleme ve indüklenebilir akış pompası ekspresyonu oldukça avantajlıdır. Ayrıca, rekombinant mini-Tn7 ekspresyon vektörlerinin, artan akış duyarlılığına sahip bir vekil A. baumannii konağının kromozomuna dahil edilmesi, diğer akış pompalarından kaynaklanan parazitlerin önlenmesine yardımcı olur. Bu sistem sadece karakterize edilmemiş bakteriyel akış pompalarını araştırmak için değil, aynı zamanda bu pompaları hedef alan potansiyel inhibitörlerin etkinliğini değerlendirmek için de değerlidir.
Introduction
Acinetobacter baumannii, tüm antibiyotik sınıflarına karşı kapsamlı direnci nedeniyle Dünya Sağlık Örgütü’nün en öncelikli patojenidir1. Çoğunlukla hastanede yatan, yaralanan veya bağışıklığı baskılanmış kişileri etkileyen fırsatçı bir patojendir. A. baumannii, en alakalı olanı Direnç-Nodülasyon-Bölümü (RND) ihracatçı ailesidir2. Bu akış pompalarının mekanik olarak nasıl çalıştığını anlamak, kişinin hedeflenen terapötik seçeneklerin geliştirilmesine olanak sağlayacaktır.
Hücresel süreçlerin spesifik olarak ayırt edilebilmesinin yaygın bir yolu, genetik manipülasyondur. Bununla birlikte, A. baumannii genetik çalışmaları için mevcut araçlar sınırlıdır ve deneysel tasarımı daha da karmaşık hale getirmek için, klinik izolatlar genellikle genetik manipülasyonlarda seçim için rutin olarak kullanılan antibiyotiklere dirençlidir3. Özellikle akış pompalarını incelerken karşılaşılan ikinci bir engel, genellikle bilinmeyen faktörler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmeleridir ve bu da işlevi tek bir pompaya doğru bir şekilde izole etmeyi ve atfetmeyizorlaştırır 4. Araştırma araç kutusunu genişletme ihtiyacını görerek, seçim işaretçisi 5,6,7’nin kaldırılmasına izin veren bir Flp rekombinaz hedef (FRT) kaseti içeren mini-Tn7 tabanlı, tek kopya ekleme, indüklenebilir bir ifade sistemi geliştirdik (Şekil 1). İlk olarak Pseudomonas 8,9,10 için oluşturulan bu zarif klonlama ve ekspresyon sistemi, A. baumannii’nin (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: bundan böyle A. baumannii AB258 olarak anılacaktır) RND akış pompası eksikliği olan bir suşuna tek kopyalı akış pompası tamamlayıcıları oluşturmak için kullanıldı11. Bir seferde bir akış pompasını inceleyebilmek ve bakteri hücrelerini yüksek kopya ekspresyon ile boğmamak (genellikle plazmid bazlı ekspresyon sistemlerinde görüldüğü gibi), her bir akış pompasının kritik, fizyolojik yönleri hakkında minimum parazit ve azaltılmış komplikasyonlarla daha iyi öğrenilebilir.
