Caratterizzazione di sistemi di efflusso multifarmaco in Acinetobacter baumannii utilizzando un ceppo batterico carente di efflusso e un sistema di espressione genica a singola copia
Summary
Descriviamo una procedura semplice per la complementazione cromosomica a singola copia di un gene della pompa di efflusso utilizzando un sistema di espressione basato su mini-Tn7 in un ceppo ingegnerizzato di Acinetobacter baumannii con deficit di eflusso. Questo preciso strumento genetico consente un’espressione genica controllata, che è fondamentale per la caratterizzazione delle pompe di efflusso in patogeni multiresistenti ai farmaci.
Abstract
L’Acinetobacter baumannii è riconosciuto come un patogeno Gram-negativo impegnativo a causa della sua diffusa resistenza agli antibiotici. È fondamentale comprendere i meccanismi alla base di questa resistenza per progettare nuove ed efficaci opzioni terapeutiche. Sfortunatamente, la nostra capacità di studiare questi meccanismi in A. baumannii è ostacolata dalla scarsità di strumenti di manipolazione genetica adeguati. Qui, descriviamo i metodi per utilizzare un sistema cromosomico basato su mini-Tn7 per ottenere l’espressione genica a singola copia in un ceppo di A. baumannii che manca di meccanismi funzionali di efflusso di tipo RND. L’inserzione di una singola copia e l’espressione della pompa di efflusso inducibile sono piuttosto vantaggiose, poiché la presenza di operoni di efflusso RND su plasmidi ad alto numero di copie è spesso mal tollerata dalle cellule batteriche. Inoltre, l’incorporazione di vettori di espressione ricombinanti di mini-Tn7 nel cromosoma di un ospite surrogato di A. baumannii con una maggiore sensibilità all’efflusso aiuta ad aggirare l’interferenza di altre pompe di eflusso. Questo sistema è prezioso non solo per studiare le pompe di efflusso batterico non caratterizzate, ma anche per valutare l’efficacia di potenziali inibitori che prendono di mira queste pompe.
Introduction
L’Acinetobacter baumannii è un patogeno prioritario dell’Organizzazione Mondiale della Sanità a causa della sua resistenza a tutte le classi di antibiotici1. È un agente patogeno opportunista che colpisce principalmente persone ospedalizzate, ferite o immunocompromesse. A. baumannii elude in gran parte gli antibiotici attraverso le pompe di efflusso, la più rilevante delle quali è la famiglia di esportatori Resistance-Nodulation-Division (RND)2. Capire come funzionano meccanicamente queste pompe di efflusso consentirà di sviluppare opzioni terapeutiche mirate.
Un modo comune in cui i processi cellulari possono essere distinti in modo specifico è attraverso la manipolazione genetica. Tuttavia, gli strumenti disponibili per gli studi genetici di A. baumannii sono limitati e, per confondere ulteriormente il disegno sperimentale, gli isolati clinici sono spesso resistenti agli antibiotici utilizzati di routine per la selezione nelle manipolazioni genetiche3. Un secondo ostacolo che si incontra quando si studiano le pompe di efflusso in modo specifico è che sono strettamente regolate, spesso da fattori sconosciuti, rendendo difficile isolare e attribuire con precisione la funzione a una singola pompa4. Vedendo questa necessità di espandere la gamma di strumenti di ricerca, abbiamo sviluppato un sistema di espressione inducibile basato su mini-Tn7, a singola copia, che incorpora una cassetta di bersagli ricombinasi Flp (FRT), che consente la rimozione del marcatore di selezione 5,6,7 (Figura 1). Creato per la prima volta per Pseudomonas 8,9,10, questo elegante sistema di clonazione ed espressione è stato utilizzato per generare complementi di pompa di efflusso a copia singola in un ceppo di A. baumannii carente di pompa di efflusso RND (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: di seguito denominato A. baumannii AB258) che abbiamo generato11. Essendo in grado di studiare una pompa di efflusso alla volta e non sovraccaricare le cellule batteriche con un’elevata espressione di copie (come generalmente si vede con i sistemi di espressione basati su plasmidi), si possono conoscere meglio gli aspetti critici e fisiologici di ciascuna pompa di efflusso con interferenze minime e complicanze ridotte.
