אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית
Summary
אנו מתארים הליך קל להשלמה כרומוזומלית בעותק יחיד של גן משאבת אפלוקס באמצעות מערכת ביטוי מבוססת מיני Tn7 לזן מהונדס חסר אפלוקס של Acinetobacter baumannii. כלי גנטי מדויק זה מאפשר ביטוי גנים מבוקר, שהוא המפתח לאפיון משאבות אפלוקס בפתוגנים עמידים לתרופות רבות.
Abstract
Acinetobacter baumannii מוכר כפתוגן גראם-שלילי מאתגר בשל עמידותו הנרחבת לאנטיביוטיקה. חיוני להבין את המנגנונים העומדים מאחורי התנגדות זו כדי לעצב אפשרויות טיפוליות חדשות ויעילות. למרבה הצער, יכולתנו לחקור מנגנונים אלה ב- A. baumannii נפגעת על ידי מיעוט כלי מניפולציה גנטיים מתאימים. במאמר זה אנו מתארים שיטות לשימוש במערכת כרומוזומלית מבוססת מיני-Tn7 להשגת ביטוי גנים בעותק יחיד בזן A. baumannii חסר מנגנוני אפלוקס פונקציונליים מסוג RND. החדרת עותק יחיד וביטוי משאבת אפלוקס מושרית הם יתרון למדי, מכיוון שנוכחותם של אופרוני אפלוקס RND על פלסמידים בעלי מספר העתק גבוה נסבלת לעתים קרובות בצורה גרועה על ידי תאי חיידקים. יתר על כן, שילוב וקטורי ביטוי מיני-Tn7 רקומביננטיים בכרומוזום של פונדקאי חלופי A. baumannii עם רגישות מוגברת לשטף מסייע לעקוף הפרעות ממשאבות אפלוקס אחרות. מערכת זו היא בעלת ערך לא רק לחקר משאבות אפלוקס חיידקיות לא מאופיינות אלא גם להערכת היעילות של מעכבים פוטנציאליים המכוונים למשאבות אלה.
Introduction
Acinetobacter baumannii הוא פתוגן בעדיפות עליונה של ארגון הבריאות העולמי בשל עמידותו המקיפה לכל סוגי האנטיביוטיקה1. זהו פתוגן אופורטוניסטי המשפיע בעיקר על אנשים מאושפזים, פצועים או מדוכאי חיסון. A. baumannii מתחמק במידה רבה מאנטיביוטיקה באמצעות משאבות אפלוקס, הרלוונטית ביותר היא משפחת היצואנים Resistance-Nodulation-Division (RND)2. הבנת האופן שבו משאבות אפלוקס אלה פועלות באופן מכניסטי תאפשר לפתח אפשרויות טיפוליות ממוקדות.
אחת הדרכים הנפוצות שבהן ניתן להבחין באופן ספציפי בין תהליכים תאיים היא באמצעות מניפולציה גנטית. עם זאת, הכלים הזמינים למחקרים גנטיים של A. baumannii מוגבלים, וכדי לבלבל עוד יותר את תכנון הניסוי, מבודדים קליניים עמידים לעתים קרובות לאנטיביוטיקה המשמשת באופן שגרתי לבחירה במניפולציות גנטיות3. משוכה שנייה בה נתקלים כאשר חוקרים משאבות אפלוקס באופן ספציפי היא שהן מווסתות בקפדנות – לעתים קרובות על ידי גורמים לא ידועים – מה שמקשה על בידוד מדויק וייחוס תפקוד למשאבה בודדת4. כשראינו את הצורך הזה להרחיב את ארגז הכלים של המחקר, פיתחנו מערכת ביטוי אינדוקטיבי מבוססת מיני-Tn7, חד-העתקה, המשלבת קלטת יעד רקומבינאז Flp (FRT), המאפשרת להסיר את סמן הבחירה 5,6,7 (איור 1). מערכת השיבוט והביטוי האלגנטית הזו, שנוצרה לראשונה עבור Pseudomonas 8,9,10, שימשה ליצירת משלים של משאבת אפלוקס בעותק יחיד לזן חסר משאבת אפלוקס RND של A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: להלן A. baumannii AB258) שיצרנו11. היכולת לחקור משאבת אפלוקס אחת בכל פעם ולא להציף את תאי החיידקים בביטוי העתק גבוה (כפי שניתן לראות בדרך כלל במערכות ביטוי מבוססות פלסמיד), ניתן ללמוד טוב יותר על ההיבטים הפיזיולוגיים הקריטיים של כל משאבת אפלוקס עם הפרעה מינימלית וסיבוכים מופחתים.
