Karakterisering van multidrug effluxsystemen in Acinetobacter baumannii met behulp van een efflux-deficiënte bacteriestam en een single-copy genexpressiesysteem
Summary
We beschrijven een eenvoudige procedure voor de single-copy chromosomale complementatie van een effluxpompgen met behulp van een mini-Tn7-gebaseerd expressiesysteem in een gemanipuleerde efflux-deficiënte stam van Acinetobacter baumannii. Dit nauwkeurige genetische hulpmiddel maakt gecontroleerde genexpressie mogelijk, wat essentieel is voor de karakterisering van effluxpompen in multiresistente pathogenen.
Abstract
Acinetobacter baumannii wordt erkend als een uitdagende Gram-negatieve ziekteverwekker vanwege de wijdverbreide resistentie tegen antibiotica. Het is van cruciaal belang om de mechanismen achter deze weerstand te begrijpen om nieuwe en effectieve therapeutische opties te ontwerpen. Helaas wordt ons vermogen om deze mechanismen in A. baumannii te onderzoeken belemmerd door het gebrek aan geschikte genetische manipulatie-instrumenten. Hier beschrijven we methoden voor het gebruik van een chromosomaal mini-Tn7-gebaseerd systeem om genexpressie met één kopie te bereiken in een A. baumannii-stam die geen functionele RND-type effluxmechanismen heeft. Het inbrengen van één kopie en de expressie van de induceerbare effluxpomp zijn vrij voordelig, aangezien de aanwezigheid van RND-operonen op plasmiden met een hoog aantal kopieën vaak slecht wordt verdragen door bacteriële cellen. Bovendien helpt het opnemen van recombinante mini-Tn7-expressievectoren in het chromosoom van een surrogaat A. baumannii-gastheer met verhoogde effluxgevoeligheid interferentie van andere effluxpompen te omzeilen. Dit systeem is niet alleen waardevol voor het onderzoeken van niet-gekarakteriseerde bacteriële effluxpompen, maar ook voor het beoordelen van de effectiviteit van potentiële remmers die zich op deze pompen richten.
Introduction
Acinetobacter baumannii is een ziekteverwekker met de hoogste prioriteit van de Wereldgezondheidsorganisatie vanwege zijn alomvattende resistentie tegen alle klassen antibiotica1. Het is een opportunistische ziekteverwekker die vooral gehospitaliseerde, gewonde of immuungecompromitteerde mensen treft. A. baumannii ontwijkt antibiotica grotendeels via effluxpompen, de meest relevante is de Resistance-Nodulation-Division (RND)-familie van exporteurs2. Door te begrijpen hoe deze effluxpompen mechanistisch werken, kan men gerichte therapeutische opties ontwikkelen.
Een veel voorkomende manier waarop cellulaire processen specifiek kunnen worden onderscheiden, is door middel van genetische manipulatie. De instrumenten die beschikbaar zijn voor genetische studies van A. baumannii zijn echter beperkt, en om het experimentele ontwerp verder te verwarren, zijn klinische isolaten vaak resistent tegen de antibiotica die routinematig worden gebruikt voor selectie bij genetische manipulaties3. Een tweede hindernis die men tegenkomt bij het specifiek bestuderen van effluxpompen is dat ze strikt worden gereguleerd – vaak door onbekende factoren – waardoor het moeilijk is om een enkele pomp nauwkeurig te isoleren en functie toe te schrijven4. Omdat we deze noodzaak zagen om de onderzoekstoolbox uit te breiden, ontwikkelden we een mini-Tn7-gebaseerd, single-copy-insertion, induceerbaar expressiesysteem dat een Flp-recombinasedoelcassette (FRT) bevat, waarmee de selectiemarker 5,6,7 kan worden verwijderd (Figuur 1). Dit elegante kloon- en expressiesysteem, dat voor het eerst werd ontwikkeld voor Pseudomonas 8,9,10, werd gebruikt om enkelvoudige efluxpompcomplementen te genereren in een RND-effluxpomp-deficiënte stam van A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: hierna A. baumannii AB258) genoemd die we11. Omdat men in staat is om één effluxpomp tegelijk te bestuderen en de bacteriële cellen niet te overweldigen met expressie met hoge kopieën (zoals over het algemeen wordt gezien bij op plasmiden gebaseerde expressiesystemen), kan men beter leren over de kritische, fysiologische aspecten van elke effluxpomp met minimale interferentie en minder complicaties.