Bu makale, mini-Tn7 sisteminin, 9 gün boyunca gerçekleştirilen bir dizi karmaşık olmayan adımla A. baumannii AB258’in kromozomuna silinmiş bir gen, RND akış pompası adeIJK’yi tamamlamak için nasıl kullanılacağını açıklamaktadır7. İlk adım seti, iyi korunmuş glmS geninin akış aşağısındaki tek attTn7 ekleme bölgesinde mini-Tn7 tabanlı ekleme plazmidine (Şekil 2A) klonlanan silinmiş akış pompası genlerini yeniden tanıtır (Şekil 3A). Bu işlem, Tn7 güdümlü yerleştirme için gerekli olan transpozaz genlerini kodlayan replikatif olmayan bir yardımcı plazmit (Şekil 2B) ile kolaylaştırılır. İkinci adım seti, işaretlenmemiş bir suş oluşturmak için FRT bölgeleri (Şekil 3B) ile çevrili gentamisin geninin Flp rekombinaz aracılı çıkarılması için bir eksizyon plazmidi (Şekil 2C) kullanır. Bu sistem, antibiyotik direnci ile ilgili olarak RND akış pompalarının temel rollerini ve olası inhibitörlerini aydınlatmak için kullanılsa da, ilgilenilen herhangi bir geni araştırmak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
A. baumannii’de indüklenebilir tek kopyalı bir gen ekspresyon sisteminin kromozomal eklenmesi için bu prosedür teknik olarak basit ve emek yoğun olmasa da, vurgulanması gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, ortamın buz gibi soğuk su ile değiştirilmesi sırasında hücreler kırılgan hale geldiğinden, yetkin hücrelerin hazırlanması mümkün olduğunca buz üzerinde yapılmalıdır. İdeal olarak, santrifüj adımları 4 °C’de gerçekleştirilir, ancak oda sıcaklığında santrifüjl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi’nden AK’ye bir Keşif Hibesi ile desteklenmiştir. Şekillerde kullanılan şemalar BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| 0.2 mL PCR tube | VWR | 20170-012 | For colony boil preparations and PCR reactions |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72-690-301 | General use |
| 13-mL culture tubes, Pyrex | Fisher | 14-957K | Liquid culture vessels |
| 6x DNA loading buffer | Froggabio | LD010 | Agarose gel electrophoresis sample loading dye |
| Acetic acid, glacial | Fisher | 351271-212 | Agarose gel running buffer component |
| Agar | Bioshop | AGR003 | Solid growth media |
| Agarose | BioBasic | D0012 | Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2% |
| Agarose gel electrophoresis unit | Fisher | 29-237-54 | Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products |
| Carbenicillin | Fisher | 50841231 | Selective media |
| Culture tube closures | Fisher | 13-684-138 | Stainless steel closure for 13-mL culture tubes |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set | Biobasic | DD0058 | PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP |
| Dry bath/block heater | Fisher | 88860023 | Isotemp digital dry bath for boil preparations |
| Electroporation cuvettes | VWR | 89047-208 | 2 mm electroporation cuvettes with round cap |
| Electroporator | Cole Parmer | 940000009 | 110 VAC, 60 Hz electroporator |
| Ethidium bromide | Fisher | BP102-1 | Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR | CA-EM4050 | Agarose gel running buffer component |
| Gentamicin | Biobasic | GB0217 | For the preparation of selective media |
| Glycerol | Fisher | G33 | Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer |
| Incubator (shaking) | New Brunswick Scientific | M1352-0000 | Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth |
| Incubator (static) | Fisher | 11-690-550D | Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth |
| Inoculation loop | Sarstedt | 86.1562.050 | Streaking colonies onto agar plates |
| Inoculation spreader | Sarstedt | 86.1569.005 | Spreading of culture onto agar plates |
| Lysogeny broth (LB) broth, Lennox | Fisher | BP1427 | Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract) |
| Microfuge | Fisher | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples |
| Mini-centrifuge | Fisher | S67601B | Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes |
| Petri dishes | SPL Life Sciences | 10090 | For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm |
| Pipettes | Mandel | Various | Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Power supply | Biorad | 1645050 | PowerPac Basic power supply for electrophoresis |
| Primers | IDT | NA | PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet |
| Sucrose | BioBasic | SB0498 | For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii |
| Taq DNA polymerase | FroggaBio | T-500 | PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer |
| Thermal cycler | Biorad | 1861096 | Model T100 for PCR |
| Toothpicks | Fisher | S24559 | For patching colonies onto agar plates |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Agarose gel running buffer component |
| Ultrapure water | Millipore Sigma | ZLXLSD51040 | MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing |
| Wide range DNA marker | Biobasic | M103R-2 | Size determination of PCR products on an agarose gel |
| Wooden inoculating sticks | Fisher | 29-801-02 | Inoculating cultures with colonies from agar plates |
References
- Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017)
- Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
- Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380 (2020).
- Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
- Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
- Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
- Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
- Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
- Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
- Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288 (2021).
- Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
- Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
- Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373 (2021).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , (2021).
- Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
- Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110 (2016).
- Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
- Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
- Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
- Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).
- Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16 (2020).