Questo articolo descrive come utilizzare il sistema mini-Tn7 per integrare un gene di interesse eliminato, la pompa di efflusso RND adeIJK, nel cromosoma di A. baumannii AB258 attraverso una serie di passaggi semplici eseguiti nel corso di 9 giorni7. La prima serie di passaggi reintroduce i geni della pompa di efflusso eliminati clonati nel plasmide di inserzione basato su mini-Tn7 (Figura 2A) nel singolo sito di inserzione attTn7 a valle del gene glmS ben conservato (Figura 3A). Questo processo è facilitato da un plasmide helper non replicativo (Figura 2B) che codifica per i geni della trassposasi necessari per l’inserimento guidato da Tn7. La seconda serie di passaggi utilizza un plasmide di escissione (Figura 2C) per la rimozione mediata dalla ricombinasi Flp del gene della gentamicina affiancato da siti FRT (Figura 3B) per creare un ceppo non marcato. Sebbene questo sistema sia utilizzato per chiarire i ruoli essenziali e i possibili inibitori delle pompe di efflusso RND rispetto alla resistenza agli antibiotici, può essere utilizzato per studiare qualsiasi gene di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se questa procedura per l’inserimento cromosomico di un sistema di espressione genica inducibile a singola copia in A. baumannii è tecnicamente semplice e non laboriosa, ci sono alcuni passaggi importanti che devono essere sottolineati. Innanzitutto, la preparazione delle cellule competenti deve essere eseguita il più possibile su ghiaccio poiché le cellule diventano fragili durante la sostituzione del terreno con acqua ghiacciata. Idealmente, le fasi di centrifugazione vengono eseguite a 4 °C, ma la c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per la scoperta da parte del Natural Science and Engineering Council of Canada all’AK. Gli schemi utilizzati nelle figure sono creati con BioRender.com.
Materials
| 0.2 mL PCR tube | VWR | 20170-012 | For colony boil preparations and PCR reactions |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72-690-301 | General use |
| 13-mL culture tubes, Pyrex | Fisher | 14-957K | Liquid culture vessels |
| 6x DNA loading buffer | Froggabio | LD010 | Agarose gel electrophoresis sample loading dye |
| Acetic acid, glacial | Fisher | 351271-212 | Agarose gel running buffer component |
| Agar | Bioshop | AGR003 | Solid growth media |
| Agarose | BioBasic | D0012 | Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2% |
| Agarose gel electrophoresis unit | Fisher | 29-237-54 | Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products |
| Carbenicillin | Fisher | 50841231 | Selective media |
| Culture tube closures | Fisher | 13-684-138 | Stainless steel closure for 13-mL culture tubes |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set | Biobasic | DD0058 | PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP |
| Dry bath/block heater | Fisher | 88860023 | Isotemp digital dry bath for boil preparations |
| Electroporation cuvettes | VWR | 89047-208 | 2 mm electroporation cuvettes with round cap |
| Electroporator | Cole Parmer | 940000009 | 110 VAC, 60 Hz electroporator |
| Ethidium bromide | Fisher | BP102-1 | Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR | CA-EM4050 | Agarose gel running buffer component |
| Gentamicin | Biobasic | GB0217 | For the preparation of selective media |
| Glycerol | Fisher | G33 | Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer |
| Incubator (shaking) | New Brunswick Scientific | M1352-0000 | Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth |
| Incubator (static) | Fisher | 11-690-550D | Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth |
| Inoculation loop | Sarstedt | 86.1562.050 | Streaking colonies onto agar plates |
| Inoculation spreader | Sarstedt | 86.1569.005 | Spreading of culture onto agar plates |
| Lysogeny broth (LB) broth, Lennox | Fisher | BP1427 | Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract) |
| Microfuge | Fisher | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples |
| Mini-centrifuge | Fisher | S67601B | Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes |
| Petri dishes | SPL Life Sciences | 10090 | For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm |
| Pipettes | Mandel | Various | Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Power supply | Biorad | 1645050 | PowerPac Basic power supply for electrophoresis |
| Primers | IDT | NA | PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet |
| Sucrose | BioBasic | SB0498 | For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii |
| Taq DNA polymerase | FroggaBio | T-500 | PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer |
| Thermal cycler | Biorad | 1861096 | Model T100 for PCR |
| Toothpicks | Fisher | S24559 | For patching colonies onto agar plates |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Agarose gel running buffer component |
| Ultrapure water | Millipore Sigma | ZLXLSD51040 | MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing |
| Wide range DNA marker | Biobasic | M103R-2 | Size determination of PCR products on an agarose gel |
| Wooden inoculating sticks | Fisher | 29-801-02 | Inoculating cultures with colonies from agar plates |
References
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