Caractérisation des systèmes d’efflux multimédicamenteux chez Acinetobacter baumannii à l’aide d’une souche bactérienne déficiente en efflux et d’un système d’expression génique à copie unique

Acinetobacter baumannii est un agent pathogène prioritaire de l’Organisation mondiale de la santé en raison de sa résistance globale à toutes les classes d’antibiotiques¹. C’est un agent pathogène opportuniste qui touche principalement les personnes hospitalisées, blessées ou immunodéprimées. A. baumannii échappe en grande partie aux antibiotiques via des pompes à efflux, la plus pertinente étant la famille d’exportateurs Résistance-Nodulation-Division (RND)². Comprendre comment ces pompes d’efflux fonctionnent mécaniquement permettra de développer des options thérapeutiques ciblées.

Une façon courante de distinguer spécifiquement les processus cellulaires est la manipulation génétique. Cependant, les outils disponibles pour les études génétiques d’A. baumannii sont limités et, pour compliquer davantage la conception expérimentale, les isolats cliniques sont souvent résistants aux antibiotiques couramment utilisés pour la sélection dans les manipulations génétiques³. Un deuxième obstacle rencontré lors de l’étude spécifique des pompes d’efflux est qu’elles sont strictement réglementées – souvent par des facteurs inconnus – ce qui rend difficile l’isolement et l’attribution précis de la fonction à une seule pompe⁴. Voyant ce besoin d’élargir la boîte à outils de recherche, nous avons développé un système d’expression inductible à base de mini-Tn7, à insertion d’une seule copie, qui intègre une cassette de cible de recombinase Flp (FRT), qui permet de supprimer le marqueur de sélection ^5,6,7 (Figure 1). Créé à l’origine pour Pseudomonas ^8,9,10, cet élégant système de clonage et d’expression a été utilisé pour générer des compléments de pompe d’efflux à copie unique dans une souche déficiente en pompe d’efflux RND d’A. baumannii (ATCC 17978 ::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB : ci-après dénommée A. baumannii AB258) que nous avons générée¹¹. En étant capable d’étudier une pompe d’efflux à la fois et de ne pas submerger les cellules bactériennes avec une expression à forte copie (comme on le voit généralement avec les systèmes d’expression à base de plasmides), on peut mieux connaître les aspects physiologiques critiques de chaque pompe d’efflux avec un minimum d’interférence et des complications réduites.

Cet article décrit comment utiliser le système mini-Tn7 pour compléter un gène d’intérêt supprimé, RND efflux pump adeIJK, dans le chromosome d’A. baumannii AB258 par une série d’étapes simples effectuées sur une période de 9 jours⁷. La première série d’étapes réintroduit les gènes de la pompe d’efflux supprimés clonés dans le plasmide d’insertion à base de mini-Tn7 (Figure 2A) au site d’insertion unique attTn7 en aval du gène glmS bien conservé (Figure 3A). Ce processus est facilité par un plasmide auxiliaire non réplicatif (Figure 2B) qui code pour les gènes de transposase nécessaires à l’insertion de Tn7. La deuxième série d’étapes utilise un plasmide d’excision (figure 2C) pour l’élimination médiée par la recombinase Flp du gène de la gentamicine flanquée de sites FRT (figure 3B) pour créer une souche non marquée. Bien que ce système soit utilisé pour élucider les rôles essentiels et les inhibiteurs possibles des pompes d’efflux RND en ce qui concerne la résistance aux antibiotiques, il peut être utilisé pour étudier n’importe quel gène d’intérêt.