מאמר זה מתאר כיצד להשתמש במערכת mini-Tn7 כדי להשלים גן שנמחק, RND efflux pump adeIJK, לתוך הכרומוזום של A. baumannii AB258 באמצעות סדרה של צעדים לא מסובכים שבוצעו במהלך 9 ימים7. קבוצת השלבים הראשונה מציגה מחדש את הגנים שנמחקו של משאבת ה-efflux ששובטו לתוך פלסמיד החדרה מבוסס mini-Tn7 (איור 2A) באתר ההחדרה היחיד שלTn7 במורד הזרם של הגן glmS שהשתמר היטב (איור 3A). התהליך הזה מנוהל על-ידי פלסמיד עוזר לא משוכפל (איור 2B) שמקודד לגנים הטרנספוזאזים הדרושים להחדרה מונעת Tn7. קבוצת השלבים השנייה משתמשת בפלסמיד כריתה (איור 2C) להסרה בתיווך רקומבינאז של הגן גנטמיצין שמשני צדדיו אתרי FRT (איור 3B) כדי ליצור זן לא מסומן. למרות שמערכת זו משמשת להבהרת התפקידים החיוניים והמעכבים האפשריים של משאבות RND ביחס לעמידות לאנטיביוטיקה, ניתן להשתמש בה כדי לחקור כל גן מעניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
אף על פי שהליך זה להחדרה כרומוזומלית של מערכת ביטוי גנים חד-עותקית מושרית ב- A. baumannii הוא פשוט מבחינה טכנית ואינו דורש עבודה רבה, ישנם מספר שלבים חשובים שיש לשים עליהם דגש. ראשית, הכנת התאים המוסמכים צריכה להיעשות על קרח ככל האפשר מכיוון שהתאים הופכים שבירים במהלך החלפת המדיה במים קרים כ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק גילוי מהמועצה למדעי הטבע וההנדסה של קנדה ל- AK. הסכמות המשמשות באיורים נוצרות עם BioRender.com.
Materials
| 0.2 mL PCR tube | VWR | 20170-012 | For colony boil preparations and PCR reactions |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72-690-301 | General use |
| 13-mL culture tubes, Pyrex | Fisher | 14-957K | Liquid culture vessels |
| 6x DNA loading buffer | Froggabio | LD010 | Agarose gel electrophoresis sample loading dye |
| Acetic acid, glacial | Fisher | 351271-212 | Agarose gel running buffer component |
| Agar | Bioshop | AGR003 | Solid growth media |
| Agarose | BioBasic | D0012 | Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2% |
| Agarose gel electrophoresis unit | Fisher | 29-237-54 | Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products |
| Carbenicillin | Fisher | 50841231 | Selective media |
| Culture tube closures | Fisher | 13-684-138 | Stainless steel closure for 13-mL culture tubes |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set | Biobasic | DD0058 | PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP |
| Dry bath/block heater | Fisher | 88860023 | Isotemp digital dry bath for boil preparations |
| Electroporation cuvettes | VWR | 89047-208 | 2 mm electroporation cuvettes with round cap |
| Electroporator | Cole Parmer | 940000009 | 110 VAC, 60 Hz electroporator |
| Ethidium bromide | Fisher | BP102-1 | Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR | CA-EM4050 | Agarose gel running buffer component |
| Gentamicin | Biobasic | GB0217 | For the preparation of selective media |
| Glycerol | Fisher | G33 | Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer |
| Incubator (shaking) | New Brunswick Scientific | M1352-0000 | Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth |
| Incubator (static) | Fisher | 11-690-550D | Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth |
| Inoculation loop | Sarstedt | 86.1562.050 | Streaking colonies onto agar plates |
| Inoculation spreader | Sarstedt | 86.1569.005 | Spreading of culture onto agar plates |
| Lysogeny broth (LB) broth, Lennox | Fisher | BP1427 | Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract) |
| Microfuge | Fisher | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples |
| Mini-centrifuge | Fisher | S67601B | Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes |
| Petri dishes | SPL Life Sciences | 10090 | For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm |
| Pipettes | Mandel | Various | Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Power supply | Biorad | 1645050 | PowerPac Basic power supply for electrophoresis |
| Primers | IDT | NA | PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet |
| Sucrose | BioBasic | SB0498 | For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii |
| Taq DNA polymerase | FroggaBio | T-500 | PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer |
| Thermal cycler | Biorad | 1861096 | Model T100 for PCR |
| Toothpicks | Fisher | S24559 | For patching colonies onto agar plates |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Agarose gel running buffer component |
| Ultrapure water | Millipore Sigma | ZLXLSD51040 | MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing |
| Wide range DNA marker | Biobasic | M103R-2 | Size determination of PCR products on an agarose gel |
| Wooden inoculating sticks | Fisher | 29-801-02 | Inoculating cultures with colonies from agar plates |
References
- Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017)
- Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
- Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380 (2020).
- Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
- Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
- Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
- Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
- Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
- Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
- Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288 (2021).
- Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
- Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
- Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373 (2021).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , (2021).
- Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
- Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110 (2016).
- Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
- Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
- Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
- Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).
- Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16 (2020).
