Caracterización de sistemas de eflujo de múltiples fármacos en Acinetobacter baumannii utilizando una cepa bacteriana deficiente en eflujo y un sistema de expresión génica de copia única
Summary
Describimos un procedimiento sencillo para la complementación cromosómica de una sola copia de un gen de bomba de eflujo utilizando un sistema de expresión basado en mini-Tn7 en una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en eflujo modificada. Esta precisa herramienta genética permite controlar la expresión génica, lo cual es clave para la caracterización de las bombas de eflujo en patógenos multirresistentes.
Abstract
Acinetobacter baumannii es reconocido como un patógeno gramnegativo desafiante debido a su resistencia generalizada a los antibióticos. Es crucial comprender los mecanismos detrás de esta resistencia para diseñar opciones terapéuticas nuevas y efectivas. Desafortunadamente, nuestra capacidad para investigar estos mecanismos en A. baumannii se ve obstaculizada por la escasez de herramientas adecuadas de manipulación genética. Aquí, describimos métodos para utilizar un sistema basado en mini-Tn7 cromosómico para lograr la expresión génica de una sola copia en una cepa de A. baumannii que carece de mecanismos funcionales de eflujo de tipo RND. La inserción de copia única y la expresión de la bomba de eflujo inducible son bastante ventajosas, ya que la presencia de operones de eflujo de RND en plásmidos de alto número de copias a menudo es mal tolerada por las células bacterianas. Además, la incorporación de vectores de expresión de mini-Tn7 recombinantes en el cromosoma de un huésped sustituto de A. baumannii con mayor sensibilidad al eflujo ayuda a evitar la interferencia de otras bombas de eflujo. Este sistema es valioso no solo para investigar bombas de eflujo bacteriano no caracterizadas, sino también para evaluar la eficacia de los inhibidores potenciales dirigidos a estas bombas.
Introduction
Acinetobacter baumannii es un patógeno prioritario de la Organización Mundial de la Salud debido a su amplia resistencia a todas las clases de antibióticos1. Es un patógeno oportunista que afecta principalmente a personas hospitalizadas, lesionadas o inmunodeprimidas. A. baumannii evade en gran medida los antibióticos a través de bombas de eflujo, siendo la más relevante la familia de exportadores Resistance-Nodulation-Division (RND)2. Comprender cómo funcionan mecánicamente estas bombas de eflujo permitirá desarrollar opciones terapéuticas específicas.
Una forma común en que los procesos celulares se pueden distinguir específicamente es a través de la manipulación genética. Sin embargo, las herramientas disponibles para los estudios genéticos de A. baumannii son limitadas y, para confundir aún más el diseño experimental, los aislados clínicos a menudo son resistentes a los antibióticos utilizados rutinariamente para la selección en las manipulaciones genéticas3. Un segundo obstáculo que se encuentra cuando se estudian específicamente las bombas de eflujo es que están estrictamente reguladas, a menudo por factores desconocidos, lo que dificulta aislar con precisión y atribuir la función a una sola bomba4. Al ver esta necesidad de ampliar la caja de herramientas de investigación, desarrollamos un sistema de expresión inducible basado en mini-Tn7, de inserción de una sola copia, que incorpora un casete de diana recombinasa (FRT) Flp, que permite la eliminación del marcador de selección 5,6,7 (Figura 1). Creado por primera vez para Pseudomonas 8,9,10, este elegante sistema de clonación y expresión se utilizó para generar complementos de bomba de eflujo de copia única en una cepa de A. baumannii deficiente en bomba de eflujo RND (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: en lo sucesivo denominada A. baumannii AB258) que generamos11. Al poder estudiar una bomba de eflujo a la vez y no abrumar a las células bacterianas con una alta expresión de copia (como generalmente se ve con los sistemas de expresión basados en plásmidos), se puede aprender mejor sobre los aspectos fisiológicos críticos de cada bomba de eflujo con una interferencia mínima y complicaciones reducidas.
