Caracterização de Sistemas de Efluxo Multidrogas em Acinetobacter baumannii Usando uma Cepa Bacteriana Deficiente em Efluxo e um Sistema de Expressão Gênica de Cópia Única
Summary
Descrevemos um procedimento fácil para a complementação cromossômica de cópia única de um gene de bomba de efluxo usando um sistema de expressão baseado em mini-Tn7 em uma cepa deficiente em efluxo projetada de Acinetobacter baumannii. Esta ferramenta genética precisa permite a expressão gênica controlada, o que é fundamental para a caracterização de bombas de efluxo em patógenos multirresistentes.
Abstract
Acinetobacter baumannii é reconhecido como um patógeno Gram-negativo desafiador devido à sua ampla resistência a antibióticos. É crucial compreender os mecanismos por trás dessa resistência para desenhar novas e eficazes opções terapêuticas. Infelizmente, nossa capacidade de investigar esses mecanismos em A. baumannii é prejudicada pela escassez de ferramentas adequadas de manipulação genética. Aqui, descrevemos métodos para utilizar um sistema cromossômico baseado em mini-Tn7 para obter expressão gênica de cópia única em uma cepa de A. baumannii que não possui mecanismos funcionais de efluxo do tipo RND. A inserção de cópia única e a expressão de bomba de efluxo induzível são bastante vantajosas, pois a presença de operons de efluxo de RND em plasmídeos de alto número de cópias é frequentemente mal tolerada pelas células bacterianas. Além disso, a incorporação de vetores de expressão recombinante de mini-Tn7 no cromossomo de um hospedeiro substituto de A. baumannii com sensibilidade aumentada ao efluxo ajuda a contornar a interferência de outras bombas de efluxo. Este sistema é valioso não apenas para investigar bombas de efluxo bacteriano não caracterizadas, mas também para avaliar a eficácia de potenciais inibidores direcionados a essas bombas.
Introduction
Acinetobacter baumannii é um patógeno prioritário da Organização Mundial da Saúde devido à sua resistência abrangente a todas as classes de antibióticos1. É um patógeno oportunista que afeta principalmente pessoas hospitalizadas, feridas ou imunocomprometidas. A. baumannii evade amplamente antibióticos através de bombas de efluxo, sendo a mais relevante a família de exportadores Resistance-Nodulation-Division (RND)2. Entender como essas bombas de efluxo funcionam mecanisticamente permitirá desenvolver opções terapêuticas direcionadas.
Uma maneira comum de distinguir especificamente os processos celulares é por meio da manipulação genética. No entanto, as ferramentas disponíveis para estudos genéticos de A. baumannii são limitadas e, para confundir ainda mais o desenho experimental, isolados clínicos frequentemente são resistentes aos antibióticos rotineiramente usados para seleção em manipulações genéticas3. Um segundo obstáculo encontrado ao estudar especificamente bombas de efluxo é que elas são estritamente reguladas – muitas vezes por fatores desconhecidos – tornando difícil isolar com precisão e atribuir função a uma única bomba4. Vendo essa necessidade de expandir a caixa de ferramentas de pesquisa, desenvolvemos um sistema de expressão induzível baseado em mini-Tn7, de inserção de cópia única, que incorpora um Flp recombinase target (FRT), que permite a remoção do marcador de seleção 5,6,7 (Figura 1). Criado primeiramente para Pseudomonas 8,9,10, este elegante sistema de clonagem e expressão foi usado para gerar complementos de bomba de efluxo de cópia única em uma cepa deficiente em bomba de efluxo RND de A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: doravante referida como A. baumannii AB258) que geramos11. Sendo capaz de estudar uma bomba de efluxo de cada vez e não sobrecarregar as células bacterianas com alta expressão de cópia (como geralmente visto com sistemas de expressão baseados em plasmídeos), pode-se aprender melhor sobre os aspectos fisiológicos críticos de cada bomba de efluxo com interferência mínima e complicações reduzidas.