Dit artikel beschrijft hoe het mini-Tn7-systeem kan worden gebruikt om een verwijderd gen van belang, RND-effluxpomp adeIJK, aan te vullen in het chromosoom van A. baumannii AB258 door middel van een reeks ongecompliceerde stappen die in de loop van 9 dagen worden uitgevoerd7. De eerste reeks stappen herintroduceert de verwijderde effluxpompgenen die zijn gekloond in het mini-Tn7-gebaseerde insertieplasmide (Figuur 2A) op de enkele attTn7-insertieplaats stroomafwaarts van het goed geconserveerde glmS-gen (Figuur 3A). Dit proces wordt vergemakkelijkt door een niet-replicatief helperplasmide (Figuur 2B) dat codeert voor de transposasegenen die nodig zijn voor Tn7-gestuurde insertie. De tweede reeks stappen maakt gebruik van een excisieplasmide (Figuur 2C) voor Flp-recombinase-gemedieerde verwijdering van het gentamicine-gen geflankeerd door FRT-plaatsen (Figuur 3B) om een ongemarkeerde stam te creëren. Hoewel dit systeem wordt gebruikt om de essentiële rollen en mogelijke remmers van RND-effluxpompen met betrekking tot antibioticaresistentie op te helderen, kan het worden gebruikt om elk interessant gen te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel deze procedure voor het chromosomaal inbrengen van een induceerbaar genexpressiesysteem met één kopie in A. baumannii technisch eenvoudig en niet arbeidsintensief is, zijn er een paar belangrijke stappen die moeten worden benadrukt. Ten eerste moet de voorbereiding van de competente cellen zoveel mogelijk op ijs gebeuren, omdat de cellen kwetsbaar worden tijdens het vervangen van de media door ijskoud water. Idealiter worden de centrifugatiestappen uitgevoerd bij 4 °C, maar centrifugeren bij kamertempe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Discovery Grant van de Natural Science and Engineering Council of Canada aan AK. De schema’s die in de figuren worden gebruikt, zijn gemaakt met BioRender.com.
Materials
| 0.2 mL PCR tube | VWR | 20170-012 | For colony boil preparations and PCR reactions |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72-690-301 | General use |
| 13-mL culture tubes, Pyrex | Fisher | 14-957K | Liquid culture vessels |
| 6x DNA loading buffer | Froggabio | LD010 | Agarose gel electrophoresis sample loading dye |
| Acetic acid, glacial | Fisher | 351271-212 | Agarose gel running buffer component |
| Agar | Bioshop | AGR003 | Solid growth media |
| Agarose | BioBasic | D0012 | Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2% |
| Agarose gel electrophoresis unit | Fisher | 29-237-54 | Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products |
| Carbenicillin | Fisher | 50841231 | Selective media |
| Culture tube closures | Fisher | 13-684-138 | Stainless steel closure for 13-mL culture tubes |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set | Biobasic | DD0058 | PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP |
| Dry bath/block heater | Fisher | 88860023 | Isotemp digital dry bath for boil preparations |
| Electroporation cuvettes | VWR | 89047-208 | 2 mm electroporation cuvettes with round cap |
| Electroporator | Cole Parmer | 940000009 | 110 VAC, 60 Hz electroporator |
| Ethidium bromide | Fisher | BP102-1 | Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR | CA-EM4050 | Agarose gel running buffer component |
| Gentamicin | Biobasic | GB0217 | For the preparation of selective media |
| Glycerol | Fisher | G33 | Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer |
| Incubator (shaking) | New Brunswick Scientific | M1352-0000 | Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth |
| Incubator (static) | Fisher | 11-690-550D | Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth |
| Inoculation loop | Sarstedt | 86.1562.050 | Streaking colonies onto agar plates |
| Inoculation spreader | Sarstedt | 86.1569.005 | Spreading of culture onto agar plates |
| Lysogeny broth (LB) broth, Lennox | Fisher | BP1427 | Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract) |
| Microfuge | Fisher | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples |
| Mini-centrifuge | Fisher | S67601B | Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes |
| Petri dishes | SPL Life Sciences | 10090 | For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm |
| Pipettes | Mandel | Various | Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Power supply | Biorad | 1645050 | PowerPac Basic power supply for electrophoresis |
| Primers | IDT | NA | PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet |
| Sucrose | BioBasic | SB0498 | For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii |
| Taq DNA polymerase | FroggaBio | T-500 | PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer |
| Thermal cycler | Biorad | 1861096 | Model T100 for PCR |
| Toothpicks | Fisher | S24559 | For patching colonies onto agar plates |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Agarose gel running buffer component |
| Ultrapure water | Millipore Sigma | ZLXLSD51040 | MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing |
| Wide range DNA marker | Biobasic | M103R-2 | Size determination of PCR products on an agarose gel |
| Wooden inoculating sticks | Fisher | 29-801-02 | Inoculating cultures with colonies from agar plates |
References
- Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017)
- Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
- Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380 (2020).
- Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
- Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
- Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
- Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
- Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
- Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
- Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288 (2021).
- Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
- Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
- Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373 (2021).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , (2021).
- Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
- Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110 (2016).
- Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
- Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
- Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
- Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).
- Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16 (2020).