Este artículo describe cómo utilizar el sistema mini-Tn7 para complementar un gen delecionado de interés, la bomba de eflujo de RND adeIJK, en el cromosoma de A. baumannii AB258 a través de una serie de pasos sin complicaciones realizados en el transcurso de 9 días7. El primer conjunto de pasos reintroduce los genes de la bomba de eflujo eliminados clonados en el plásmido de inserción basado en mini-Tn7 (Figura 2A) en el único sitio de inserción de Tn7att aguas abajo del gen glmS bien conservado (Figura 3A). Este proceso se ve facilitado por un plásmido auxiliar no replicativo (Figura 2B) que codifica los genes de la transposasa necesarios para la inserción impulsada por Tn7. El segundo conjunto de pasos utiliza un plásmido de escisión (Figura 2C) para la eliminación mediada por la recombinasa Flp del gen de la gentamicina flanqueada por sitios FRT (Figura 3B) para crear una cepa no marcada. Aunque este sistema se utiliza para dilucidar las funciones esenciales y los posibles inhibidores de las bombas de eflujo de RND con respecto a la resistencia a los antibióticos, se puede utilizar para investigar cualquier gen de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de que este procedimiento para la inserción cromosómica de un sistema de expresión génica inducible de una sola copia en A. baumannii es técnicamente sencillo y no requiere mucha mano de obra, hay algunos pasos importantes que deben enfatizarse. En primer lugar, la preparación de las células competentes debe realizarse en hielo tanto como sea posible, ya que las células se vuelven frágiles durante la sustitución de los medios por agua helada. Idealmente, los pasos de centrifugación se realizan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca Discovery Grant del Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá para AK. Los esquemas utilizados en las figuras se crean con BioRender.com.
Materials
| 0.2 mL PCR tube | VWR | 20170-012 | For colony boil preparations and PCR reactions |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72-690-301 | General use |
| 13-mL culture tubes, Pyrex | Fisher | 14-957K | Liquid culture vessels |
| 6x DNA loading buffer | Froggabio | LD010 | Agarose gel electrophoresis sample loading dye |
| Acetic acid, glacial | Fisher | 351271-212 | Agarose gel running buffer component |
| Agar | Bioshop | AGR003 | Solid growth media |
| Agarose | BioBasic | D0012 | Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2% |
| Agarose gel electrophoresis unit | Fisher | 29-237-54 | Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products |
| Carbenicillin | Fisher | 50841231 | Selective media |
| Culture tube closures | Fisher | 13-684-138 | Stainless steel closure for 13-mL culture tubes |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set | Biobasic | DD0058 | PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP |
| Dry bath/block heater | Fisher | 88860023 | Isotemp digital dry bath for boil preparations |
| Electroporation cuvettes | VWR | 89047-208 | 2 mm electroporation cuvettes with round cap |
| Electroporator | Cole Parmer | 940000009 | 110 VAC, 60 Hz electroporator |
| Ethidium bromide | Fisher | BP102-1 | Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR | CA-EM4050 | Agarose gel running buffer component |
| Gentamicin | Biobasic | GB0217 | For the preparation of selective media |
| Glycerol | Fisher | G33 | Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer |
| Incubator (shaking) | New Brunswick Scientific | M1352-0000 | Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth |
| Incubator (static) | Fisher | 11-690-550D | Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth |
| Inoculation loop | Sarstedt | 86.1562.050 | Streaking colonies onto agar plates |
| Inoculation spreader | Sarstedt | 86.1569.005 | Spreading of culture onto agar plates |
| Lysogeny broth (LB) broth, Lennox | Fisher | BP1427 | Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract) |
| Microfuge | Fisher | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples |
| Mini-centrifuge | Fisher | S67601B | Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes |
| Petri dishes | SPL Life Sciences | 10090 | For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm |
| Pipettes | Mandel | Various | Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Power supply | Biorad | 1645050 | PowerPac Basic power supply for electrophoresis |
| Primers | IDT | NA | PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet |
| Sucrose | BioBasic | SB0498 | For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii |
| Taq DNA polymerase | FroggaBio | T-500 | PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer |
| Thermal cycler | Biorad | 1861096 | Model T100 for PCR |
| Toothpicks | Fisher | S24559 | For patching colonies onto agar plates |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Agarose gel running buffer component |
| Ultrapure water | Millipore Sigma | ZLXLSD51040 | MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing |
| Wide range DNA marker | Biobasic | M103R-2 | Size determination of PCR products on an agarose gel |
| Wooden inoculating sticks | Fisher | 29-801-02 | Inoculating cultures with colonies from agar plates |
References
- Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017)
- Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
- Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380 (2020).
- Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
- Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
- Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
- Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
- Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
- Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
- Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288 (2021).
- Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
- Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
- Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373 (2021).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , (2021).
- Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
- Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110 (2016).
- Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
- Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
- Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
- Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).
- Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16 (2020).