Este artigo descreve como usar o sistema mini-Tn7 para complementar um gene excluído de interesse, a bomba de efluxo de RND adeIJK, no cromossomo de A. baumannii AB258 através de uma série de etapas não complicadas realizadas ao longo de 9 dias7. O primeiro conjunto de etapas reintroduz os genes deletados da bomba de efluxo clonados no plasmídeo de inserção baseado em mini-Tn7 (Figura 2A) no único sítio de inserção attTn7 a jusante do gene glmS bem conservado (Figura 3A). Esse processo é facilitado por um plasmídeo auxiliar não replicativo (Figura 2B) que codifica os genes de transposase necessários para a inserção impulsionada por Tn7. O segundo conjunto de etapas utiliza um plasmídeo de excisão (Figura 2C) para a remoção mediada pela recombinase de Flp do gene da gentamicina flanqueado por sítios de TAF (Figura 3B) para criar uma cepa não marcada. Embora esse sistema seja usado para elucidar os papéis essenciais e possíveis inibidores das bombas de efluxo de RND com relação à resistência a antibióticos, ele pode ser usado para investigar qualquer gene de interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora este procedimento para a inserção cromossômica de um sistema induzível de expressão gênica de cópia única em A. baumannii seja tecnicamente simples e não trabalhoso, existem alguns passos importantes que precisam ser enfatizados. Primeiro, a preparação das células competentes precisa ser feita em gelo, tanto quanto possível, pois as células se tornam frágeis durante a substituição do meio por água gelada. Idealmente, as etapas de centrifugação são realizadas a 4 °C, mas a centrifuga?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa de Descoberta do Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá para AK. Os esquemas utilizados nas figuras são criados com BioRender.com.
Materials
| 0.2 mL PCR tube | VWR | 20170-012 | For colony boil preparations and PCR reactions |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72-690-301 | General use |
| 13-mL culture tubes, Pyrex | Fisher | 14-957K | Liquid culture vessels |
| 6x DNA loading buffer | Froggabio | LD010 | Agarose gel electrophoresis sample loading dye |
| Acetic acid, glacial | Fisher | 351271-212 | Agarose gel running buffer component |
| Agar | Bioshop | AGR003 | Solid growth media |
| Agarose | BioBasic | D0012 | Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2% |
| Agarose gel electrophoresis unit | Fisher | 29-237-54 | Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products |
| Carbenicillin | Fisher | 50841231 | Selective media |
| Culture tube closures | Fisher | 13-684-138 | Stainless steel closure for 13-mL culture tubes |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set | Biobasic | DD0058 | PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP |
| Dry bath/block heater | Fisher | 88860023 | Isotemp digital dry bath for boil preparations |
| Electroporation cuvettes | VWR | 89047-208 | 2 mm electroporation cuvettes with round cap |
| Electroporator | Cole Parmer | 940000009 | 110 VAC, 60 Hz electroporator |
| Ethidium bromide | Fisher | BP102-1 | Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR | CA-EM4050 | Agarose gel running buffer component |
| Gentamicin | Biobasic | GB0217 | For the preparation of selective media |
| Glycerol | Fisher | G33 | Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer |
| Incubator (shaking) | New Brunswick Scientific | M1352-0000 | Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth |
| Incubator (static) | Fisher | 11-690-550D | Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth |
| Inoculation loop | Sarstedt | 86.1562.050 | Streaking colonies onto agar plates |
| Inoculation spreader | Sarstedt | 86.1569.005 | Spreading of culture onto agar plates |
| Lysogeny broth (LB) broth, Lennox | Fisher | BP1427 | Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract) |
| Microfuge | Fisher | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples |
| Mini-centrifuge | Fisher | S67601B | Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes |
| Petri dishes | SPL Life Sciences | 10090 | For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm |
| Pipettes | Mandel | Various | Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Power supply | Biorad | 1645050 | PowerPac Basic power supply for electrophoresis |
| Primers | IDT | NA | PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet |
| Sucrose | BioBasic | SB0498 | For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii |
| Taq DNA polymerase | FroggaBio | T-500 | PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer |
| Thermal cycler | Biorad | 1861096 | Model T100 for PCR |
| Toothpicks | Fisher | S24559 | For patching colonies onto agar plates |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Agarose gel running buffer component |
| Ultrapure water | Millipore Sigma | ZLXLSD51040 | MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing |
| Wide range DNA marker | Biobasic | M103R-2 | Size determination of PCR products on an agarose gel |
| Wooden inoculating sticks | Fisher | 29-801-02 | Inoculating cultures with colonies from agar plates |
References
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